Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1. Липолитические ферменты 10
1.1. Липаза из поджелудочной железы свиньи 10
1.2. Липаза из гриба рода Mucor 12
1.3. Липаза, выделенная из бактерий рода Pseudomonas 13
1.4. Кинетика липолиза 14
2. Общие принципы иммобилизации ферментов 19
2.1. Носители для иммобилизации ферментов 20
2.2. Методы иммобилизации ферментов 22
3. Особенности иммобилизации липаз 29
3.1. Адсорбция 30
3.2. Ковалентная иммобилизация липаз 34
3.3. Включение или микрокапсулирование 36
Глава 2. Материалы и методы 41
1. Перечень используемых реактивов 41
2. Методики приготовления растворов 42
2.1. Приготовление рабочего раствора субстрата 43
2.2. Приготовление растворов липаз 43
2.3. Приготовление растворов полиэлектролитов 43
3. Методы и приборы 44
3.1. Методы и аппаратура для измерения активности липаз 44
3.2. Исследование липазы в комплексах с полиэлектролитами методом межфазной тензиометрии 46
4. Статистическая обработка результатов 51
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 53
1. Влияние белкового окружения на активность липаз из различных источников 53
2. Влияние полиэлектролитного окружения на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucorjavanicus 56
3. Регуляция активности липаз путем направленного изменения условий среды 61
3.1. Влияние рН среды на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucorjavanicus 61
3.2. Влияние температуры на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucorjavanicus 62
3.3. Влияние температуры на активность липаз в комплексе с синтетическими полиэлектролитами 64
3.3.1. Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиньи в комплексе с полиэлектролитами при увеличении температуры 65
3.3.2. Изменение активности липазы из гриба Mucor javanicus в комплексе с полиэлектролитами при увеличении температуры 68
4. Изучение динамического поверхностного натяжения систем липазы из поджелудочной железы свиньи с природными и синтетическими полиэлектролитами 71
4.1. Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в смеси с природным полимером - бычьим сывороточным альбумином 72
4.2. Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в смеси с поли-L-глутаминовой кислотой 77
4.3. Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в смеси с поли-L-лизином 80
4.4. Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в трехкомпонентном комплексе с поли-Ь-лизином и поли-L- глутаминовой кислотой 84
4.5. Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в смеси с полистиролсульфонатом натрия 85
4.6. Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в смеси с полидиаллилдиметиламмоний хлоридом 88
4.7. Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в трехкомпонентном комплексе с полистиролсульфонатом натрия и полидиаллидиметиламмоний хлоридом 92
5. Модели ферментативных супрамолекулярных наноразмерных систем 93
Выводы 98
Список литературы 99
Приложение 117
- Липолитические ферменты
- Перечень используемых реактивов
- Влияние белкового окружения на активность липаз из различных источников
- Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в смеси с природным полимером - бычьим сывороточным альбумином
Введение к работе
Актуальность темы. Исследования биокаталитических систем на основе липаз являются важными и актуальными как по фундаментальной, так и по прикладной направленности. Липазы - это сериновые гидролазы, катализирующие ряд ключевых биохимических реакций: гидролиз, этерификация, трансэтерификация, алкоголиз, ацидолиз [120, 88]. Липазы применяются в пищевой, фармакологической, агрохимической и кожевенной промышленности, в производстве моющих средств, поверхностно и оптически активных соединений, вкусовых и ароматических компонентов, для аналитических целей в медицине [8, 23, 114, 95, 101, 50, 128, 136, 161]. Свойство энантиоселективности липаз широко применяется в органическом синтезе биологически активных веществ и их синтетических аналогов, таких как простагландины, алкалоиды, терпеноиды, антибиотики, производные нуклеозидов и т.п. [118, 148].
Однако, дальнейшее применение липаз в промышленности сдерживается сложностями в создании оптимальной реакционной системы, высокой ценой ферментов, загрязненностью большинства ферментных препаратов, низкой термостабильностью, невысокими скоростями реакций и т.д. Решения большинства вышеперечисленных проблем лежат на пути использования иммобилизованных ферментов. Иммобилизация липаз способствует отделению фермента от продуктов реакции, позволяет экономить фермент, увеличивает термостабильность и активность липаз. В настоящее время накоплен обширный материал по иммобилизации липаз из различных источников методами адсорбции, ковалентного связывания, включения в полимерные гели и т.д. [28, 95, 157]. Однако систематизированных данных о влиянии полимеров на коллоидно-химические и каталитические свойства липаз из различных источников до начала наших работ в литературе было недостаточно. При исследовании новых биоматериалов и методов иммобилизации важно проводить
фундаментальную работу по изучению физико-химических свойств иммобилизованных липаз.
Цель работы - изучение ферментативной активности и динамического поверхностного натяжения систем липаз из различных источников с природными и синтетическими полимерами.
Исходя из этой цели, были поставлены задачи:
Изучить влияние природного полимера - бычьего сывороточного альбумина на активность липаз из различных источников.
Изучить влияние синтетических разнозаряженных полиэлектролитов -полистиролсульфоната натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлорида на активность липаз из различных источников.
Изучить сочетанное влияние температуры и полимерного окружения на активность липаз из различных источников.
Провести сравнительное исследование параметров динамического поверхностного натяжения панкреатической липазы в системах с синтетическими и природными полимерами.
Предложить эффективный способ регуляции ферментативной активности липаз из различных источников и модели супрамолекулярных наноразмерных систем на основе липаз и полиэлектролитов.
Научная новизна работы. Предложены модели супрамолекулярных наноразмерных систем на основе липаз и полиэлектролитов. Выявлены молекулярные механизмы и впервые изучено влияние температуры на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucorjavaniens в системах с синтетическими полиэлектролитами: полистиролсульфонатом натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлоридом. Впервые исследовано динамическое поверхностное натяжение систем липазы из поджелудочной железы свиньи с бычьим сывороточным альбумином, поли-Ь-глутаминовой кислотой, поли-Ь-лизином, полистиролсульфонатом натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлоридом при различных молярных
соотношениях липаза: полимер. Научная новизна работы подтверждена 3 патентами РФ № 2301830, №2301831, № 2308486 (Зайцев С.Ю., Каштиго Т.В., Тульская Е.В., Царькова М.С., Кортикова А.В.). Теоретическая и практическая значимость.
Разработан эффективный способ направленной регуляции активности липаз в супрамолекулярных наноразмерных системах с разнозаряженными полиэлектролитами. Установлено значительное увеличение ферментативной активности и стабильности липаз в полимерных системах при возрастании температуры, что имеет большую практическую ценность для новых биотехнологических и биохимических методов. Полученные параметры динамического поверхностного натяжения систем липазы с природными и синтетическими полимерами важны как для понимания механизмов основных биохимических процессов в организме животных, так и для применения в биомедицинской диагностике. Результаты диссертационной работы используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов ветеринарно-биологического факультета ФГОУ ВПО МГАВМиБ по специальности «Биохимия». Основные положения практической значимости работы отражены в 3 патентах РФ № 2301830, № 2301831, № 2308486 (Зайцев С.Ю., Каштиго Т.В., Тульская Е.В., Царькова М.С., Коршикова А.В.). Основные положения, выносимые на защиту:
Данные по влиянию природного полимера - бычьего сывороточного альбумина - на активность липаз из различных источников.
Данные по влиянию синтетических полиэлектролитов полистиролсульфоната натрия и полидиаллилдиметиламмоний хлорида - на активность липаз из различных источников.
Данные по влиянию температуры на активность липаз из различных источников в системах с указанными синтетическими полиэлектролитами.
Параметры динамического поверхностного натяжения систем панкреатической липазы с синтетическими и природными полимерами.
5. Включение липазы в системы с полиэлектролитами в определенных соотношениях как эффективный способ регулирования каталитической активности липаз из различных источников. Модели супрамолекулярных наноразмерных систем, представляющих собой различные типы комплексов липазы, поликатиона, полианиона и эмульгированного триацилглицерола.
Липолитические ферменты
Липолитические ферменты (липазы) играют важную роль в обмене липидов у животных [7, 8, 15, 144]. Они относятся к классу гидролаз (класс 3). Почти все липолитические ферменты относятся к подкласу 1 и являются гидролазами эфиров. Традиционно липолитические ферменты относят к гидролазам эфиров карбоновых кислот (КФ 3.1.1). Липазы способны катализировать 4 типа реакций таких как: 1) гидролиз липидов и эфиров, 2) этерификация, 3) трансэтерификация, 4) перенос ацильных групп [75, 151]. Многие липазы имеют сродство к гидрофобным поверхностям, поверхностям эмульсионных частиц и мембранам [52, 87].
Липазы, используемые в данной работе - это гидролазы сложных эфиров глицерина и жирных кислот, т.е. ацилгидролазы различных триацилглицери д ов.
Панкреатическая липаза - фермент, который преимущественно вырабатывается поджелудочной железой, а также выделяется в небольших количествах слюнными железами и слизистыми оболочками желудка, легких и кишечника [56]. Липаза принимает участие в расщеплении нейтральных жиров, поступающих в кишечник с пищей [25, 149]. Кроме того, этот фермент нашел широкое применение при исследованиях в области химии липидов и биохимии, поскольку он специфически гидролизует сложные эфиры третичных спиртов. Это его свойство широко использовалось для анализа и синтеза жиров и других глицеридов [54, 75, 89,132].
Панкреатическая липаза (рис. 1.1) является гликопротеидом, имеющим молекулярную массу порядка 50 000 (у свиньи) и оптимум рН 8-9 [8, 40]. Позиционная специфичность по отношению к первичным эфирным связям имеется, но не во всех случаях. Обычно этот фермент может гидролизовать
Млекопитающие не способны усваивать поступающие с пищей триглицериды в интактном виде. Для всасывания триглицеридов в кишечном тракте необходимо, чтобы они были частично гидролизованы. Этот гидролиз осуществляется пищеварительными липазами, которые продуцируются у млекопитающих в поджелудочной железе, а у низших животных в соответствующих ей органах (например, у костистых рыб — в «диффузном панкреасе», у членистоногих — в гепатопанкреасе). У млекопитающих фермент образуется в ацинарных клетках поджелудочной железы и накапливается в зимогенных гранулах, которые содержат набор пищеварительных ферментов или их проферментов [131]. Из этих гранул липаза высвобождается в специальный проток, по которому панкреатический сок поступает к месту своего назначения — в тонкий кишечник. Данных, свидетельствующих о наличии профермента, или зимогена липазы, не имеется, и нет никаких причин думать, что таковой существует. В отличие от протеиназ или фосфолипаз, активные формы которых могут действовать на компоненты панкреатических клеток, липаза обладает строго выраженной специфичностью, ибо она действует на свой субстрат — триглицерид только в том случае, если он находится в эмульгированном состоянии, что имеет место в кишечнике, но не в клетках. Следовательно, нет необходимости защищать железу от действия этого фермента [99].
Основным местом переваривания липидов корма у животных является тонкий отдел кишечника, где липиды предварительно подвергаются эмульгированию желчью при участии солей желчных кислот (в печени синтезируются холевая, дезоксихолевая, гликохолевая и таурохолевая кислоты) и расщеплению липазой поджелудочного сока из панкреатической железы. Адсорбируясь и уменьшая поверхностное натяжение жировых капелек, желчные кислоты раздробляют их и превращают жиры и масла в тонкую эмульсшо, диаметр частиц которой не превышает 0,5 мкм. Эмульгирование жира приводит к увеличению поверхности соприкосновения триглицерида с водным раствором липазы, т. е. облегчает ферментативный гидролиз [55].
Плесневый гриб Mucor javanicus продуцирует протеиназу, способную створаживать молоко. Запатентованы по крайней мере два ферментных препарата из этого плесневого гриба, предназначенных для использования в производстве сыров [8]. В этих неочищенных препаратах протеиназ обнаружена липолитическая активность, поэтому в сырах, созревающих при участии неочищенных протеиназ, накапливаются свободные жирные кислоты, которые придают сыру специфический вкус и которые при избыточном содержании могут вызвать нежелательные изменения вкуса у сыра. Микроорганизм выращивают на среде, содержащей 4% пшеничных отрубей, при рН 6,7 и 35 С. Неочищенный ферментный препарат получают с помощью следующих процедур: фильтрации, осаждения сульфатом аммония и центрифугирования.
Перечень используемых реактивов
В работе использовали следующие реактивы: 1. Липаза из поджелудочной железы свиньи (Л-1), Fluka, cat. № 62300, Mw = 50 000 г/моль, pi - 5,18, активность фермента 15-35 U/мг. 2. Липаза из гриба Mucor javanicus (Л-2), Fluka, cat.№ 62304, Mw = 40 000 г/моль, pi - 4,68, активность фермента 696 U/мг. 3. Липаза из бактерии Pseudomonas fluorescens (Л-3), Fluka, cat.№ 95608, Mw = 33 000 г/моль, pi - 4,46, активность фермента 36 U/мг. 4. Субстрат триацилглицерол С9Н14О6 (фирменное название триацетин), Aldrich, cat. № 24,088, Mw= 218,21 г/моль, чистота не менее 99 %. 5. Na-полистиролсульфонат (ПСС), Fluka, cat.№ 243051, Mw = 70 000 г/моль. 10. Раствор NaOH (0,0ЇМ) использовали в качестве титранта (Реахим, Россия) хч, с чистотой не менее 99 %. 11. Растворы NaCl (0,05М) и СаСЬ (0,05М) использовали для приготовления рабочего раствора. 2. Методики приготовления растворов
Взвешивание фермента и полимеров проводили на прецизионных аналитических весах фирмы OHAUS Analitical Plus с точностью 0,0001 г. Взвешивание солей проводили на технических весах фирмы OHAUS
Adventurer с точностью 0,001 г.
В колбу на 200 мл добавляли 0,1 М раствор триацилглицерола (2,182мл триацетина на 100 мл дистиллированной воды), 50 мл 0,05 М раствора NaCl и 50 мл 0,05 М раствора СаС12.
Соответствующие навески липаз из поджелудочной железы свиньи, гриба Mucor javanicus и бактерии Pseudomonas fluorescens (0,005; 0,004 и 0,0033 г) растворяли в 10 мл дистиллированной воды и аккуратно перемешивали, чтобы избежать механической денатурации белка. Получали растворы липаз с концентрацией 10"5 М.
Растворы полиэлектролитов готовили в дистиллированной воде в концентрации 10 М. Для приготовления раствора полистиролсульфоната натрия брали 0,035 г полимера и растворяли в 50 мл воды. Раствор перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 15 минут.
Для приготовления раствора полидиаллилдиметиламмоний хлорида брали 1,125 мл 20% раствора полимера, растворяли в 50 мл воды и перемешивали в течение 15 минут. Для приготовления раствора поли-Ь-лизина гидробромида брали 0,025 г полимера и растворяли в 50 мл воды. Раствор перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 15 минут. Для приготовления раствора поли-Ь-глутаминовой кислоты натриевой соли брали 0,016 г полимера и растворяли в 50 мл воды. Раствор перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 15 минут.
Для приготовления раствора бычьего сывороточного альбумина брали 0,033 г полимера и растворяли в 50 мл воды. Раствор аккуратно перемешивали.
Активность липазы была измерена с помощью метода потенциометрического титрования. Основные достоинства этого метода -высокая точность, высокая чувствительность и возможность проводить титрование в более разбавленных растворах, чем это позволяют визуальные индикаторные методы.
Принцип метода:
Согласно основам энзимологии фермент и субстрат образуют комплекс, в котором при протекании реакции образуются продукты реакции и выделяется исходный фермент. Липаза обладает свойством стереоспецифичности и расщепляет 1 и 3 связи в молекуле триацилглицерола.
Влияние белкового окружения на активность липаз из различных источников
Была изучена каталитическая активность липаз из различных источников в присутствии природного полимера - бычьего сывороточного альбумина (БСА), который является одним из наиболее доступных и простых белков [29] для изучения влияния полимерного окружения на активность липаз из различных источников. Очень важно, что БСА имеет относительно небольшую молекулярную массу (66000), ненамного превышающую молекулярную массу выбранных липаз. БСА выполняет важные физиолого-биохимические функции в плазме крови, в частности, связывая и транспортируя жирные кислоты и катионов металлов. Эта функция очень важна и делает БСА перспективным для данных исследований.
Активность липаз из поджелудочной железы свиньи, Pseudomonas fluorescens и Mucor javanicus была измерена в системе с бычьим сывороточным альбумином в соотношениях фермент: альбумин 10:1, 1:1, 1:10 и 1:100. Результаты представлены в таблице 3.1 и на рисунках 3.1 и 3.2. Активность липазы из поджелудочной железы свиньи (Л-1), измеренная при соотношениях фермент: БСА от 10:1 до 1:100 не показала достоверных отклонений от активности липазы без БСА, принятой за 100 %.
В случае липазы из гриба Mucor javanicus наблюдается незначительное снижение активности фермента в присутствии БСА на 4-16 % при избытке липазы относительно альбумина, и снижение активности на 27-28 % при избытке альбумина относительно фермента (рис. 3.1).
Как видно на рисунке 3.2, активность липазы из Pseudomonas fluorescens в присутствии БСА всегда была выше контроля (за контроль была принята активность липазы без альбумина) и максимальна при соотношении липаза : БСА, равном 10:1 (выше контроля в 1,5 раза).
Подобное увеличение ферментативной активности липазы может быть объяснено структурными особенностями альбумина. Структура альбумина описывается как одна длинная полипептидная цепочка, уложенная в 4 связанных глобулярных сегмента неравных размеров, конформация которых фиксирована 17 дисульфидными связями (рис. 3.3) [29]. Subdomain A Subdom-ain В
Рис. 3.3. Структура молекулы бычьего сывороточного альбумина [29] Такое сегментированное устройство придает молекуле значительную подвижность. На ее поверхности имеется 2-5 участков, с наличием которых связывают высокое сродство к органическим анионам, нерастворимым в водной среде. Особенно важно это свойство проявляется при связывании анионов жирных кислот, благодаря чему менее чем 1/5000 от их общего количества находятся в крови в свободном виде [29]. Связывание анионов жирных кислот альбумином и удаление их из реакционной смеси сдвигает равновесие гидролитической реакции расщепления субстрата триацетина в сторону образования продуктов реакции.
Таким образом, БСА по-разному взаимодействует с указанными липазами и является оптимальным «активатором» только для липазы из Pseudomonas fluorescens. В случае липаз из поджелудочной железы свиньи и Mucor javaniciis требовались другие полимеры, которые были выбраны из имеющихся синтетических полиэлектролитов.
Для изучения влияния полимеров на активность липаз были взяты разнозаряженные полиэлектролиты. Na-полистиролсульфонат (ПСС) - как полианион, полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПАМА) - как поликатион. Полиэлектролиты таких типов находят широкое применение в химических технологиях (как флокулянты для очистки воды), в медицине и бионанотехнологиях (формирование полиэлектролитных оболочек на коллоидных частицах различной природы для получения микрокапсул, получение нанотрубок, лечение гиперкалиемии и т.д.). Комплексы ферментов с полиэлектролитами описаны в литературе [11, 30, 121, 158]. Белковые молекулы ферментов являются полиамфолитами, так как входящие в их состав аминокислоты могут быть заряжены как положительно (лизин, аргинин, гистидин), так и отрицательно (аспарагиновая и глутаминовая кислоты). Поэтому на поверхности белков в нейтральных средах присутствуют как положительные, так и отрицательные заряды. В связи с такой особенностью строения белковых молекул, с их полипептидной цепью могут взаимодействовать соединения, содержащие ионогенные группы, в том числе и полиэлектролиты. Результатом такого взаимодействия является образование нековалентных белок-полиэлектролитных комплексов [18, 22].
Активность липазы из поджелудочной железы свиньи и липазы из гриба Mucor javanicus была измерена в присутствии ПАМА и ПСС в соотношениях липаза: полимер 1:1, 1:10, 1:100 при рН 7,0 и t 25 С (табл. 3.2). Активность липаз без полиэлектролитов была принята за 100 %.
Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в смеси с природным полимером - бычьим сывороточным альбумином
Для оценки взаимодействия липазы с полиэлектролитами в растворе и на границе раздела фаз вода/воздух было исследовано динамическое поверхностное натяжение (ДПН) подобных комплексов при различных соотношениях липаза: полиэлектролит. Изучение динамического поверхностного натяжения может дать ценную информацию для понимания механизмов адсорбции молекул на границе раздела фаз, что особенно важно для данных исследований, поскольку известно свойство липаз активироваться на границе раздела фаз масло/вода и гидрофобных поверхностях. Известно, что слишком низкое поверхностное давление, то есть, слишком высокое поверхностное натяжение, может привести к необратимой денатурации липазы, а очень высокое поверхностное давление (низкое поверхностное натяжение) уменьшает активность липазы в результате недоступности субстрата к активному центру липазы [153].
Впервые исследовано динамическое поверхностное натяжение раствора липазы в присутствии природного полимера — бычьего сывороточного альбумина, а также в присутствии синтетических полиэлектролитов - положительно заряженных полилизина и полидиаллилдиметиламмонии хлорида, и отрицательно заряженных -полиглутаминовой кислоты и полистиролсульфоната натрия.
Поверхностное натяжение раствора липазы из поджелудочной железы свиньи было измерено в присутствии бычьего сывороточного альбумина при молярных соотношениях липаза: альбумин 1:100, 1:50, 1:10, 1:1, 10:1, 50:1, 100:1, а также измерено поверхностное натяжение индивидуальных растворов липазы из поджелудочной железы свиньи (концентрация 10 5М) и бычьего сывороточного альбумина (концентрация 10М) (рис. 3.18-3.19, П.1-П.6).
Из полученных тензиограмм были рассчитаны показатели поверхностного натяжения в динамике (табл. 3.7).
Табл. 3.7. Показатели динамического поверхностного натяжения смеси липаза: БСА при различных временах существования поверхности 0,01(о"о) ОД с (GI), 1 с (с2), ЮОс (с3) и 3500 с (в4), а таюке углы наклона тензиограмм
При коротких временах существования поверхности 0,01 и 0,1 с ПН растворов липазы, БСА и их смесей в различных соотношениях близко к ПН воды и незначительно изменяется от 74,49±0, до 77,15±0,40 мН/м (эти значения 24 до 77,15±0,40 мН/м (эти значения соответствуют ПН воды при данных временах существования поверхности, полученному на приборе ВРА-1Р). Угол наклона начального участка тензиограмм отличается незначительно.
При времени жизни 1 с становятся заметны различия в ( смесей липаза : БСА. Видно, что БСА быстрее понижает ПН (ог = 69,42 ±0,09 мН/м), чем липаза (а2 = 71,68±0,06 мН/м), поверхностное натяжение которой лишь незначительно ниже ПН воды при этом времени. Как и следовало ожидать, при увеличении концентрации липазы в смеси липаза : БСА от 1:1 до 100:1 02 практически не изменяется и близко к ПН воды. При увеличении концентрации БСА в смеси липаза: БСА от 1:10 до 1:100 о2 близко к ПН чистого БСА.
ПН липазы и смесей липаза: БСА с высокой относительной концентрацией липазы (10:1, 50:1, 100:1) заметно понижается лишь при 100 с (оз лежит в пределах от 69,85 ±0,56 до 71,10 ±0,11 мН/м). Продолжает понижаться ПН БСА (62,00±0,26 мН/м) и смесей липаза: БСА с высокой относительной концентрацией БСА (1:10 - 61,92±0,21 мН/м, 1:50 - 62,68±0,11 мН/м, 1:100 - 61,89±0,41 мН/м).
В случае эквимолярного соотношения липаза : БСА оз было равно 67,66±0,24 мН/м, что на 5,74 мН/м больше, чем при увеличении концентрации БСА в 10 раз (1:10), и на 3,44 мН/м меньше, чем при увеличении в 10 раз концентрации липазы (10:1). Угол наклона тензиограммы в области 100 с - Х\ изменяется от 11,18±0,91 до 13,15±0,30 мН-м с172 для БСА и смеси липаза: БСА 1:10-1:100, уменьшается при 1 1/9 соотношении 1:1 до 7,39±0,88 мН-м" с , и значительно уменьшается с увеличением концентрации липазы относительно БСА до 1,19±0,60 -4,80±0,66 мН-м-1с1/2.
При длинных временах существования поверхности ПН (а4) липазы (42,86±1,18 мН/м) снижается больше, чем ПН БСА (51,74±0,13 мН/м) на 9 мН/м (рис. 3.21).
Поверхностное натяжение (а4) комплексов липаза : БСА при различных молярных соотношениях Следует отметить, что добавление БСА в малых концентрациях к раствору липазы (соотношения от 100:1 до 10:1) увеличивает ПН комплексов липаза: БСА при длинных временах на 3-5 мН/м. Это говорит о том, что БСА либо вступает в конкурентную адсорбцию с липазой за поверхность раздела фаз, либо образует комплекс с липазой, который понижает адсорбцию чистой липазы на границе раздела фаз. При эквимолярном соотношении параметр 0 4 увеличивается на 7 мН/м. В случае преобладания в смеси БСА (соотношения 1:10, 1:50 и 1:100) а4 близко к ПН чистого БСА, так как большой молекулярной массы альбумин занимает все больше поверхности. Кроме того, известно, что белки на границе раздела фаз подвергаются конформационным изменениям, в частности возможно разворачивание белковой глобулы и «вытягивание» белка на поверхности раздела фаз. 4.2. Измерение динамического поверхностного натяжения растворов липазы из поджелудочной железы свиньи в смеси с поли-Ь-глутаминовой кислотой
Для изучения взаимодействия липазы с отрицательно заряженными полиэлектролитами и возможности образования их комплексов был выбран модельный полипептид - поли-Ь-глутаминовая кислота. Поверхностное натяжение раствора липазы из поджелудочной железы свиньи было измерено в присутствии поли-Ь-глутаминовой кислоты (ПГ) при молярных соотношениях липаза: ПГ 1:100, 1:10, 1:1, 10:1, 100:1. Тензиограммы представлены нарис. 3.22-3.23, П.7-П.10.
