Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Общая характеристика холинэстераз (ХЭ) 13
1.1.1. История открытия и этапы изучения 13
1.1.2. Типы, их свойства, функции, локализация и идентификация 15
1.1.3. Молекулярное строение и структура 21
1.2. Холинэстеразы рыб 24
1.2.1. Типы, локализация и свойства 24
1.2.2. Участие ХЭ в физиологических процессах 38
1.2.3. Действие естественных экологических факторов и физиологических состояний 39
1.2.4. Действие ФОС и КС наХЭрыб вусловиях in vivo 43
1.2.5. Влияние соединений, не обладающих прямым антихолинэстеразным действием 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Исследуемые рыбы 57
2.2. Исследуемые химические соединения 60
2.3. Методы исследования 64
2.4. Культивирование экспериментальных рыб 73
2.5. Постановка экспериментов 74
2.6. Статистическая обработка 82
Глава 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Исследование скорости гидролиза ацетил- и бутирилтиохолина в тканях рыб 84
3.2. Электрофоретическое разделение и идентификация типов ХЭ в сыворотке крови рыб 93
3.3. Чувствительность ХЭ рыб к ингибирующему действию ДЦВФ in vitro... 105
3.4. ДЦВФ как избирательный ингибитор для раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ рыб 110
3.5. Соотношение доли БуХЭ и АХЭ в общей активности ХЭ плазмы крови рыб из сем Cyprinidae 119
3.6. Основные кинетические свойства АХЭ и БуХЭ рыб: сравнение с типичными ХЭ 122
3.7. Активность АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме пресноводных костистых рыб: меяозидовые и межсемейственные различия 134
3.8. Изменение активности АХЭ в мозге окуня при остром стрессе, индуцированном введением адреналина 144
3.9. Сезонная динамика активности АХЭ и БуХЭ в тканях окуня и плотвы 150
3.10.. Роль ингибирования АХЭ мозга в нарушении пищевого поведения лещапри действии ДЦВФ in vitro 184
3.11 Изменения АХЭ мозга окуня (Регса fluviatilis L.) при остром действии хлорофоса in vivo 194
3.12. Изменение активности АХЭ в мозге карпа и динамика ее восстановления при действии in vivo различных концентраций карбофоса.. 201
3.13. Динамика изменения активности ХЭ в тканях плотвы приодноразовом сублетальном действии ДДВФ in vivo 212
3.13 Роль ХЭ и других причин в межвидовой избирательности летального действия ФОС на рыб 216
3.13.1. Сравнительная устойчивость рыб к действию хлорофоса и ДДВФ в острых опытах 216
3.13.2. Чувствительность АХЭ рыб к ингибированию ДДВФ in vitro 220
3.13.3. Скорость поступления ДДВФ в организм карпа и окуня 222
3.13.4. Интенсивность метаболического разрушения ДДВФ в печени окуня и карпа в условиях in vitro 230
3.13.5. Роль БуХЭ плазмы в устойчивости леща к летальному действию хлорофоса и ДДВФ 235
Заключение 239
Выводы 247
Список цитируемой литературы 249
- Типы, их свойства, функции, локализация и идентификация
- Действие естественных экологических факторов и физиологических состояний
- Электрофоретическое разделение и идентификация типов ХЭ в сыворотке крови рыб
- Изменение активности АХЭ в мозге окуня при остром стрессе, индуцированном введением адреналина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение биоразнообразия и эволюции кинетических свойств ферментов и функций, выполняемых ими в организме - одна из основополагающих проблем современной биохимии и биологии в целом. Для решения этой проблемы необходимы сравнительные исследования ферментов у широкого круга живых организмов из разных филогенетических групп.
Холинэстеразы (ХЭ) - ферменты, широко распространенные в живой природе от микроорганизмов и простейших одноклеточных организмов до позвоночных, включая человека. Выделяют два основных типа ХЭ: ацстилхолинэстераза (аиетилхолин ацетилгидролаза, АХЭ; К.Ф. ЗЛ.1.7) и холинэстераза (ацилхолин ацилгндролаза; К.Ф. 3.1.1,8). К последнему типу относится наиболее часто встречаемая бутирилхолинэстераза (БуХЭ). ХЭ участвуют в различных физиологических процессах, но функциональное значение установлено только для АХЭ: она играет ведущую роль в механизме трансдукции нервного импульса в холинергических синапсах животных, гидролизуя медиатор аиетилхолин (АХ). Роль БуХЭ до сих пор остается неясной. Особенностью ХЭ является их способность взаимодействовать с фосфорорганическими (ФОС) и карбаматными (КС) соединениями, что приводит к необратимому ингибироваиию их активности. Икгибирование АХЭ нервной системы животных блокирует проведение нервного импульса и вызывает нарушение нормального функционирования организма, приводя в конечном итоге к его гибели (О'Брайи, I960; Голиков, Розенгарт, 1964). Этот феномен нашел широкое применение в практическом использовании ФОС и КС в качестве пестицидов, боевых отравляющих веществ и лекарственных препаратов (Розенгарт, Шерстобитов, 1978; Chambers, Levi, 1992), а также в использования ХЭ как биомаркеров действия этих соединений на разные виды животных (Minneau, 1991; Huggett et al., 1992), Наиболее полно к настоящему времени изучены АХЭ эритроцитов и мозга человека и крупного рогатого скота, а также БуХЭ сыворотки (плазмы) крови человека и лошади. Эти ферменты принято считать «типичными», ХЭ других организмов изучены недостаточно, хотя они могут заметно отличаться по свойствам от «типичных» АХЭ и БуХЭ (Бресткин и др., 1997).
Данные о ХЭ пресноводных костистых рыб носят ограниченный характер и получены в основном зарубежными исследователями на незначительном числе нехарактерных для ихтиофауны Европейской части России видов. Детальные исследования по идентификации типов ХЭ среди
ЦНБ МСХА фонд научной литомтуры
широкого ряда видов пресноводных костистых рыб, изучению их кинетических свойств, межвидовых различий в активности и распределению в органах до сих пор не проводились. В связи с этим до последнего времени преобладает мнение, что в организме рыб доминирует АХЭ, а БуХЭ, если и присутствует, то в очень небольших количествах (Augustinsson, 1958, 1959, 1961; Hogan, 1971; Брик, 1969; Brestkin et al., 1973; Hobden, Klaverkamp, 1977; Бресткин и др., 1997). Практически отсутствуют данные о сезонной динамике ХЭ, об их участии в таких биологически важных процессах, как питание, нерест, стресс. С момента обнаружения АХЭ в мозге рыб (Mendel, Rudney, 1943) исследования связаны, главным образом, с возможностью ее использования как биомаркера действия ФОС и КС (Weiss 1958, 1961, 1965; Coppage, Matthews, 1974; Гантверг, Перевозников, 1983; Zinkl et al., 1991). Тем не менее, до сих пор имеется мало данных о динамике восстановления активности ХЭ in vivo, особенно после хронического действия низких концентраций антихолмнэстеразных соединений. Единичны исследования роли ХЭ в механизмах межвидовых различий в устойчивости рыб к ФОС.
Цель и задачи исследования: идентификация типов ХЭ у пресноводных костистых рыб, изучение? их каталитических свойств, видоспецифичностн органо-тканевого распределения и некоторых прикладных аспектов (роль в физиологических процессах и варьирование активности при действии биологических и антропогенных факторов окружающей среды).
Соответственно цели были определены задачи работы:
-
Охарактеризовать типы ХЭ у разных представителей пресноводных костистых рыб и сравнить их по каталитическим свойствам с типичными ХЭ млекопитающих.
-
Исследовать межвидовые и межсемейственные особенности в органо-тканевом распределении разных типов ХЭ и в уровнях их активности у пресноводных костистых рыб.
-
Изучить изменения активности АХЭ мозга при стрессе, индуцированном адреналином.
-
Установить пределы биологической вариабельности и определить уровни нормальной активности ХЭ в разные сезоны года.
-
Оценить участие холинергической нервной системы н роль АХЭ мозга в формировании пищевого поведения рыб в норме и при хроническом отравлении ФОС.
-
Выявить роль ХЭ и других физиолого-биохимических факторов в
межвидовых различиях устойчивости рыб к острому токсическому действию ФОС.
Научная новизна. Обобщены исследования ХЭ пресноводных костистых рыб. Впервые в плазме пресноводных костистых рыб сем, Cyprinidac обнаружена БуХЭ, описаны ее каталитические свойства и распределение в различных органах, показаны сходство и отличия от ЛХЭ рыб и ЛХЭ и БуХЭ млекопитающих. Выявлены различия между видами и семействами рыб по уровню активности БуХЭ в плазме и печени. Показано, что у лсша Abramis brama в отличии от других представителей сем. Cyprinidac БуХЭ в плазме присутствует лишь у 30% особей. Впервые установлены устойчивые различия в активности ЛХЭ мозга не только между отдельными видами, но и среди представителей разных семейств пресноводных костистых рыб, а также выявлена корреляция между активностью ЛХЭ в мозге и БуХЭ в плазме. Впервые определен нормальный диапазон варьирования активности ЛХЭ и БуХЭ в органах широкого ряда пресноводных костистых рыб, принадлежащих к нескольким семействам. Продемонстрировано, что сезонные изменения активности ЛХЭ мозга рыб связаны не только с температурой окружающей среды, как у других пойкилотермных животных, но и с их б иол о піч ее ким репродуктивным циклом. Впервые показано участие холннергической системы и АХЭ в мозге при формировании пищевого поведения у рыб и установлен один из механизмов действия антнхолиюстеразных соединений на пищевое поведение рыб при хронической интоксикации ФОС. Впервые для рыб выявлено увеличение активности ЛХЭ в мозге при остром стрессе. Показано, что динамика активности ЛХЭ в мозге рыб in vivo при хроническом действии и после его прекращения веществ различной природы неантихолинэстеразного действия имеет стрессорный характер. Проанализирована взаимосвязь уровня активности АХЭ мозга и симптомокомплскса отравления и реабилитации при остром и хроническом действии ФОС на рыб. Впервые установлено, что чувствительность ЛХЭ и БуХЭ рыб к действию ФОС Іп vitro не является фактором, определяющим межвидовые различия в токсикорезнстептности рыб; разная скорость проникновения ФОС в организм и интенсивность их детоксикации играют основную роль в этом процессе.
Ih учи о -практическая значимость работы, На основании анализа и обобщения литературных данных и результатов собственных исследований лапы практические рекомендации по использованию ХЭ пресноводных
костистых рыб для оценки антропогенного загрязнения водных объектов ФОС к КС. При выполнении работы разработаны методы: энзнматичесхого определения ФОС в воде {пату і єно авторское свидетельство SU .№1359741 от 15.08.87, ГК НО СССР); определения эффективных концентраций в токсикологических опытах; определения ДДВФ в кроаи и печени рыб с использованием ГЖХ с электронно-захватным детектором (ЭЗД); метод раздельного определения активности ЛХЭ и БуХЭ в тканях рыб с , использованием селективного фосфорор тонического ингибитора ДДВФ, Материалы диссертации нашли практическое применение при обучении студентов в ряде Университетов в России и за рубежом d курсах «Экологическая физиология и биохимия», «Водная токсикология» и «Water Pollution and Fish Physiology».
-
В плазме (сыворотке) крови и печени пресноводных костистых рыб из сем. Cyprinidae наряду с ЛХЭ (КФ 3.1.1.7) присутствует БуХЭ (КФ 3.1.1.8), удельная активность которой преобладает в обшей активности ХЭ и ее уровень коррелирует с уровнем активности ЛХЭ в мозге.
-
ЛХЭ и БуХЭ рыб по ряду каталитических свойств отлігчаютея от «типичных» ЛХЭ и БуХЭ млекошггаютих.
-
Существуют закономерные сезонные, межвидовые и межсемейственные различия в активности ЛХЭ и БуХЭ в тканях пресноводных костистых рыб
-
Ингибированпс и восстановление активности ЛХЭ и БуХЭ является важным симптомом токсического действия ФОС на рыб, однако устойчивость рыб к этим токсикантам связана не только с угнетением ХЭ, но обусловлена и другими биохимическими и физиологическими факторами (поступление ФОС в организм и мощностью дегокснкационньїх. ферментных систем печени).
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты и положения работм доложены на: Всесоюзной конференции по водной токсикологии (Юрмала, 1982); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы рыбохозякственных исследований внутренних водоемов Северо-Запада Европейской части СССР» (Петрозаводск, 1984); Советско-американском симпозиуме «Проблемы водной токе нколоп ш, биотест про вания и управления качеством воды» (Борок, 1984); 1 Всесоюзном симпозиуме но чувствительности и устойчивости гидробионтов к токсикантам (Батуми, 1985); VI Всесоюзной конференции но экологической физиологии и
биохимии рыб (Вильнюс, 1985); 9-ом совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986); USA-USSR Symposium «Fate and effects of pollutants on aquatic organisms and ecosystems» (Athens, USA, 1987); 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Методы ихтио-токсикологических исследовании» (Ленинград, 1987); Всесоюзном'совещании «Поведение рыб» (Москва, 1989); VII Всесоюзной конференции «Экологическая физиология и биохимия рыб» (Ярославль, 1989); Международной конференции «(Методы исследования и использования гидроэкосистем» (Рига, 1991); II Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С-Петербург, 1991); VIII Научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992); VHI Confess of European Ichthyology Society «Fishes and their environment» (Ovideo, Spain, 1994); Международной конференции «Биологические ресурсы Вел ого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Пеірозлводск, 1995); 17 SETAC Annual Meeting (Washington, USA, 1996); 18 SETAC Annual Meeting. (San Francisco, USA, 1997); Симпозиуме no іюзрзспюй и экологической физиологии рыб (Борох, 1998); Международной молодежной школе «Бноиндикаішя-98» (Петрозаводск, 1998); Конференции «Проблемы охраны здоровья рыб в ахвакультуре» (Москва, 2000); Конференции «Озера холодных регионов» (Якутск, 2000); 1 lay1 шо-практической конференции «Проблемы биологии, химии, экологии и э коло піч ее кого образования» (Ярославль, 2001); Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002); 1Н (XXVI) Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера)) (Сыктывкар, 2003).
ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликованы 58 печатных работ (28 статей и 30 тезисов докладов)
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация изложена на #3«транииа.с машинописного текста н состоит in введения, обзора литературы, описания метопов и материалов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего f0 отечественных и О.'Ь'Ь иностранных источников. Работа иллюстрирована з5~таолішами и ; J рисунками.
Типы, их свойства, функции, локализация и идентификация
Холинэстеразы (ХЭ) - ферменты, широко распространенные в животном мире. Их обнаружение связано с одним из крупнейших достижений в биологии XX века -открытием химической природы синаптической передачи нервного импульса (Катц, 1968; Михельсон, Зеймаль, 1970; Бак, 1977). Наиболее раннее упоминание о ХЭ относят к 1914г. и связывают с именем сэра Генри Дэйла (Taylor, 1991), который один из первых предположил наличие в организме животных фермента, гидролизующего эфиры холина и карболовых кислот и активность которого может ингибироваться эзерином. В дальнейшем, исследованиями на изолированном сердце лягушки была показана медиаторная роль одного из этих эфиров - ацетилхолина (АХ), в процессе передачи нервного импульса (Loewi, 1921). Чуть позже из сердца лягушки был выделен специфический фермент, гидролизующий АХ (Loewi, Nawratil, 1926). Позднее, расщепляющий АХ фермент был обнаружен в сыворотке крови лошади и для его обозначения впервые предложен термин «холинэстераза» (Steadman et al., 1932). Впоследствии было установлено, что ХЭ в крови присутствует у разных животных и содержится не только в сыворотке, но и в эритроцитах (Stedman, Stedman, 1935). Исследование крови человека показало, что сывороточная ХЭ в отличие от эритроцитарного и ранее выявленного сердечного ферментов способна гидролизовать другой холиновый эфир — бутирилхолин (БуХ). Она получила название «псевдохолинэстераза» (Alles, Hawes, 1940). Последовавшие за этим многочисленные исследования продемонстрировали, что у млекопитающих присутствуют 2 типа ХЭ, которые по ряду свойств и распространению в организме животных существенно отличаются друг от друга. Для их обозначения ввели термины: эритроцитарная -"истинная ХЭ" и сывороточная - "псевдо-ХЭ" (Alles, Hawes, 1940; Mendel, Rudney, 1943; Augustinsson, 1948; 1949; Augustinsson, Nachmanson, 1949; Голиков, Розенгарт, 1964; О Брайн, 1964; Розенгарт 1973; 1974; Silver, 1974 и др.).
Интерес к изучению ХЭ значительно повысился после того, как в 30-40 гг была обнаружена высокая токсичность эфиров фосфорной и карбаминовой кислот для животных и показана их выраженная способность необратимо ингибировать активность ХЭ в низких концентрациях. Было установлено, что некоторые фосфорорганические соединения (ФОС) обладают выраженной селективностью по отношению либо к АХЭ, либо к БуХ, а карбаматное соединение (КС) эзерин является специфическим ингибитором в целом для ХЭ (О Брайн, 1964; Розенгарт, Шерсібитов, 1978; Chambers, Levi, 1992). Многочисленными исследованиями в последующие два десятилетия установлена ведущая роль необратимого угнетения ХЭ в токсическом действии ФОС и КС соединений на позвоночных животных.
Активное изучение природы взаимодействия ингибиторов и субстратов с ХЭ позволило в 50-60гт в общих чертах установить структуру активного центра этих ферментов и разработать схему их взаимодействия. Было показано, что и гидролиз субстратов и ингибирование при действии ФОС и КС на ХЭ проходит по единой схеме. В основе этого единства лежит структурное сходство данного типа ингибиторов с природными субстратами ХЭ (Brestkin, Rozengart, 1965; Кабачник и др., 1970; Садыков и др., 1976; Massoulie, Toutant, 1988; Sussman et al., 1991; Taylor et al, 1995; Моралев, Розенгарт, 1999). В 70-80гг. был обнаружен структурный полиморфизм ХЭ и показано существование глобулярных (G) и ассиметричных (А) форм обоих типов ферментов (Bon et al., 1979; Massoulie, 1980; Toutant, Moussolie, 1988; Chatonet, Lockridge, 1989; Taylor, 1991). В последние два десятилетия (80-90гг.) расшифрована первичная аминокислотная последовательность ХЭ и начаты исследования кодирующего их генома и трехмерной молекулярной структуры (Schumacher et al., 1986a,b; Lockridge et al., 1987; Doctor et ah, 1990; Sussman et al., 1991; Massoulie et al., 1992; Taylor, Radic, 1994; Bourne et al., 1999; Моралев, Розенгарт, 1999; Моралев 2000, 2001). В настоящее время, согласно номенклатуре ферментов, ХЭ отнесены к классу гидролаз, подклассу эстераз, подподклассу эстераз эфиров карбоновых кислот и соответствуют двум типам: ацетилхолинэстеразе (номенклатурное название "ацетилхолин-ацетилгидролаза", КФ 3.1.1.7) и холинэстеразе (номенклатурное название "ацилхолин-ацилгидролаза", КФ 3.1.1.8). Последняя представлена рядом ферментов, включая наиболее часто встречающуюся БуХЭ (Номенклатура ферментов, 1979). Поскольку исторически "холинэстеразами" называют все ферменты, относящиеся к обоим типам, термин "холинэстераза 1 рекомендовано использовать как групповой, а "ацетилхолинэстераза" (АХЭ) и "бутирилхолинэстераза" (БуХЭ) - для обозначения ферментов КФ 3.1.1.7 и КФ 3.1.1.8 соответственно (Silver, 1974; Розенгарт, Шерстобитов, 1978). В дальнейшем изложении мы будем придерживаться данной рекомендации. АХЭ и БуХЭ значительно отличаются друг от друга по многим признакам, благодаря чему их можно раздельно выявлять и количественно определять. Основные свойства ХЭ приведены в табл.1. Таблица 1 Основные отличительные свойства АХЭ и БуХЭ (по: Голиков и Розенгарт, 1964; О Брайн, 1964; Silver, 1974; Козловская и Чуйко, 1979) Указанные свойства ХЭ изучены на примере ферментов, которые принято считать "типичными". Это АХЭ эритроцитов человека и крупного рогатого скота, мозга млекопитающих, электрического органа рыб и БуХЭ плазмы крови человека и лошади. В большинстве случаев ХЭ другого происхождения на основании изучения их свойств могут быть отнесены к одному из этих двух типов. Однако ХЭ разных животных не обладают абсолютной идентичностью с типичными ферментами и включают в себя множество молекулярных форм, различающихся по тканевой и видовой специфичности.
Вместе с тем, у некоторых животных встречаются такие формы ферментов, которые не могут быть с достаточной определенностью отнесены к АХЭ или БуХЭ. Примером служат ХЭ мозга и сыворотки крови птиц, плазмы черепахи, мышц камбалы, мозга морской рыбы-хирурга (Augustinsson, 1961; Lundin, 1967, 1968; Бресткин, Пархоменко, 1971; Августинссон, 1972; Бресткин и др., 1983; Leibel, 1988а-с).
Отличительной особенностью ХЭ является их способность необратимо ингибироваться ФОС и КС. Молекулярные механизмы взаимодействия антихолинэстеразных ингибиторов с ХЭ изучены достаточно полно (Голиков, Розенгарт, 1960; 1964; О Брайн, 1964; Бресткин и др., 1965; Aldridge, Reiner,1969; 1972; Оддридж, 1972; Фукуто, 1972; Silver, 1974; Садыков и др., 1976; Фрейдлин и др., 1977; Розенгарт, Шерстобитов, 1978; Froede et al., 1986; Chambers, Levi, 1992). В общем виде взаимодействие этих соединений с ферментами, так же как и природных субстратов, представляет собой реакцию ацилирования (для ФОС - фосфорилирования, для КС -карбомилирования). В обоих случаях связывание происходит с остатком серина в эстеразном центре молекулы ХЭ (Олдридж, 1972).
Действие естественных экологических факторов и физиологических состояний
Зависимость динамики активности ХЭ рыб от изменений температуры окружающей среды изучена только для АХЭ мозга. Установлена положительная корреляция между этими показателями (Baslow, Nigrelli, 1964; Hazel, 1969; Edwards, 1971a,b; Hogan, 1971a). К примеру, у горчака Rhodeus amarus, адаптированного к 29С, активность фермента на 60% выше, чем у адаптированного к 10С (Hauss, 1975). С изменением температуры воды меняется также и спектр изоформ АХЭ. При этом ферменты различных видов рыб, обитающих в одинаковых температурных условиях, часто сильно отличаются по температурному оптимуму (Baldwin, Hochachka, 1970; Guillon, Massoulie, 1970; Niemierko et al., 1977). Скачкообразные изменения температуры среды приводят к повышению активности АХЭ рыб. Так, в мозге карпа наблюдали активацию фермента при резком увеличении температуры воды (Jurkowski et al., 1979).
Резкое снижение содержания кислорода в воде приводит к изменению активности ХЭ рыб. При острой гипоксии у погибающих окуней активность АХЭ мозга снижалась на 70-90% по сравнению с контролем (Маляревская, 1979). При сублетальной гипоксии активность АХЭ в мозге плотвы через 1 сутки снижалась на 23%, затем повышалась на 19% над контрольной и в последующие 10 суток практически не изменялась. У окуня проявлялась сходная реакция (Павлов, 1992).
Лабораторные эксперименты показали, что резкое изменение кислотности воды вызывает повышение активности АХЭ мозга рыб. Так, снижение рН воды с 8.1 до 4.5, не сопровождавшееся гибелью окуней, вызывало увеличение активности фермента до 121 и 114 %% от контроля на 1 и 3 сутки соответственно. Через 7 суток пребывания рыб в закисленной среде показатель возвращался к норме. При хроническом действии низких рН активность фермента оказывается ниже нормальной (Павлов, 1992). Кроме непосредственного действия на рыб, снижение рН воды приводит к повышению биодоступности ионов различных металлов (LaZerte, 1986; Spry, Wiener, 1991), которые также вызывают изменения активности ХЭ рыб (Christensen, 1975; Olson, Christensen, 1980; Немчок и др., 1986; Nemcsok et al., 1984,1986; Vig et al., 1987; Герасимов и др., 1989; Павлов и др., 1990; Baatrup, 1991; Павлов, Чуйко, 1992; Чуйко и др., 2001).
Уровень активности ХЭ рыб зависит также от концентрации минеральных солей в воде. Сублетальное резкое изменение солености воды вызывает и у эвригалийных (мозамбикская тиляпия), и у стеногалийных (окунь) видов временное повышение активности АХЭ мозга После завершения процесса адаптации рыб (7-15 суток) активность фермента возвращается к норме. При летальной смене солености воды активность АХЭ резко снижается (Павлов, 1992).
Циркадные и циркальные ритмы ХЭ у рыб. Активность ХЭ тканей рыб не постоянна в течение суток. Так, у белого толстолобика Hypophthalmichthys molitrix выявлена четкая циркадная динамика активности АХЭ в большинстве отделов ЦНС, связанная с функциональной активностью и биологическими ритмами данного вида. Максимальная активность фермента отмечена в ночные и утренние часы, а к 15 ч зафиксировано ее снижение, особенно выраженное в мозжечке (на 36-38%), среднем (на 24-26%) и продолговатом мозге (на 13-36%). Воздействие экстремальных раздражителей нарушает циркадную ритмику, вызывая значительные сдвиги активности АХЭ в большинстве отделов ЦНС, степень выраженности которых зависит от природы и продолжительности стрессорного воздействия (Хайдарлиу и др., 1984; 1985).
Циркальные ритмы активности ХЭ рыб изучены недостаточно. Исследования выполнены всего на АХЭ мозга некоторых субтропических видов (Hazel, 1969; Baslow, Nigrelli, 1961; Hogan, 1970; Edwards, 1971a,b) и двух европейских пресноводных: окуне (сем. Percidae) и плотве (сем. Cyprinidae) (Чуйко, Козловская, 1989; Чуйко, Павлов, 1992; Chuiko et al., 1997). Наивысшая активность фермента у тешгаводных рыб совпадает с периодом максимальных температур воды (Baslow, Nigrelli, 1961; Edwards, 1971a,b). У окуня и плотвы при характерных сезонных изменениях, положительно коррелирующих с изменениями температуры среды, максимальные значения показателя приходятся на период размножения, не совпадающий с временем наивысшей температуры воды (Чуйко, Козловская, 1989; Chuiko et al, 1997). Нерест является чрезвычайно стрессовым событием для рыб, поскольку активность нейросекреторной системы интенсифицируется и уровни гормонов, таких как адреналин, высоки (Шульман, 1972). Вызванный адреналином стресс также увеличивает активность АХЭ и содержание ВРБ в мозге рыб (Pavlov et al, 1994). У мозамбикской тиляпии Oreochromis mossambicus, наряду с температурозависимым повышением активности фермента, переход рыб в нерестовое состояние характеризуется значительным повышением активности АХЭ мозга (Pavlov, 1994а). После введения индуцирующего нерест лютеинизирующего гормона зафиксировано увеличение активности АХЭ в каудальной нейросекреторной системе у японского вьюна Misgumus anguillicaudatus (Xu Genxing et al., 1989). Таким образом, во время нереста в мозге рыб наблюдается увеличение активности АХЭ. Данные об изменениях активности ХЭ в других органах рыб в течение года, динамике БуХЭ в тканях отсутствуют.
Влияние физиологических состояний. Изменение активности ХЭ в тканях рыб происходит в результате различных стрессирующих манипуляций и состояний. Иммобилизация приводит к активации АХЭ в мозге карпа Cyprinus carpio (Jurkowski et al., 1979). В условиях транспортировки наблюдали снижение активности АХЭ в мышечной ткани молоди осетровых рыб и белорыбицы Stenodus leucichthys (Кычанов и др., 1986). У белого толстолобика Hypophthalmichthys molitrix отлов и хэндлинг с последующей транспортировкой вызывали угнетение активности ХЭ во всех отделах ЦНС и большинстве внутренних органов. После хэндлинга активность ХЭ сердца также снижалась, хотя отлов и транспортировка приводили к увеличению показателя. В печени, напротив, хэндлинг сопровождался повышением, а отлов и транспортировка - снижением активности фермента. (Хайдарлиу и др., 1987; Крепис и др., 1989). К сожалению, из этих работ не ясно, приводят ли указанные воздействия к гибели рыб. Не описана и динамика активности ХЭ. Влияние подобных воздействий на ХЭ рыб показано также в ряде других работ (Strange et al., 1977; Pickering et al., 1982; Thomas, 1984; Лега, 1990; Шубин, 1990).
Активность АХЭ тканей рыб снижается при их голодании (Кычанов и др., 1986). Уровень общей активности ХЭ сыворотки крови разводимой в искусственных условиях семги Salmo salar практически в 2 раза ниже, чем у диких особей из естественной среды обитания (Шубин, 1990).
Электрофоретическое разделение и идентификация типов ХЭ в сыворотке крови рыб
Выше было отмечено, что согласно принятой на сегодня классификации ферментов (Номенклатура ферментов, 1979) ХЭ входят в группу ферментов, относящихся к подподклассу эстераз или гидролаз эфиров карбоновых кислот (ЭКК; КФ З.1.1.). Среди них есть как специфические, гидролизующие природные субстраты (ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза, фосфолипазы, холестеролэстераза и др.), так и неспецифические эстеразы (карбоксилэстераза, арилэстераза, ацетилэстераза и др), которые обнаруживаются по субстратам, не встречающимся в природе - эфирам фенола или нафтола. Известно, что ЭКК присутствуют во многих органах и тканях животных и при этом могут гндролизовать одни те же субстраты (Суринов, 1977; Шубин, Ефимцев, 1981).
В связи с изучением ХЭ особый интерес представляет группа ЭКК, которые называют неспецифическими эстеразами (НЭ). Среди них наиболее известные карбоксилэстераза (КЭ; гидролаза эфиров карбоновых кислот, КФ 3.1.1.1; алиэстераза, эстераза В, атропинэстераза и др.; имеет широкий спектр гидролизуемых субстратов), арилэстераза (АрЭ; гидролаза арил-эфиров, КФ 3.1.1.2; эстераза А, параоксонэстераза; действует на многие эфиры фенолов и некоторые ФОС), ацетилэстераза (АцЭ; ацетилгидролаза эфиров уксусной кислоты, КФ 3.1.1.6; эстераза животных тканей; широкий спектр эфиров уксусной кислоты). НЭ присутствуют во многих органах и тканях различных видов животных, включая рыб, совместно с ХЭ и спектры гидролизуемых ими субстратов часто перекрываются с ХЭ. В таких случаях для идентификации эстераз используют набор специфических ингибиторов и субстратов (Simonarson, Wats, 1969; Брик и др., 1977; Шубин, Ефимцева, 1981, 2000; Walker, Thompson, 1991; Straus, Chambers, 1995). АХЭ является наиболее высоко специализированным представителем ЭКК. Она гидролшует эфиры холина преимущественно с короткой цепью в ацильной части (АХ, МеХ и ПрХ) и среди них с наибольшей скоростью чаще всего АХ, а БуХ и БзХ практически ею не разрушаются. Избирательным субстратом для АХЭ служит МеХ. Избыток субстрата тормозит активность АХЭ. Для БуХЭ характерна меньшая субстратная специфичность и спектр ее субстратов шире. Среди ацилхолинов предпочитаемым субстратом для нее является БХ, а ПрХ и АХ гидролизуются, но более медленно. БуХЭ способна гидролизовать и другие эфиры холина, а также нафтола и индоксила. Негидролизуемым субстратом для БуХЭ служит МеХ. Эффект субстратного торможения для нее отсутствует. Активность обоих типов ХЭ ингибируется эзерином (или прозерином) в концентрации 10-5 М и низкими концентрациями (10-6 - 10-8М) ФОС, которые взаимодействуют с сериновым остатком в активном центре фермента. Тиоловые соединения, такие как р-хлормеркурий бензоат (ПХМБ) на нее не действуют. КЭ, как и другие НЭ, выявляется по способности разрушать эфиры карбоновых кислот и нафтола или индоксила, мало эффективна в отношении эфиров холина. В связи с наличием в активном центре серинового остатка, ее активность также подавляется большинством ФОС, но КЭ устойчива к действию ПХМБ и эзерина при концентрации ингибиторов 10-ЗМ. АрЭ в отличие от КЭ гидролизуют еще и некоторые ФОС, устойчива к действию эзерина, но ингибируются ПХМБ. (Aldridge 1953a,b; Mounter, Wittaker 1953; Augustinsson 1961; van der Lande 1968; Simonarson, Wats 1969; Брик и др., 1977; Шубин, Ефимцева, 1981; Leibel 1988а; Walker, Thompson 1991 и др.).
Данные многих исследований на разных группах животных показывают, что разные типы ЭКК обладают различными величинами ОЭП: по мере уменьшения подвижности к аноду они располагаются в ряду АцЭ КЭ БуХЭ АХЭ (Шубин, Ефимцева, 1981; Leibel 1988а). Наиболее изучены эстеразы высших позвоночных (Суринов, 1977) и насекомых (Одинцов, 1972; Брик и др., 1977). Работы, выполненные на рыбах, в основном посвящены изучению неспецифических эстераз как генетических маркеров (Биохимическая..., 1973, 1979; Шубин и др., 2000)). Работы по идентификации ЭКК у рыб в целом, а пресноводных костистых в особенности, практически отсутствуют. К тому же основная часть имеющихся в этом направлении исследований выполнена несколько десятилетий назад. Об эстеразах крови рыб известно, что у 4 видов: губана (Labrus bergulla), щуки (Esox lucius), трески (Gadus callarias), угря (Anguilla anguilla) в плазме присутствуют КЭ и АХЭ, у морского скорпиона (Cottus scorpius) и скомберморуса (Scomber scomber) - только КЭ (Augustinsson, 1959,1961,1968; Hart, Cook, 1976; Straus, Chambers, 1995; Шубин и др., 2000). Оба эти эстеразы идентифицированы в сыворотке двух видов хариуса (Thymallus arcticus и Т. Thyinalus) (Шубин и др., 2000). У двух видов данио (Brachyodanio rerio и В. Albolineatus) в различных органах, исключая кровь, выявлены КЭ, ХЭ (тип не указан) и АрЭ, а также две эстеразы, не укладывающиеся в рамки существующей классификации (Hart, Cook 1976). У карпа (Cyprinus carpio) из ферментов, гидролизующих холиновые эфиры обнаружено только АХЭ (Gaal et al., 1980), которая присутствует и в мозгу (Брик 1969). В мозгу канального сомика (Ictalurus punctatus) и голубожаберного окуня (Lepomis macrochirus) эстеразная активность представлена АХЭ и КЭ (Knowles et al., 1968). В электрическом органе электрического угря (Electrophorus electricus) присутствуют в большом количестве АХЭ, в меньшей степени КЭ и в следовых количествах БуХЭ (Ecobichon, Israel 1967). Среди эстераз рыб ХЭ изучены несколько более подробно в связи с их особенностью необратимо ингибироваться ФОС и КС, и возможностью быть использованными в качестве биомаркеров действия этих соединений. По сложившемуся мнению у рыб в тканях доминирующее положение занимает АХЭ (Augustinsson, 1959,1961,1968; Lundin 1959; Ecobichon, Israel 1967; Hogan 1971a,b; Hogan, Knowles 1968a; Brestkin et al., 1973; Ferenczy et al., 1997), а БуХЭ, если и присутствует в незначительных количествах, то в основном в мышцах у морских и, в меньшей степени, у солоноватоводных видов (Lundin 1962, 1967, 1968). Наличие АХЭ, КЭ и АцЭ и отсутствие АрЭ выявлено в цельных гомогенатах целой рыбы и различных тканей у четырех морских видов из рода Acanthuras (рыбы-хирурги), обитающих в Карибском бассейне. У них же обнаружена нетипичная ХЭ, объединяющая в себе свойства АХЭ и БуХЭ БуХЭ (Leibel 1988а-с).
Изменение активности АХЭ в мозге окуня при остром стрессе, индуцированном введением адреналина
Оценка чувствительности ХЭ к действию in vitro различных ингибиторов, и в первую очередь ФОС, играет важную роль при сравнительной характеристике ферментов различного происхождения и локализации. При идентификации эстераз в сыворотке крови рыб было выявлено, что АХЭ и БХЭ различаются по чувствительности к ФОС хлорофосу. Однако, как было отмечено в предьщущем разделе, хлорофос сам по себе практически не способен ингибировать ХЭ. Антихолинэстеразное действие хлорофоса связано исключительно с продуктом его спонтанного гидролиза - ДДВФ (Розенгарт и др. 1978). Работ по сравнительному изучению чувствительности АХЭ и БХЭ рыб к ДДВФ практически нет. Имеются лишь единичные данные, полученные на ограниченном числе видов на АХЭ плазмы крови и мозга (Hogan, Knowles, 1968 a; Hogan 1971 a, b) Характеристика БХЭ крови рыб за исключением наших исследований и одной работы, выполненной коллективом авторов (Жуковский и др., 1994), фактически до настоящего времени не проводилась, поскольку данный фермент у рыб идентифицирован лишь сравнительно недавно (Козловская, Чуйко, 1979; Чуйко и др., 1983).
В связи с изложенным перед нами была поставлена задача провести сравнительный анализ чувствительности АХЭ мозга и сыворотки и БХЭ сыворотки представителей различных семейств рыб к действию ДДВФ in vitro.
Изучение ингибирования АХЭ мозга рыб ДДВФ показало, что чувствительность ферментов большого числа видов, относящихся к разным семействам, отличается незначительно (Табл.8).
Величины констант скорости ингибирования кц у веек исследованных видов имеет порядок 103 - 104 моль " л мин " . При этом большинство значений кл не имеет достоверных различий или эти различия незначительны, чтобы играть существенную роль в избирательной устойчивости. Несколько более высокая чувствительность отмечена для язя, уклейки (сем. Cyprinidae), щуки (сем. Esocidae) и ряпушки {сем Coregonidae). Величины ki і для них варьируют в пределах от 1.4x104 до 5,2х 104 моль"1 л мин " .
Различия между видами, наиболее отстоящими по величине ki і друг от друга (язь и густера) были лишь 17-кратными. Значения кп ферментов карпа, леща, синца, плотвы и окуня при действии ДЦВФ in vitro лежат в диапазоне (4.3 - 9.2) х 103 моль"1 л мин"1.
В доступной литературе имеется лишь две работы, выполненные при участии одного и того же автора, по изучению чувствительности АХЭ мозга трех видов рыб: ушастого окуня (Lepomis macrochirus), канального сомика (Ictaluras punctatus) и лосося Юіарка (Salmo clarki), оказалась очень близкой (Hogan, Knowles, 1968 a; Hogan 1971 а). К сожалению, в данных работах для оценки антихолинэстеразного действия ДЦВФ использована не константа кг, а показатель рЬо, величина которого зависит от времени игабирования. Данный показатель более корректно применять для оценки ингибиторов обратимого действия, а не для характеристики необратимых ингибиторов, каковыми являются ФОС [Розенгарт, Шерстобитов, 1973]. Этот факт затрудняет прямое сравнение полученных результатов. Тем не менее, учитывая взаимосвязь этих двух показателей [O Brien 1960; Розенгарт, Шерстобитов, 1973], мы рассчитали значения р15о из кг, приняв за расчетное время ингибирования 40 мин, которое используют авторы в названных работах. Получено хорошее соответствие значений рЬо для разных видов рыб между разными исследованиями: по нашим данным величина показателя варьировала от 5.3 до 6.5, по данным других авторов - от 5.6 до 6,3 [Hogan, Knowles, 1968а; Hogan 1971а].
Чувствительность к ДДВФ АХЭ крови была изучена на примере карпа, окуня и щуки, у которых в сыворотке присутствует лишь данный тип ХЭ (Чуйко и др., 1983; Желнин и др., 1998; Chuiko 2000; Chuiko et al., 2003). Значение k2 ДДВФ для этих видов составили соответственно 8.3х103, 7.ІХІ03 и 17.7x103 моль 1 л мин"1 (Табл. 8). Эти величины очень близки к тем, которые получены для АХЭ мозга данных видов. Сходная чувствительность АХЭ мозга и плазмы к ряду ингибиторов, включая ДДВФ, отмечена и для других видов рыб [Hogan 1971a,b; Hogan, Knowles, 1968a].
Полученные нами данные и результаты исследования других авторов свидетельствуют, что АХЭ, локализованная в мозгу и сыворотке (плазме) крови одного вида, практически идентична по чувствительности к ингибиторам in vitro. Межвидовые различия в чувствительности также незначительны.
Чувствительность БХЭ к ДДВФ была нами изучена на примере рыб из сем, Cyprinidae, у которых этот фермент присутствует в плазме и его активность значительно преобладает над активностью АХЭ (Табл. 8) (Козловская, Чуйко 1979; Чуйко и др., 1983; Желнин и др., 1998; Chuiko et al., 2003). Значения кг БХЭ для ДДВФ у этих видов варьировали в очень узком диапазоне от 1.0x107 до 2.5x107 моль 1 л мин 1. Из этого следует, что чувствительность БХЭ сыворотки (плазмы) крови более чем в 1000 раз выше по сравнению с АХЭ мозга и сыворотки крови рыб.
Сравнение чувствительности к ДДВФ холинэстераз рыб и млекопитающих показывает, что АХЭ у этих животных по данному показателю очень близки, в то время как чувствительность БХЭ рыб на два порядка выше, чем БХЭ млекопитающих. Так, значения кг для АХЭ из эритроцитов человека, мозга мыши, быка и крысы равняются соответственно 4.5 х 103, 3.5 х 103, 3.5 х 103 и 4.4 х 103 моль"1 л мин"1, а БХЭ сыворотки лошади - 3.9 х 104 моль"1 л мин"1 (Розенгарт и др., 1978). Факт высокой чувствительности БХЭ рыб к ДДВФ использован нами при разработке метода энзиматического определения ФОС в воде (Автор, свил, SU №1359741 А1. 1987; Козловская и др., 1996), а ДЦВФ предложен в качестве селективного ингибитора для раздельного определения активности АХЭ и БХЭ в тканях рыб, где они присутствуют совместно (Чуйко и др., 2002).
Таким образом, при изучении ингибирования ХЭ мозга и крови рыб ДЦВФ установлено, что чувствительность аналогичных типов ферментов в этих тканях одинакова. Показано, что АХЭ по чувствительности к этому ингибитору практически мало отличается от чувствительности АХЭ млекопитающих. В то же время, чувствительность БХЭ рыб выше более чем в 1000 раз по сравнению с АХЭ и более чем в 100 раз - по сравнению с БХЭ млекопитающих.
