Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1. Ингибирование рибонуклеазной активности при проведении экспериментальных работ с рибонуклеиновыми кислотами 8
2.2. Ингибирование рибонуклеазной активности с помощью сорбции РНКаз 9
2.3. Инактивация рибонуклеаз протеазами и химическими агентами 13
2.4. Внутриклеточные ингибиторы рибонуклеаз 15
2.4.1. Ингибиторы РНКаз из прокариотических клеток 15
2,4.2 Ингибиторы РНКаз из опухолевых клеток 15 2,4.3.Свойства ингибиторов рибонуклеаз из
клеток тканей эукариотов 16
2.5. Методы выделения белковых ингибиторов рибонуклеаз и способы определения их активности 19
2.6. Применение белковых ингибиторов рибонуклеаз в молекулярно-биологических исследованиях 5
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 31
3.1. Материалыї и методы исследований 31
3,1.1. Сырье, реактивы, материалы и буферные растворы 31
3.1.2.Подготовка исходного материалы для выделения плацентарного ингибитора и оценка качества 33
3.2. Результаты и их обсувдение 37
3.2.1.0пределение. активности ингибиторов РНКаз 37
3.2.2.Сравнительное изучение лабораторных методов выделения ингибитора РНКаз
из плаценты человека и оценка путей
их усовершенствования 38
3.2.3 Разработка опытно-промышленной технологии ( "производственной методики")
получения ингибитора РНКаз из плаценты человека 53
3.2.4 «Поиск ингибиторов РНКаз в тканях,инфицированных РНК-содержащими вирусами 62
3.2.5. Выделение ингибитора РНКаз из печени цыплят, больных вирусом птичьего
миелобластоза 66
3.2.6.Сравнительная оценка физико-химических и биологических свойств ингибито
ров РНКаз из плаценты человека и из печени цыплят, больных острым миелобластозом 84
3.2.7. Использованне плацентарного ингибитора РНКаз в молекулярно-биологических
экспериментах 88
4, ВЫВОДЫ 95
5, СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 97
6, ПРИЛОЖНИЯ 108
- Ингибирование рибонуклеазной активности при проведении экспериментальных работ с рибонуклеиновыми кислотами
- Ингибирование рибонуклеазной активности с помощью сорбции РНКаз
- Сырье, реактивы, материалы и буферные растворы
Введение к работе
Актуальность темы. Ферментативный синтез двухцепочечной кДНК на поли ( А )+ - мРНК и встраивание этой ДНК в бактериальные плазмиды стал основным методом молекулярной биологии эукариот. Одним из главных моментов этого метода является сохранение натив-ной структуры мРНК, как в процессе ее выделения, так и при синтезе на ней кДНК. Основной задачей исследователей, занимающихся получением полноразмерных препаратов эукариотических мРНК, является сведение к минимуму рибонуклеазной активности на начальных стадиях выделения. Подавление возможной рибонуклеазной активности важно при обратной транскрипции, а также при синтезе белка в бесклеточной системе. Ингибирование РНКаз необходимо при выделении нативных полисом.
В настоящее время для снижения рибонуклеазной активности при работах с FHK используют различные типы ингибиторов РНКаз,но наиболее удобными являютея ингибиторы белковой природы,например, из плаценты человека. К достоинствам белковых ингибиторов следует отнести их высокую специфичность, практически отсутствие влияния на протекание биохимических реакций и легкость удаления из реакционной смеси после реакции. В настоящее время такие фирмы, как BRL, Enzo Biochem. Inc., P-S Biochemicals, Раевеї, Amersham и другие выпускают коммерческий препарат RNasin -высокоспецифич ный белковый ингибитор РНКаз, выделяемый из плаценты человека.
В нашей стране промышленно препараты ингибиторов рибонуклеаз не производятся. Лишь незначительная часть потребности удовлетворяется поставками из-за рубежа. Некоторое количество плацентарного ингибитора получают в лабораториях отдельных научно-исследовательских учреждений. Однако, объем получаемых препаратов недостаточен, качество значительно варьирует. Известные лабораторные методы / I - 4 / расчитаны на получение ингибитора в небольших количест -6 вах, в них отсутствуют технологические параметры выделения, полные характеристики качества получаемых препаратов. В связи с этим известные методы не пригодны для использования в условиях производства .
Необходимо отметить, что свойства ингибитора РНКаз из пла, центы человека не позволяют подавить активность всего спектра природных рибонуклеаз / І /, в частности, он не подавляет активность РНКаз, оптимум действия которых лежит в кислой области рН. Например, РНКаз Tj и Т / 5 /, оптимум активности которых находится в интервале рН от 5,0 до 5,5. Эти РНКазы применяются в мо-лекулярно-биологических экспериментах по изучению первичной структуры ДНК и скорости элонгации природных РНК. В настоящее время в СССР и за рубежом белковые ингибиторы кислых РНКаз не производятся. Цель и задачи, исследования.Целью данной работы явилась разработка промышленной технологии получения ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека, поиск ингибиторов кислых РНКаз, разработка лабораторного метода их выделения и очистки, изучение некоторых физико-химических свойств выделенных ингибиторов. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи: I) оптимизировать методики очистки и анализа плацентарного ингибитора РНКаз; 2)разработать на их основе лабораторную, а затем опытно-промышленную технологию получения ингибитора; 3) провести поиск ингибиторов кислых РНКаз, в частности, в печени цыплят, больных острым миелобластозом; 4) разработать методику очистки выделенного нового ингибитора, и на этой основе разработать лабораторный метод его получения в комплексе с РНК-зависимой ДНК-поли-меразой; 5)изучить некоторые физико-химические свойства выделенного нового ингибитора:оптимальные условия реакции ингибирования РНКаз, определить его молекулярную массу и изоэлектрическую точку. Научная новизна тэаботы. Впервые показано, что в печени цыплят,
-7-больных острым миелобластозом, синтезируется белковый ингибитор кислых РНКаз. Разработан лабораторный метод его выделения.Изучены некоторые физико-химические свойства нового ингибитора.Разработана промышленная технология получения и анализа ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека.
Практическое значение работы. Разработанная промышленная технология получения плацентарного ингибитора РНКаз внедрена в производство на Омутнинском химическом заводе. На основе лабораторного метода выделения ингибитора кислых РНКаз разработан проект опытно-промышленной технологии получения нового ингибитора. Намечено внедрить его в производство.
На защиту выносится. Экспериментальные данные по выделению нового белкового ингибитора кислых РНКаз, полученного из печени цыплят, больных острым миелобластозом. Данные по сравнительному изучению некоторых физико-химических свойств нового ингибитора РНКаз и ингибитора РНКаз из плаценты человека. Описание разработанной опытн промышленной технологии получения ингибитора РНКаз из плаценты человека.
Ингибирование рибонуклеазной активности при проведении экспериментальных работ с рибонуклеиновыми кислотами
В течение последнего десятилетия выделение высокомолекулярных РНК, например, фаговых, вирусных, мРНК, трансляция мРНК in vitro стало использоваться особенно широко. Подобные работы заложили основу развития технологии рекомбинантной ДНК, с помощью которой в настоящее время удается получить много ценной информации в области биологии и медицины. Кроме того, изучение отдельных высокомолекулярных РНК, выделенных в чистом виде, и их продуктов трансляции внесло важный вклад в понимание регуляции экспрессии генов в клетке на различных уровнях. Всё это стало возможным благодаря разработке методов получения недеградированных биологически активных рибонуклеиновых кислот из разнообразных источников.
Одним из ключевых моментов при получении хороших препаратов высокомолекулярных РНК, а также при обратной транскрипций и трансляции мРНКіп vitro является сведение к минимуму рибонуклеазной активности как на начальных стадиях выделения РНК, так и на той, которая может присутствовать в препаратах ферментов и в других реактивах, использующихся в реакцияхin vitro.Рибонуклеази - очень активные ферменты, и достаточно ничтожного их количества, чтобы инактивировать РНК, Если экзогенного рибонуклеазного загрязнения из посторонних источников ( с лабораторной посудой, водой, реактивами и т.д. ) избежать достаточно просто с помощью соответствующей организации лабораторной работы, то для преодоления трудностей, связанных с эндогенной рибонуклеазной активностью биологического материала, приходится применять специальные ингибиторы РНКаз, которые условно можно разделить на три группы: ингибиторы, тормозящие рибонуклеаэную активность с помощь -сорбции РНКаз, белковые ингибиторы рибонуклеаз и инактиваторы РНКаз, к которым можно отнести протеолитические ферменты и неко -торые химические агенты.
В ранних работах для адсорбции рибонуклеаз использовали диатомовую землю С бентонит) и макалоид / 6 /. В настоящее время с этой целью широко применяют сульфатированный полисахарид -гепарин. Другие полианионы, например, поливинилсульфат, дейст -вуют подобно гепарину / 7 /, видимо, связывая рибонуклеазы и конкурируя таким образом с РНК. Аналогами РНК являются комплексы, образованные ионом оксованадия и любым из четырех рибонуклеоэи-дов / 8 /. Такие комплексы временно связываются со многими РНКазами и практически полностью подавляют их активность.
Сильными ингибиторами РНКаз являются белки, выделенные и очищенные из печени крысы / 9 / и из плаценты человека / 10 /. Ингибирование при применении белков-ингибиторов носит обратимый характер. Такой метод подавления активности РНКаз имеет ряд преимуществ С например, белки легко экстрагируются фенолом).
Протеолитические ферменты ( протеиназа К и др. ) быстро инактивируют нуклеазы из многих источников. Некоторые химические агенты, например, 4 М гуанидинизотиоцианат в присутствии восстановителей, подобных 2-меркаптоэтанолу, практически полностью инактивирует РНКазы / II /.
Ингибирование рибонуклеазной активности с помощью сорбции РНКаз
Первым в качестве сорбента, способного адсорбировать рибонуклеазы и таким образом понизить рибонуклеазную активность препаратов, был использован бентонит ( гидратированный алюмосиликат )/12/. Свойства бентонита связывать РНКазы позволяют тіол учать препараты интактных вирусных РНК с хорошей эффективностью . Так, например, использование бентонита для подавления РНКазной активности при выделении РНК вируса табачной мозаики позволило повысить инфекционность РНК в десять раз по-сравнению с методом выделения рибонуклеиновой кислоты без применения ингибитора РНКаз / 13 /.
Однако, при использовании бентонита возникает ряд сложностей. Например, разные РНКазы бентонит адсорбирует при различных условиях. Так, панкреатическая РНКаза ингибируется бентонитом при кислых значениях рН, а кислая РНКаза печени и щелочная РНКаза рибосом печени- при нейтральных. В ряде случаев применение бентонита не достаточно для эффективного торможения рибонуклеазной активности, в частности, при выделении интактных полисом из селезенки - клетки которой содержат целый набор мощных РНКаз / 14 /. В таких случаях приходится применять другие специальные меры. Кроме того, иногда возникают трудности с удалением бентонита из препарата. Неполное освобождение препарата от бентонита может сильно исказить результаты последующего анализа нуклеотид-ного состава РНК в связи с тем, что кислотный гидролиз препаратов РНК, содержащих примесь бентонита, приводит к частичному связы -ванию аденина и гуанина / 15 /. На связывание бентонитом, после подкисления реакционной смеси аденозине указали также Ричмонд и Черри / 16 /. В связи со способностью бентонита сорбировать белки могут возникнуть сложности и с применением его в биохими-ческих реакциях с участием РНК, таких как обратная транскрипция, синтез белка в бесклеточных системах и других, хотя в ряде случаев он может быть достаточно эффективным / 17 /.
Широко используется в качестве ингибитора рибонуклеаз сульфатированный аминополисахарид-гепарин, Ингибирующее действие гепарина было открыто независимо Розом / 18 / и Золлинером /19 /.в начале 50 -х годов. По мнению авторов работы / 0 / механизм действия гепарина представляет случай конкурентного ингибирования и обусловлен конкуренцией между сульфатными группами самого гепарина и фосфатными группами нуклеиновых кислот. Гепарин ингибирует обе фазы действия панкреатической РНКазы на РНК, как быстрый разрыв фосфодиэфирных связей в молекуле рибонуклеиновой кислоты с образованием 2 : 3 - цикломонофосфатов, так и медленную стадию - гидролиз 2 : 3 -цикломонофосфатов с образованием 2 , 3 -монофосфатов / 21 /. Надо отметить» что подавляя активность панкреатической РНКазы, гепарин оказался совершенно неэффективным в отношении кислой рибонуклеазы печени / 22 /. Гепарин следует удалять из препарата РНК перед проверкой в системе трансляции, так как он является ингибитором инициации полипептидной цепи. Кроме РНКаз гепарин способен связываться с другими белками, взаимодействующими с нуклеиновыми кислотами, в следствии чего он не может применяться как ингибитор рибонуклеаз в таких биохимических реакциях, как обратная транскрипция, элонгация белкового синтеза и других.
Сырье, реактивы, материалы и буферные растворы
В работе использовали плаценту человека, доставленную в течении одного - трех часов во льду; печень цыплят, больных острым миелобластозом; печень куриных эмбрионов, зараженных вирусом гриппа линии А-І, штамм Тайвань; печень индюков, инфицированных вирусом острого миелоцитоматоза, штамм УС 9» Печень цыплят извлекали из тушек, обескровленных в возрасте 18 - 20 суток. В работе использовали линии кур: Белый Леггорн, кросс Белорусь-П линии Н и линии С с Белорусской зональной станции по птицеводству, а также кросс Белорусь-9 и Бройлер-9 Яранской птицефабрики Кировской области.
Применяли преимущественно отечественные материалы и реактивы, В отдельных случаях прибегали к их дополнительной очистке общепринятыми методами / 90 /. Из препаратов зарубежных фирм использовали: дитиотреитол, додецилсульфат натрия, бромистый эти-дий, -меркаптоэтанол, сефарозу 4В, бромциан, РНКазу А - фирмы "Sigma" США), акриламид, бисакриламид, персульфат аммония -, фирмы "Reanal" (Венгрия), ДЭАЭ-целлюлозу ДЕ-52-фирмы "Whatman " (Англия), РНКазу А - фирмы "Wartington" (CluA).
Для получения гомогената ткани из плаценты человека с последующим высаливанием сернокислым аммонием и получения гомогената печени цыплят, больных острым миелобластозом, а такке гомогенатов печени куриных эмбрионов, зараженных вирусом гриппа и индюков, инфицированных вирусом острого миелоцитоматоза применяли буферные растворы следующего состава:
