Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 7
1.1. Бактериоцины - природные консерванты 7
1.2. Определение и классификация бактерицинов 9
1.3. Механизмы синтеза PI действия бактериоцинов 12
1.4. Факторы, влияющие на синтез бактериоцинов 15
1.5. Потенциал педиоцинов в биоконсервировании 18
1.6. Генетические детерминанты синтеза педиоцинов 21
1.7. Иммобилизация микробных клеток 25
Заключение по литературному обзору. Цель и задачи исследования 31
ГЛАВА 2. Методика постановки эксперимента и методы исследований 36
2.1. Схема постановки эксперимента. Характеристика объектов исследования 36
2.2. Методы исследований 39
2.2.1.Определение антагонистической активности методом перпендикулярных штрихов 38
2.2.2. Определение продуцентов бактериоцинов экспресс-методом с нейтрализацией молочной кислоты 40
2.2.3. Выделение плазмиды из грамположительных микроорганизмов 43
2.2.4. Элиминация плазмиды из микроорганизмов 44
2.2.5. Микрокапсулирование микробных клеток 45
2.2.6. Просвечивающая электронная микроскопия 46
2.2.7. Определение белка на полуавтоматическом приборе Кьельтек 46
2.2.8. Определение массовой доли влаги 48
2.2.9. Определение массовой доли жира 48
2.2.10. Определение содержания золы 49
2.2.11. Определение ВСС методом прессования 49
2.2.12. Определение величины рН 50
2.2.13. Определение хлорида натрия 50
2.2.14. Определение нитрита натрия с применением реактива Грисса 51
2.2.15. Определение интенсивности и устойчивости окраски колбасных изделий 52
2.2.16. Определение степени окисления жира по перекисному числу 53
2.2.17. Определение кислотного числа 54
2.2.18. Определение окислительных изменений с 2-тиобарбитуровой кислотой 55
2.2.19. Определение предельного напряжения сдвига методом пенетрации 55
2.2.20. Оценка органолептических показателей 56
2.2.21. Бактериологический анализ 57
Определение общего количества микроорганизмов в 1 г продукта 57
Определение бактерий группы кишечных палочек в 1 г продукта 57
Определение бактерий рода Salmonella " 58
Определение протея 58
Определение коагулазоположителъных стафилококков 58
Определение сулъфитредуцирующих клостридий 59
Определение бактерий вида Listeria monocytogenes 59
2.2.22. Определение молочнокислых микроорганизмов 59
2.2.23. Определение дрожжей и плесневых грибов 60
2.2.24. Статистическая обработка экспериментальных данных 60
ГЛАВА 3. Исследование антагонистических свойств молочнокислых микроорганизмов 61
3.1. Скрининг штаммов-продуцентов бактериоцинов 61
3.2. Исследование антагонизма среди молочнокислых микроорганизмов 63
3.3. Определение локализации генетических детерминантов синтеза педиоцинов
ГЛАВА 4. Повышение термоустойчивости штаммов-продуцентов педиоцинов микрокапсулированием 69
4.1. Микрокапсулирование штаммов-продуцентов педиоцинов 69
4.2. Исследование термоустойчивости иммобилизованных бактериоцин синтезирующих штаммов на модельных фаршевых системах 77
ГЛАВА 5. Обоснование эффективности использования биоконсерванта в производстве термически обработанных мясных продуктов 82
5.1. Влияние биоконсерванта «Витасфер» на срок годности полукопченой колбасы 83
5.2. Исследование эффективности биоконсерванта в производстве вареной колбасы 91
Выводы 96
Список литературы 98
Приложения 109
- Механизмы синтеза PI действия бактериоцинов
- Определение продуцентов бактериоцинов экспресс-методом с нейтрализацией молочной кислоты
- Исследование антагонизма среди молочнокислых микроорганизмов
- Исследование термоустойчивости иммобилизованных бактериоцин синтезирующих штаммов на модельных фаршевых системах
Введение к работе
В мясной промышленности, по-прежнему, одной из основных задач остается обеспечение безопасности сырья и готовых продуктов и продление их сроков годности. Эффективное ингибирование санитарно-показательной и патогенной микрофлоры при производстве мясопродуктов осуществляется за счет внесения стартовых культур. В процессе своей жизнедеятельности они синтезируют специфические метаболиты: молочную кислоту, диацетил, а также бактериоцины, подавляющие при прямом антагонизме нежелательную микрофлору.
Биоконсервация, основанная на антагонизме микроорганизмов бактериоцинами, - перспективный подход сохранения продуктов питания. По технологическим свойствам наибольший интерес для мясной промышленности представляют бактерии рода Pediococcus, продуцирующие бактериоцин педиоцин, активный против санитарно-показательной и патогенной микрофлоры, в т.ч. против Listeria monocytogenes, пищевого патогена, не чувствительного к консервирующему действию нитрита натрия.
Применение стартовых культур в мясной промышленности ограничивается производством ферментированных мясопродуктов, так как микроорганизмы, входящие в состав бактериальных препаратов, в большинстве своем являются мезофильными. В ходе тепловой обработки при достижении температуры 70±2 С в центре продукта наблюдается практически полное прекращение роста мезофильной микрофлоры и частично термофильных и спорообразующих бактерий в вегетативной форме. Качество готового продукта зависит от начальной обсемененности сырья и эффективности вносимых консервантов. Иммобилизация стартовых культур позволяет сохранить клетки живыми в продукте при термообработке. Снижение скорости роста бактериальных клеток с помощью их иммобилизации способствует увеличению секреции вторичных метаболитов, в том числе бактериоцинов. Кроме этого, иммобилизация позволяет повысить стабильность плазмид, кодирующих важные технологические характеристики, а также способность клетки синтезировать бактериоцины.
Данная работа направлена на обеспечение высокого качества и безопасности мясных продуктов и продления их сроков годности за счет использования биотехнологического потенциала стартовых культур.
Биоконсерванты на основе иммобилизованных клеток продуцентов бактериоцинов могут использоваться в пищевой промышленности в качестве альтернативы искусственным консервантам и является частью барьерных технологий.
Механизмы синтеза PI действия бактериоцинов
Бактериоцины - антибиотические вещества белково-пептидной природы бактериального происхождения, подавляющие рост и размножение родственных видов или штаммов, или имеющие более широкий спектр антибактериального действия [14, 33, 1]. Обычно бактериоцины разделяют на три или четыре группы по их молекулярному весу, структуре, чувствительности к теплу.
Бактериоцины класса I названы лантибиотиками, потому как имеют в своем составе необычные аминокислоты такие, как лантионин, (3-метиллантионин, дегидробутирин и дегидроаланин. Класс I подразделяется на класс 1а и класс lb. Класс 1а, который включает низин, состоит из катионоактивных и гидрофобных пептидов с молекулярным весом не более 5 кДа, образующих поры в цитогогазматических мембранах и имеющих гибкую структуру по сравнению с классом lb. Класс lb представлен шаровидными (компактная свернутая молекулярная структура) пептидами, не имеющими отрицательного заряда или заряда вообще.
Класс II - нелантибиотики, модифицированные термостабильные пептиды с молекулярным весом не более 10 кДа. Согласно общепринятой классификации, класс Па включает педиоцин подобные пептиды, активные против Listeria, состоящие из двух модулей: гидрофильного консервативного N-концевого (Tyr-Gly-Asn-Gly-Val и двумя цистеинами, формирующими мостики S-S) и более вариабельного гидрофобного С-концевого. Бактериоцины, состоящие из двух различных пептидов, необходимых для их активности, включают в класс ПЬ. Класс Не — тиолактивированные пептиды.
Четвертый класс - гетерогенные протеины, имеющие в своем составе небелковую часть (углевод или липид), необходимую для биологической активности, был предложен Klaenhammer Т. в 1993 г. Однако есть основание полагать, что этот тип бактериоцинов из-за катионоактивных и гидрофобных свойств при грубой очистке образует комплексы с другими макромолекулами, как показано на примере плантарицина S [33, 97, 65].
Способность продуцировать бактериоцин и устойчивость к гомологичному бактериоцину (иммунитет) - это основные признаки, отличающие бактериоциногенные микроорганизмы от небактериоциногенных [14,26,84].
Бактериоциногения - биологический феномен, широко распространенный в природе и связанный с антагонизмом у бактерий. Конкурируя за питательные вещества, бактерии секретируют посредством рибосом полипептиды (бактериоцины), которые избирательно уничтожают микроорганизмы-конкуренты.
Генетические детерминанты многих бактериоцинов идентифицированы. У плантарицина и сакацина 674 эти гены расположены на хромосоме, у низина, синтезируемого L. lactis, находятся на транспозонах. Установлено расположение структурного гена, вовлеченного в синтез бактериоцинов. Обычно структурный ген входит в состав оперона, который непосредственно вовлечен в процессинг и транспорт бактериоцина через прокариотическую цитоплазматическую мембрану клетки. Молекула бактериоцина транспортируется через клеточную мембрану как неактивный пептид, содержащий лидирующий пропептид с N- и С- терминальными концами. Часть лидирующего пептида удаляется определенными пептидазами с последующей его активацией, сопровождаемой секрецией активной молекулы в окружающую среду. Однако некоторые бактериоцины при рН 5,0 и выше остаются адсорбированными на поверхности клеток-продуцентов [95]. Задача состоит в том, чтобы оптимизировать продуцирование бактериоцинов бактериями, повысить активность и стабильность этих соединений, направленно получать бактериоцины с заданными свойствами [14].
Признавая, что бактериоцины отличаются от антибиотиков, Hurst и коллеги (1981) предложили термин «биологические консерванты продуктов питания»; с тех пор бактериоцины, в отличие от антибиотиков, не используются для лекарственных целей (табл. 1.1).
Хотя большинство бактериоцинов сегодня охарактеризовано, исчерпывающей информации все еще нет. Объединенный информационный ресурс в виде базы данных принес бы большую пользу для использования этих биоактивных молекул в контексте увеличивающейся резистентности к антибиотикам [56].
На сегодняшний день разработана новая экспресс-система обнаружения и идентификации бактериоцинов, основанная на жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии. С ее помощью обнаружили и идентифицировали бактериоцины типа низина и лактицина 481 в 25 мкл супернатанта, определили их молекулярный вес в течение 40 мин. Система точно определила три варианта низина (A, Z, Q), хотя они имеют подобные структуры и молекулярные веса. Эта система эффективна не только для обнаружения известных бактериоцинов, но также она способна обнаружить и определить молекулярные веса новых бактериоцинов. Следовательно, она может ускорить открытие новых бактериоцинов [101].
Мишенью для многих низкомолекулярных катионных пептидов (класс бактериоцинов 1а - лантибиотики, включая низин) является цитоплазматическая мембрана чувствительных клеток. Катионные пептиды формируют поры в цитоплазматической мембране, разрушая протондвижущую силу (ПДС) клетки-мишени. ПДС, состоящая из химического компонента (градиент рН - АрН) и электрического компонента (мембранный потенциал Д\]/), осуществляет синтез АТФ, аккумулирование ионов и других метаболитов через транспортную систему в мембране, управляемую также протондвижущей силой (рис. 1.1).
Определение продуцентов бактериоцинов экспресс-методом с нейтрализацией молочной кислоты
Гены, кодирующие продуцирование бактериоцина, могут быть расположены на хромосоме, плазмиде или транспозоне. Как правило, микроорганизмы обладают генами, кодирующими структурный пептид, белки, которые помогают в процессинге к активной форме, белки, которые помогают в транспортировке бактериоцина сквозь мембрану, регулирующие белки и белки, которые придают иммунитет хозяину-продуценту [42, 69].
Устойчивость клетки к собственному бактериоцину явление, которое отличает бактериоцины от антибиотиков. Гены, кодирующие «белки устойчивости», находятся в генетической близости со структурным геном и геном процессинга. Обычно структурный ген и ген устойчивости входят в состав одного оперона и часто находятся рядом друг с другом [33, 78, 96].
При введении штаммов Lactobacillus plantarum и Pediococcus pentosaceus FBB61 в огуречный рассол, Etchells J. и др. наблюдали подавление роста L. plantarum. Объяснить ингибирование L. plantarum сильным кислотообразованием педиококка не представлялось возможным, поскольку он кислотоустойчив. В 1979 г была охарактеризована химическая природа ингибирующего агента, синтезированного P. pentosaceus FBB61, как бактериоциноподобное вещество. Позже в 1985 г Daescheli М. и Klaenhammer Т. методом излечивания от плазмид доказали, что производство бактериоцина штаммами P. pentosaceus FBB61 и L7230 и их иммунитет к нему связаны с плазмидой размером 13,6 МДа (22 тпн) (pMD136) [35].
В университете Северной Каролины изучили ингибирующую активность штамма P. acidilactici РАС 1.0, продуцирующего педиоцин РА-1, и производного от него штамма, полученного излечиванием от плазмид, по отношению к L. monocytogenes в сухих ферментированных колбасах. Отсутствие у штамма-мутанта способности подавлять рост L. monocytogenes объясняется потерей плазмиды размером 9,4 тпн (pSRQll), отвечающей за бактериоцин синтезирующую активность [47, 52].
Исследованы пять родительских штаммов Pediococcus на содержание 1000 пн = 617500 Да плазмид. Каждый штамм содержал от трех до шести резидентных плазмид размерами от 4,5 до 39,5 МДа. Бактериоцин подобное вещество, синтезируемое Pediococciis cerevisiae FBB63, было экспериментально связано с плазмидой размером 10,5 МДа (17 тпн) после излечивания штамма от плазмид новобиоцином [53].
Пять бактериоциногенных штаммов (347, Х13, Z102, А172 и Р20), выделенных из ферментированных колбас (Испания), были идентифицированы как Pediococciis acidilactici. Результаты исследования этих штаммов показали, что все из них содержат оперон, кодирующий синтез педиоцина РА-1 и расположенный на плазмиде размером 9,4 тпн (5,8 МДа) [90,28].
Исследуя подавление роста Listeria monocytogenes в ферментированных летних колбасах педиококковыми стартовыми культурами, Luchansky J. и др. изучили и сравнили плазмидные профили у продуцирующих педиоцин (Ped+) и не продуцирующих педиоцин (РесГ) штаммов вида Pediococcus acidilactici. Результаты выделения плазмидной ДНК из стартовых культур РесҐ (штамм JBL1095) и РесГ (штамм JBL1350), а также трех других штаммов Pediococcus acidilactici (РАС 1.0, Р02 и LB42) показали наличие плазмид у 4 штаммов из 5. Кроме одной крупной плазмиды ( 30 тпн), штаммы Pediococcus acidilactici JBL1095, РАСІ.0 и Р02 содержали по одной плазмиде размером 9,4 тпн. У РесГ штамма Pediococcus acidilactici LB42 плазмидные ДНК обнаружены не были. Эти результаты доказывают, что штаммы Pediococcus acidilactici JBL1095, РАС 1.0 и Р02, синтезирующие бактериоцин, обладают подобными плазмидными профилями и являются генетически взаимосвязанными [71, 31, 98].
Osmanagaoglu О. и др. исследовали штамм Pediococcus acidilactici F, образующий бактериоцин, плазмидная ДНК которого была выделена лизоцим-мутанолизиновым методом и очищена центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия - бромида этидия (CsCl-EtBr). Электрофорез в агарозном геле показал, что активность бактериоцина закодирована на плазмиде размером примерно 9,1 тпн (5,6 МДа). Полученные данные подтверждают результаты предыдущих исследований, касающихся связи педиоцина АсН с плазмидой pSMB74 штамма P. acidilactici Н (Ray Р., 1992) и педиоцина РА-1 с плазмидой pSRQl 1 штамма P. acidilactici РАС 1.0 (Marugg J., 1992) [72, 75, 85].
Pediococcas acidilactici SJ-1, выделенный из естественно ферментированных мясных продуктов, продуцирует антибактериальное вещество, активное против Lactobacillus spp., Clostridium perfringens и Listeria monocytogenes. Бактериоцин, образуемый этим штаммом, был назван педиоцином SJ-1. Педиоцин продуцирующий штамм имеет три плазмиды размерами 4,6, 23,5 и 45,7 МДа. Было доказано, что синтез бактериоцина кодируется плазмидой размером 4,6 МДа (7,5 тпн). Однако непродуцирующие бактериоцин варианты штамма Pediococcus acidilactici SJ-1, полученные излечиванием от плазмиды акрифлавином и действием высоких температур, сохранили устойчивость к педиоцину SJ-1. Из этого следует, что иммунитет к педиоцину SJ-1 не связан с плазмидой размером 4,6 МДа [94, 32, 88].
Исследование штамма Pediococcus pentosaceus Pepl, выделенного из турецкой упакованной под вакуумом колбасы, выявило, что он продуцирует бактериоцин из семейства антилистериальных педиоцинов молекулярным весом 5100 Да, названный педиоцином Р. Излечивание от плазмид показало, что генетические детерминанты синтеза и иммунитета к бактериоцину связаны с плазмидой pHDl.O размером 9,0 МДа (14,6 тпн). Электропорация выделенной и очищенной плазмиды pHDl.O в излеченный от этой плазмиды штамм P. pentosaceus Pepl позволила ему снова синтезировать педиоцин Р [61, 85].
Ученые университета Вайоминга, США, исследовали расположение и последовательность генов, ответственных за продуцирование педиоцина АсН в Pediococcus parvulus АТ077, выделенного из овощей, Lactobacillus plantarum WHE92, выделенного из сыра Мюнстер, и лактозо ферментирующего Pediococcus pentosaceus S34 из молока буйволов. Было установлено, что все четыре структурных гена, необходимые для производства бактериоцина, находятся на плазмидах, обозначенных рАТ077 у P. parvulus АТ077, pS34 у Р.
Исследование антагонизма среди молочнокислых микроорганизмов
Продление сроков годности и обеспечение безопасности мясных продуктов, по-прежнему, остаются основополагающими задачами мясной промышленности. Одним из возможных путей решения этих задач является строгое соблюдение принципов НАССР в производстве, в т.ч. использование барьерных технологий. Наряду с этим особое внимание следует уделить новым методам консервирования: газовой упаковке, биоконсервированию, обработке ультравысоким давлением.
Одно из важных свойств стартовых и защитных культур - их способность синтезировать антимикробные вещества, бактериоцины. В настоящее время накоплен значительный опыт эффективного применения бактерициногенных молочнокислых микроорганизмов в производстве пищевых продуктов. Интерес к бактериоцинам существенно вырос из-за их потенциала увеличивать срок годности продуктов питания в качестве альтернативы химическим консервантам за счет ингибирования роста санитарно-показательной и патогенной микрофлоры. Для использования в пищевой промышленности наиболее интересен Па класс бактериоцинов (педиоцины), ингибирующих рост грамположительных бактерий порчи и патогенов типа Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.
Главным фактором, ограничивающим использование бактериоцинов в промышленном масштабе, является их низкий синтез в течение производства пищевых продуктов. Задача заключается в том, чтобы повысить продуцирование бактериоцинов бактериями, увеличить активность и стабильность этих соединений.
Данные относительно технологии иммобилизованных клеток свидетельствуют о том, что одним из возможных способов защиты клеток молочнокислых бактерий от неблагоприятных факторов внешней среды, повышения стабильности внехромосомных носителей информации - плазмид, кодирующих важные технологические характеристики (сбраживание углеводов, синтез бактериоцинов), стимуляции производства и секреции вторичных метаболитов в процессе изготовления мясных продуктов может стать микрокапсулирование.
В связи с вышесказанным целью работы является разработка термоустойчивого биоконсерванта на основе бактериоцин синтезирующих стартовых культур для продления сроков годности мясных продуктов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: провести скрининг штаммов-продуцентов бактериоцинов среди молочнокислых микроорганизмов различных таксонов из коллекции МГУПБ; определить локализацию генетических детерминантов наиболее конкурентоспособных штаммов-продуцентов бактериоцинов, относящихся к видам P. pentosaceus и P. acidilactici; повысить устойчивость выбранных штаммов к тепловой обработке и замораживанию микрокапсулированием; на модельных фаршевых системах определить эффективность биоконсерванта; оценить влияние биоконсерванта на срок годности в технологии мясных продуктов на примере полукопченой и вареной колбас; разработать технологию получения биоконсерванта и проект технической документации на препарат, провести апробацию в промышленных условиях. проведен скрининг микроорганизмов различных таксонов конкурентоспособных штаммов-продуцентов бактериоцинов из коллекции МГУПБ; определены штаммы, подавляющие санитарно-показательную микрофлору; выявлен бактериоциногенный штамм Lactobacillus plantarum 7К, подавляющий штаммы гомологичного вида; установлена локализация генетических детерминантов синтеза бактериоцинов у штаммов Pediococcus acidilactici 27, 38 и Pediococcus pentosaceus 23, 28, 55. У штаммов P. acidilactici 27 и 38 было найдено по одной плазмиде размером 11 тпн, у штаммов P. pentosaceus 23, 28, 55 плазмид обнаружено не было. Элиминацией плазмид установлено, что гены, ответственные за синтез бактериоцинов в случае штаммов P. pentosaceus 23, 28, 55, расположены на хромосоме. подобраны параметры и условия микрокапсулирования P. acidilactici 27 и 38, которое осуществлялось методом вытеснения смеси, состоящей из суспензии клеток в физиологическом растворе концентрацией 10 lg КОЕ/мл и 1,5%-ного альгината натрия в отношении 1 : 5 (об/об) в 0,1 М раствор кросс-агента СаСЬ с применением монодисперсных технологий; создана статистическая модель процесса микрокапсулирования, уравнение множественной регрессии которой позволяет, в зависимости от концентрации альгината натрия и микробных клеток, устанавливать диаметр микрокапсул; методом просвечивающей электронной микроскопии установлено, что термическая обработка микрокапсулированных штаммов не изменяет морфологию клеток, следовательно, не снижает общую метаболическую активность, характерную только для целостной структуры клетки. Практическая значимость микрокапсулированием в альгинат натрия, в результате которого после инкубирования иммобилизованных штаммов при 72 С в течение 60 мин остается 57% жизнеспособных клеток; установлено, что микрокапсулированные клетки штаммов P. acidilactici 27 и 38 сохраняют свою гликолитическую активность при низких температурах (минус 18 С) не менее 6 месяцев. на основе микрокапсулированных клеток штаммов-продуцентов бактериоцинов разработан биоконсервант «Витасфер» для производства термически обработанных мясных изделий и проект технической документации на препарат; определена рациональная концентрация введения в мясное сырье биоконсерванта, составляющая 9 lg КОЕ/г; проведены исследования физико-химических, микробиологических, органолептических показателей и исследована динамика окислительных и гидролитических изменений опытных образцов вареной и полукопченой колбас с использованием биоконсерванта «Витасфер». Установлено, что срок годности изделий увеличивается по сравнению с контролем в 2,3 и 1,2 раза для вареной и полукопченой колбасы соответственно; проведена опытно-промышленная выработка биоконсерванта «Витасфер» в условиях «Центра высоких технологий» ГОУ ВПО «Московский энергетический институт (Технический университет)» и промышленная выработка полукопченой колбасы с использованием биоконсерванта «Витасфер» в условиях «Балаковский мясной двор» (ИП). Новизна решений защищена патентами, справками о депонировании стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика (Приложения А, Б). Практическая значимость работы подтверждена соответствующими документами.
Исследование термоустойчивости иммобилизованных бактериоцин синтезирующих штаммов на модельных фаршевых системах
Из объединенной пробы каждого образца в стерильную посуду берут навеску массой 20 г с точностью ±0,1 г. Навеску 20 г продукта растирают в стерильной фарфоровой ступке с 2-3 г стерильного песка, постепенно приливая 80 см3 раствора стерильной пептонной воды массовой долей 0,1% или физиологического раствора. 1 см приготовленной взвеси содержит 0,2 г продукта.
Для определения общего количества микроорганизмов микропипеткой берут 0,1 см3 взвеси из верхнего слоя жидкости, выливают на середину стерильной чашки Петри и заливают 12—15 см остуженного мясо-пептонного агара 45-50 С, равномерно распределяя его по всей поверхности. Чашку помещают в термостат и спустя 48 ч подсчитывают общее количество колоний на поверхности среды и в глубине.
Из каждой пробы должно быть сделано не менее двух посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При этом на одной чашке Петри проводят посев 0,1 г, а на другой - 0,01 г продукта. За окончательный результат определения количества бактерий в 1 г анализируемого продукта принимают среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек разной массы продукта. В пробирки, содержащие по 5 см3 среды КОДА, вносят стерильной пипеткой вместимостью 5-Ю см3 с широким концом по 5 см3 испытуемой взвеси. Для анализа можно также использовать среду Кесслера 10 см . Пробирки помещают в термостат температурой 37±0,5 С на 18-20 ч. При росте бактерий группы кишечных палочек на среде Кесслера в поплавке образуется газ. Для окончательного заключения о наличии в продукте бактерий группы кишечных палочек проводят высев со среды Кесслера (забродившие пробирки) в чашки Петри со средой Эндо. Чашки Петри помещают в термостат температурой 37 С на 18-20 ч. На среде Эндо бактерии группы кишечных палочек образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или розово-красные без блеска. Из подозреваемых колоний готовят мазки, которые окрашивают по Граму. Навеску продукта массой 25 г, взятую из объединенной пробы, вносят во флакон Сокслета, содержащий 100 см среды обогащения (Мюллера, Кауфмана). Жидкость во флаконе должна подняться до отметки 125 см . Флаконы тщательно встряхивают и помещают в термостат температурой 37 С. Через 16-24 ч после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли или пастеровской пипетки проводят высев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо. Чашки с посевами помещают в термостат температурой 37 С и просматривают через 16-48 ч. На среде Эндо бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные или с розовым оттенком колонии. Для определения присутствия протея вносят 0,1 см3 взвеси в конденсационную воду скошенного мясо-пептонного агара (по Шукевичу), термостатируют 18-24 ч и изучают полученную культуру. Пробирки помещают в термостат температурой 37 С строго вертикально. Через 18-24 ч посевы просматривают. Обращают внимание на образование ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком; на скошенном мясо-пептонном агаре культура поднимается из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды. Взвесь объемом 0,2 см наносят на поверхность агара и равномерно растирают по всей поверхности агаровой среды. Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 С и в течение 24 ч выдерживают при комнатной температуре. На поверхности питательной среды колонии стафилококка имеют вид плоских или слегка выпуклых блестящих колоний с ровным краем. Из подозрительных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму. При наличии стафилококков в препарате грамположительные мелкие кокки располагаются в виде неправильных гроздьев. Анализируемую взвесь объемом 1 см3 стерильной пипеткой вносят в пробирку с 9 см жидкой сульфит-циклосериновой среды (среды Вильсона-Блера), затем проводят последовательные пересевы на аналогичные объемы среды, в результате чего получают возрастающие десятикратные разведения суспензии. Инкубируют в течение 8-12 ч при 46 С. При наличии роста сульфитредуцирующих клостридий фиксируют почернение среды. Определение бактерий вида Listeria monocytogenes Подготовленную навеску исследуемого продукта (гомогената) в количестве 25 г вносят в селективную среду для первичного обогащения в количестве 225 см3 (бульон Фрейзера и др.).
Посевы термостатируют при 37 С в течение 24±2 ч. При росте листерий на средах предобогащения, содержащих эскулин и цитрат железа аммонийного, наблюдается почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета. После термостатирования продукта в среде для первичного обогащения 0,1 см суспензии пересевают в 10 см жидкой среды для вторичного обогащения. Посевы термостатируют при температуре 37 С в течение 48 ч. В средах с эскулином отмечают почернение как признак возможного присутствия бактерий рода Listeria.
