Введение к работе
Актуальность
По данным ВОЗ онкологические заболевания это ведущая причина всех смертей во всем мире, где рак молочной железы это самое распространенное онкологическое заболевание у женщин во всем мире (519,000 смертей в 2004 году) и пятая самая распространенная причина смерти от онкологических заболеваний в общей популяции. Этиология этого заболевания до сих пор изучается, но множественные исследования показали, что эстрогены играют важную роль в развитии этого заболевания (Russo и Russo, 1998). Биологические эффекты эстрогенов опосредованны через эстрогеновые рецепторы альфа (ЭР) и бета (ЭР), которые эскпрессируются в более чем 80% всех диагносцируемых опухолей молочной железы. ЭР в данный момент остается основной мишенью в терапии рака молочной железы, а так же уровень его экспрессии используется для прогнозирования эффективности лечения селективными модуляторами ЭР (Selective Estrogen Receptor Modulators или SERM), такими как тамоксифен (EBCTCG, 1998; EBCTCG, 2005). Тамоксифен является первым хемиотерапевтическим препаратом, который предотвращает туморогенез ЭР-положительных опухолей (Jordan, 2008) у женщин входящих в группу риска по данному заболеванию по всему миру (Fisher и другие, 1998). Тамоксифен сам по себе является видоизмененной производной долгодействующего эстрогеноподобного вещества трифенилэтилена (Robson, 1937; Harper и Walpole, 1966; Harper и Walpole, 1967). Эффективность тамоксифена зависит от образования клинически активного метаболита 4-гидрокситамоксифена и эндоксифена, которые в свою очередь обладают более высоким сродством к ЭР и обладают более выраженными антиэстрогеновыми свойствами в клетках рака молочной железы (Jordan и другие, 1977; Johnson и другие, 2004). Сейчас не известны точные преобразования, которым подвергается ЭР после образования комплекса с эстрогенами, поскольку весь комплекс рецептора с лигандом не был до сих пор кристаллизован, таким образом недостаток знаний в этой области компенсируется изучением структурно-функциональных отношений ЭР и его лигандов. Тем не менее, сам лиганд-связывающий домен (ЛСД) ЭР, ассоциированный с 17-эстрадиолом (Е2) и диетистилбестролом (DES) и SERM 4-гидрокситамоксифеном и ралоксифеном были кристаллизованны. Подробный рентгеноструктурный анализ конформационных изменений ЛСД ЭР выявил определенную разницу в конформациях ЛСД ЭР ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном и ралоксифеном по сравнению с ЛСД ЭР связанного с Е2 и DES (Brzozowski и другие, 1997; Shiau и другие, 1998). Поскольку в ходе исследований с тамоксифеном было выявленно, что тамоксифен в ряде тканей обладает слабыми эстрогеноподобными свойствами, то результаты более подробных исследований данного феномена позволили предположить что это свойство связано с взаимодействием боковой цепи (алкиламиноэтокси группы) тамоксифена с аспартатом в 351 позиции и переориентирование данного аминокислотного отстатка в рецепторе позволяет аспартату взаимодействовать с функциональным лиганд-независимым доменом ЭР AF-1, что и обеспечивает эстрогеноподобное действие тамоксифена (Levenson и Jordan, 1998; Levenson и другие, 1998). Поскольку, как ранее было показано, тамоксифен является производным трифенилэтилена, то было сделано предположение, что не все эстрогены одинаково взаимодействуют с ЭР (Jordan и другие, 2001). Планарные вещества (такие как эстрадиол) и непланарные (такие как трифенилэтилен) являются эстрогенами и могут вызывать увеличение массы матки у грызунов, а так же вызывать ороговение вагинальной слизистой в кастрированных жиывотных, хотя непланарные эстрогены вызывают антагонистическую конформацию ЭР. Таким образом, эстрогены были классифицированны на основе их химической структуры на эстрогены класса I и класса II (Gust и другие, 2001; Jordan и другие, 2001). Несмотря на определеную разницу в конформационных изменениях ЭР, ассоцииированных с различными классами эстрогенов, до сих пор в полной мере не известны связанные с ними биологические эффекты, такие как рост клеток, апоптоз, активация транскрипции эстроген-зависимых генов и ее регуляция.
Цель настоящего исследования
Целью настоящего исследования является проверка гипотезы о том, что конформация ЭР, которая зависит от структуры эстрогенов двух разных классов, играет роль в регуляции ряда биологических процессов (клеточная пролиферация, апоптоз и т.д.) в уникальных культурах клеток рака молочной железы человека in vitro.
Задачи настоящего исследования:
1. Определить биологическую активность (пролиферация клеток, апоптоз и т.д.) непланарных эстрогенов (серии синтезированных гидроксилированных трифенилэтиленов) по сравнению с планарными эстрогенами (17-эстрадиол и диэтилстилбестрол) на клонах клеток линии рака молочной железы человека MCF7 in vitro.
2. Подтвердить явление и уровень апоптоза при обработке эстроген-независимых клонов клеток рака молочной человека MCF7:5C in vitro исследуемыми трифенилэтиленами по сравнению с планарными эстрогенами.
3. Определить опосредованность действия исследуемых веществ через ЭР в клонах клеток линии рака молочной железы человека MCF7:WS8 и MCF-7:5C in vitro.
4. Определить механизм активации ЭР эстрогенами класса I и класса II при помощи репортерных тестов с мутантной формой ЭР в ЭР-отрицательной линии клеток рака молочной железы человека T47D:C4 in vitro.
5. Определить регуляцию транскрипционной активности ЭР (индукцию транскрипции мРНК и протеосомальной деградации) испытуемыми трифенилэтиленами по сравнению с планарными эстрогенами в клонах линии клеток рака молочной железы человека MCF7 in vitro.
6. Подтвердить гипотезу об изменении конформации лиганд-связывающего домена ЭР исследуемыми трифенилэтиленами при помощи молекулярного докинга.
Научная новизна
В ходе настоящего исследования было проведено структурно-функциональное исследование синтезированных производных трифенилэтилена (некоторые из них синтезированны впервые) на уникальных клеточных линиях рака молочной железы человека in vitro.
В ходе данного исследования была показана эстрогеноподобная активность в клетках рака молочной железы с диким фенотипом, а так же впервые была показана невозможность исследуемых трифенилэтиленов индуцировать эстроген-индуцированный апоптоз эквивалентный апоптозу индуцируемому эстрадиолом в клетках рака молочной железы с эстроген-независимым фенотипом, что впервые указывает на зависимость данного феномена от структуры лигнда и, как следствие, конформации рецептора.
Была подтверждена гипотеза о механизме активации ЭР в клетках рака молочной железы экспрессирующих мутантный типа ЭР, при помощи репортерных тестов. Были определны амикислотные остатки лиганд связывающего домена ЭР, критичные для активации рецептора трифенилэтиленами. Наиболее значимым результатом является выявление критичности наличия аспартата в 351 позиции на ЭР для активации рецептора трифенилэтиленами.
Впервые был проведен молекулярный докинг моделей структур исследуемых веществ в модели известных конформаций рецептора, в ходе которого были определены анинокислотные остатки, образующие с лигандами образуют водородные связи, и вероятные конформации, придаваемые трифенилэтиленами рецептору после связывания.
Впервые было показано, что, несмотря на измененную конформацию ЭР при связывании трифенилэтиленов, ЭР способен выполять свою транскрипционную функцию на промоторах эндогенных эстроген-зависимых генов (на примере pS2) в клетках рака молочной железы.
На основе полученных данных, были подтверждены выдвинутые гипотезы о регуляции транскрипционной активности ЭР в клетках при измененной конформации последнего и измененном механизме активации. Так было показано, что ЭР с измененной конформацией после связывания с трифенилэтиленами не способен эффективно деградировать и присоединять коактиватьрные молекулы (на примере SRC3).
Практическая значимость работы
Полученные данные ставят задачу по проведению клинических исследований о возможности применения эстрогена (17-эстрадиола) для лечения резистентных ко всем видам адъювантной терапии форм рака молочной железы. Применение производных трифенилэтилена для лечения таких форм рака было бы актуальным в силу менее выраженных системных побочных эффектов в ходе применения таких веществ для лечения. Ранее производные трифенилэтиленов уже исследовались в качестве противоопухолевых препаратов для лечения рака молочной железы в поздних стадиях развития. Обнаружилось, что хотя и был положительный терапевтический эффект от применения таких веществ и были менее выраженны побочные эффекты, данные вещества уступали в своей терапевтической эффективности планарным эстрогенам эстрадиолу и DES. Развитие новых клеточных моделей для симуляции резистентности рака молочной железы к современным формам адъювантной терапии позволило нам оценить возможность применения производных трифенилэтилена для индукции апоптоза в таких клетках. Результаты показали, что данные вещества не индуцируют апоптоз эффективно и обладают меньшим сродством к ЭР, что ставит под сомнение потенциальное развитие хемиотерапевтических препаратов на основе трифенилэтиленов для лечения таких резиситентных форм рака за счет их эстрогеноподобных свойств.
Но стоит отметить, что результаты настоящего исследования могут в дальнейшем прояснить механизмы формирования резистентности к лечению рака молочной железы тамоксифеном, так как и тамоксифен является производной трифенилэтилена.
Положения выносимые на защиту
-
Гидроксилированные производные трифенилэтилена, изучаемые в данном исследовании, являются агонистами ЭР в клетках рака молочной железы с диким фенотипом, но являются антагонистами в клетках рака молочной железы резистентных к тамоксифену и с эстроген-независимым фенотипом.
-
Исследуемые производные трифенилэтилена не способны индуцировать увеличение уровней проапоптотических маркеров в клетках с эстроген-независимым фенотипом, несмотря на способность трифенилэтиленов активировать ЭР в этих клетках так же эффективно как и в клетках с диким фенотипом.
-
Для активации ЭР трифенилэтиленами необходимо взаимодействие с 351 амикислотным остатком в рецепторе, так как именно эта аминокислота участвует в активации рецептора не планарными эстрогенами.
-
Образование комплекса трифенилэтиленов с ЭР приводит к конформационным изменениям рецептора больше напоминающих его антагонистическую конформацию.
-
За счет измененной конформации ЭР, рецептор активированный трифенилэтиленами способен выполнять свою фукцию как транскрипционный фактор, но не способен присоединять таке же количество коактиваторных белков как в случае с эстрадиолом.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на русском языке, на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и приложения. Библиография включает 195 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 1 таблицой.
