Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 10
1. Проблема злокачественных новообразований и способы их лечения 10
Проблема злокачественных новообразований 10
Способы лечения раковых заболеваний 11
2. Лекарства адресного действия 12
Принцип адресной доставки лекарств 12
Использование антител в качестве молекул-носителей для адресной доставки лекарств 14
Использование белков, связывающихся с раковыми клетками, в качестве молекул-носителей для адресной доставки лекарств 15
3. Альфа-фетопротеин человека - его строение и функциональные свойства 18
Введение 18
Строение алъфа-фетопротеина человека 19
Функциональные свойства алъфа-фетопротеина человека 27
4. Ренатурация рекомбинантных белков 37
Причины агрегации рекомбинантных белков при экспрессии в
бактериальной системе 37
Общие представления о ходе сворачивания белковой молекулы 39
Общие представления о процессе ренатурации белков 41
5. Основные методы ренатурации рекомбинантных белков 43
Ренатурация методом разбавления 43
Ренатурация методом пульс-разбавления 43
Ренатурация методом диализа 44
Основные параметры условий ренатурации 44
6. Ренатурация белков, иммобилизованных на твердом носителе 45
П. Материалы и методы 51
1. Препаративные методы 51
Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерный АФП 51
Создание генно-инженерных конструкций для экспрессии вариантов С- концевого домена АФП 51
Продукция rAFP3D595 и rAFP3D609 55
Выделение и очистка ТВ, содержащих целевой белок, из клеток Е. coli... 56 Выделение и очистка rAFP3D595 и rAFP3D609 в денатурирующих условиях 57
2. Ренатурация rAFP3D595 и rAFP3D609 57
Ренатурация очищенного на Ni-смоле белка методом быстрого разбавления 57
Ренатурация очищенного белка методом диализа 58
Ренатурация белка, иммобилизованного на кремниевой металло-хелатной смоле 58
3. Аналитические методы 59
Масс-спектрометрия 59
Анализ АТ-концевой последовательности аминокислот белка 59
Определение свободных сулъфгидрилъных групп 59
Аналитическая хроматография 59
Круговой дихроизм (КД) 60
SDS-электрофорез в полиакриламидном геле 60
Определение концентрации белка 61
4. Исследование функциональных свойств rAFP3D595 и rAFP3D609 61
Конъюгирование rAFP3D595/rAFP3D609 с флуоресцентной метой 61
Клеточные линии 62
Анализ связывания и эндоцитоза rAFP3D595/rAFP3D6O9-0HTIJ в опухолевых клетках и лимфоцитах 62
Микроскопия 62
Конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином 63
Анализ цитотоксической активности конъюгата rAFP3D с цитостатиком в опухолевых клетках и лимфоцитах 63
III. Результаты и обсуждение 65
1. Клонирование и экспрессия вариантов С-концевого домена АФП 65
Экспрессия с помощью ИПТГ 68
Автоиндукция 69
2. Выделение и очистка ТВ 72
3. Ренатурация фрагментов С-концевого домена АФП 73
Ренатурация методом разбавления 74
Ренатурация методом диализа 75
Ренатурация фрагментов АФП на твердой фазе 76
Сравнениеренатурации методом разбавления и с помощью ІМАС 80
4. Физико-химический анализ ренатурированных фрагментов АФП 83
Подтверждение идентичности полученного целевого белка методом масс-спектрометрии 83
Анализ N-концевой последовательности фрагмента А ФП 84
Хроматографический анализ олигомерного состояния белка 84
Определение числа сулъфгидрилъных групп с помощью реактива Эллмана 88
Анализ вторичной структуры ренатурированных фрагментов методом КД 88
5. Анализ функционально свойств рекомбинантных фрагментов АФП 90
Распределение флуоресцентно меченных фрагментов АФП в экспериментах in vitro 90
Химическое конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином 93
Цитотоксическая активность конъюгата rAFP3D609-Cipro 96
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы 102
- Принцип адресной доставки лекарств
- Ренатурация методом диализа
- Ренатурация очищенного белка методом диализа
- Сравнениеренатурации методом разбавления и с помощью ІМАС
Введение к работе
Широко применяемым методом в противоопухолевой терапии является химиотерапия. Эффективность химиопрепаратов обеспечивается тем, что все они, в силу природы своего действия, особенно эффективно убивают активно делящиеся и метаболизирующие клетки. К сожалению, помимо опухолевых клеток, такими же характеристиками в норме обладают клетки костного мозга, желудочно-кишечного тракта и волосяных фолликул (Альберте Б. и др., 1993). Как следствие, весь спектр побочных эффектов от химиотерапии связан с воздействием препарата на нормальные активно делящиеся клетки организма.
Одним из перспективных способов повышения эффективности химиопрепаратов является их адресная доставка к опухолевым клеткам. Суть метода состоит в том, что химиоп-репарат пришивается к векторной молекуле, которая обеспечивает доставку лекарства к определенному виду клеток. Адресность доставки обеспечивается за счет специфических, характерных только для клеток мишеней молекул на их поверхности. В связи с этим в качестве векторной молекулы могут быть использованы моноклональные антитела (МоАТ), полученные к какой-либо молекуле на поверхности клетки мишени, либо белки, рецепторы которых должны присутствовать на поверхности клеток мишеней.
Одним из перспективных кандидатов, способных обеспечить адресность доставки лекарства является альфа-фетопротеин человека (АФП). АФП является белком, характерным для эмбрионального периода развития человека (Bergstrand C.G., Czar В., 1956). В постэмбриональный период развития этот белок начинает синтезироваться только в процессе канцерогенеза (Abelev G.I., 1971, Gillespie J.R., Uversky V.N., 2000). АФП проникает в клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза (Villacampa M.J. et al., 1984). Рецептор АФП (РАФП) так же является онкофетальным белком, т.е. в постэмбриональный период развития экспрессируется только на поверхности опухолевых клеток (Geuskens М. et al., 1991, Ницветов М.Б. и др., 2005). Этот факт позволяет использовать АФП как векторную молекулу для адресной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам. Показано, что конъюгаты природного АФП с цитостатиками ингибировали рост опухолевых клеток in vitro и in vivo (Ницветов М.Б., 2001, Severin S.E. et al., 1997, Северин СЕ. и др., 1999).
Использование природного АФП ограничено техническими и этическими причинами, так как его единственным источником является абортивный материал. По этой причине необходимо использовать его рекомбинантные формы. Известно, что участок связывания с рецептором находится в С-концевом домене, поэтому для целей адресной доставки является оптимальным использование рекомбинантных белковых фрагментов на основе С-концевого домена АФП (Mizejewski G.J., 2001).
Одной из главных проблем при использовании рекомбинантных белков является их получение в функциональной форме. В большинстве случаев, при продукции белков в больших количествах в бактериальной системе, они формируют в клетках так называемые тельца включения (ТВ), которые состоят из белка в агрегированном состоянии (Bowden G.A. et al., 2006, Ventura S., Villaverde A., 2006). Для получения функционально активного белка необходимо проводить процедуру его ренатурации. К сожалению, не существует универсальных и эффективных методик ренатурации. Это ограничивает круг рекомбинантных белков, используемых в производстве и научных исследованиях. Для гидрофобных белков с большим количеством дисульфидных связей эта проблема является особенно сложной. Именно такими характеристиками обладает С-концевой домен АФП. Разработка эффективной методики его ренатурации является основной трудностью при получении его в функциональной форме. Решение этой проблемы носит не только частный характер. Разработка, на примере АФП, общей методики ренатурации, подходящей для схожих по свойствам белков, позволит существенно расширить круг белков, получаемых с помощью рекомбинантных технологий в бактериальных системах экспрессии. В отношении АФП это позволит получать функциональный белок в достаточных количествах для создания его конъюгатов с цитостатиками, что само по себе также является сложной задачей.
Цель и задачи работы. Целью данной работы был отбор оптимальных фрагментов АФП для адресной доставки цитостатиков в опухолевые клетки, их эффективное получение и создание на их основе конъюгатов с модельными цитостатиками. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Отбор фрагментов АФП для адресной доставки цитостатиков в опухолевые клетки. Клонирование фрагментов и экспрессия с высокой эффективностью в бактериальной системе экспрессии.
Создание высокоэффективной методики выделения и получения функционально активного рекомбинантного фрагмента АФП.
Сравнительный физико-химический и функциональный анализ фрагментов АФП.
Получение конъюгата фрагмента АФП с отобранным цитостатиком. Проверка функциональной активности полученного конъюгата.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Два фрагмента АФП с 404 по 595 (rAFP3D595) и с 404 по 609 (rAFP3D 609) а.о. полноразмерного белка были клонированы и экспрессированы в виде телец включения в клетках E.coli с высокой эффективностью.
Отработана эффективная методика выделения и очистки белков и их ренатурация методом разбавления. Проведен сравнительный анализ эффективности процедур выделения и ренатурации разных фрагментов АФП.
Показано сходство исследованных физико-химических свойств ренатурированных рекомбинантных фрагментов и природного АФП.
На примере фрагмента АФП показана возможность эффективного способа ренатурации иммобилизованного на смоле гидрофобного, содержащего большое количество S-S связей белка.
Флуоресцентно меченный рекомбинантный фрагмент АФП in vitro проникал в опухолевые клетки, так же как и природный полноразмерный АФП. При этом в нормальные клетки он не проникал.
Получен конъюгат рекомбинантного фрагмента АФП с ципрофлоксацином, который подавлял рост опухолевых клеток in vitro в концентрациях по ципрофлоксацину значительно меньших, чем свободный цитостатик.
Научная новизна и практическая ценность работы. На основании анализа первичной структуры АФП и его модели пространственной структуры был отобран С-концевой домен белка, соответствующий третьему домену. Были клонированы и экспрессированы два варианта С-концевого фрагмента АФП в клетках Е. coli: с 404 по 595 а.о. (аминокислотных остатка) (rAFP3D595) и с 404 по 609 а.о. (rAFP3D 609) полноразмерного белка. Белки экс-прессировались в виде ТВ, т.е. в денатурированной форме.
Была отработана методика ренатурации с помощью быстрого разбавления в большом избытке ренатурирующего буфера. Выход белка составил не менее 50% с чистотой порядка 95%.
В качестве альтернативного метода ренатурации была выбрана ренатурация иммобилизованного на смоле белка. Для ренатурации рекомбинантных фрагментов АФП была использована металло-аффинная Ni-смола. Было показано, что выход ренатурированного белка сильно зависел от химической природы основы смолы: при переходе от агарозных оснований к оксиду кремния выход ренатурированного белка возрастал значительно. Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой не менее 98%.
При разработке методик ренатурации фрагментов особое внимание уделялось не только эффективности процедуры, но и ее продуктивности, т.е. потраченным времени и материалам на единицу ренатурированного белка. При сравнении этих характеристик ренатурация на смоле была значительно более продуктивна, чем ренатурация разбавлением.
Созданная методика ренатурации иммобилизованного белка на смоле на основе оксида кремния впервые обеспечила высокоэффективную ренатурацию сложного для сворачивания белка. Разработанный подход позволит расширить спектр рекомбинантных белков, используемых в научных исследованиях и в промышленном производстве.
Было показано, что фрагменты rAFP3D595 и rAFP3D609 in vitro проникали в клетки, несущие РАФП, также как и природный АФП. При этом в нормальные клетки организма они не проникали.
Была разработана методика получения конъюгата фрагмента АФП с ципрофлоксаци-ном, который in vitro подавлял рост опухолевых клеток в концентрациях на порядок меньше чем для свободного ципрофлоксацина и не влиял на рост нормальных клеток.
Полученные данные свидетельствуют о том, что С-концевой фрагмент АФП может быть использован в качестве векторной молекулы для адресной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам. Создание лекарств на его основе будет способствовать значительному повышению эффективности применяемых химиопрепаратов и позволит начать использовать новые не применявшиеся ранее.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на заседании ученого совета МНИИМЭ; на заседании ученого совета НБИКС-центра; на 12-ой Международной Пущинской Школе-Конференции Молодых Ученых в 2008 г.; на 16-ой Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» в 2008 г. (Москва); на 3-ей Научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» в 2009 г. (Москва); на 9-ой Курчатовской молодежной научной школе в 2011 г. (Москва).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 4 статьи, 4 тезиса сообщений и 3 российских патента.
Структура и объем работы
Принцип адресной доставки лекарств
Проблема злокачественных новообразований Вначале необходимо внести пояснения по поводу используемой терминологии. В англоязычной литературе термином «cancer» (рак) обозначаются все злокачественные новообразования. Согласно общепринятой в русском языке медицинской терминологии, под раком подразумевают только злокачественные новообразования из эпителиальной ткани. Злокачественные новообразования вообще обозначают термином злокачественная опухоль. Для простоты изложения в данной работе термины рак и опухоль будут использоваться для обозначения всех злокачественных новообразований.
Раковые заболевания характеризуются не регулируемым ростом и способностью проникать в отличные от места возникновения части тела [14]. Раковые клетки, в отличие от нормальных, могут не только проникать в окружающие опухоль ткани, но и с током лимфы и крови разноситься в другие органы и там давать начало новому злокачественному образованию, называемому метастазами [15, 16]. Выделяют две основные причины возникновения рака: влияние факторов внешней среды (диета, табачный дым, вирусы и т.д.) и генетическая предрасположенность [17-23]. Потенциально любая клетка организма, способная к делению, под влиянием этих факторов может переродиться в зло 11 качественную и дать начало раковому заболеванию. Перерождение осуществляется за счет выключения механизмов, регулирующих рост и развитие нормальных клеток [24].
Способы лечения раковых заболеваний
В настоящее время основными способами лечения рака являются: хирургическое удаление опухоли, лучевая терапия, химиотерапия. Стоит отметить, что в подавляющем большинстве случаев ни один из способов не может обеспечить полное удаление опухоли, и поэтому противораковая терапия представляет собой комплекс мероприятий. Остановимся подробнее на самых распространенных из них.
Хирургическое вмешательство. Хирургическое удаление опухоли может быть применено для всех плотных опухолей, если они невелики в размере, доступны для хирургического вмешательства и при отсутствии метастазов. Соответственно, гемобластозы (опухолевые заболевания кроветворной и лимфатической тканей) таким способом вылечены быть не могут. Данный вид опухолей является одним из самых распространенных и составляет 9,5% от всех вновь диагностируемых видов рака в США, а среди опухолевых заболеваний у детей до 5 лет на их долю приходится до 30% [25, 26]. При хирургическом удалении опухоли важно тщательно следить за тем, чтобы отдельные клетки опухоли не оставались в организме. Так как это достаточно сложно, то чаще всего хирургическое удаление опухоли комбинируют с химиотерапией. Опухоли на поздних стадиях развития, начавшие метастазировать, таким способом удалены быть не могут.
Лучевая терапия. Лучевая терапия может быть использована для лечения практически любого вида злокачественного образования, включая гемобластозы. Основные побочные эффекты при использовании радиотерапии связаны с повреждением нормальных клеток, находящихся в области воздействия излучения, и с попаданием в кровоток продуктов распада, образующихся при гибели клеток. Лучевая терапия не может быть применена в случае образования ме 12 тастазов, так как нельзя облучить все тело. Как и при хирургическом вмешательстве, лучевая терапия часто комбинируется с химиотерапией.
Химиотерапия. Действие любого химиопрепарата заключается в уничтожении клетки, в которую он попадает. В зависимости от природы химиопрепарата, он может модифицировать или повреждать ДНК, ингибировать использование метаболитов в процессе жизнедеятельности клетки, ингибировать митоз. Таким образом, химиопрепараты особенно эффективны в отношении интенсивно делящихся и активно метаболизирующих клеток. К сожалению, помимо раковых клеток, такими же характеристиками в норме обладают клетки костного мозга, желудочно-кишечного тракта и волосяных фолликул [1]. Весь спектр побочных эффектов от химиотерапии связан с воздействием препарата на нормальные активно делящиеся клетки организма. В связи с этим химиопре-парат не может быть использован в больших дозах, так как при этом вред здоровью от побочных эффектов превышает положительный терапевтический эффект химиотерапии. Помимо этого, клетки многих видов опухолей вырабатывают так называемую множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). МЛУ обеспечивается работой разных систем клетки, в частности активацией трансмембранных насосов, которые выводят из раковой клетки токсические вещества, попавшие в нее в результате эндоцитоза [27]. Как следствие, клетки перестают быть чувствительны к используемому для лечения химиопрепарату и, что еще хуже, эта устойчивость распространяется на другие вещества, различающиеся по химической структуре и механизму действия. Все это значительно снижает эффективность проводимой химиотерапии.
Ренатурация методом диализа
В качестве носителя для иммобилизации белков используют стандартные хроматографические смолы. Описанная Крейтоном методика состояла в иммобилизации белка на ионо-обменной смоле [200]. К настоящему моменту для ренатурации используют ионо-обменные, гидрофобные и аффинные смолы [201].
При использовании ионо-обменной или гидрофобной смол белок иммобилизуется за счет соответствующих участков на белковой молекуле, которых может быть несколько. Возможно, за счет этого флуктуации полипептидной цепи в процессе сворачивание могут быть ограничены, что может являться недостатком данной методики.
Использование аффинных смол позволяет иммобилизовать белок за счет специфического участка в конце или начале молекулы, присоединенного за счет генно-инженерного конструирования. Самым распространенным приме 47 ром является присоединение к рекомбинантному белку последовательности из 6-7 остатков гистидина. Такой белок можно иммобилизовать на металло-аффинной смоле. При таком варианте иммобилизации полипептидная цепочка может свободно шевелиться в процессе сворачивания. Еще одним преимуществом ренатурации белков, иммобилизованных на металло-аффинной смоле, является возможность за один этап произвести очистку и ренатурацию белков [202-205].
При ренатурации иммобилизованных белков важным фактором, влияющим на выход свернутого белка, является нагрузка смолы. В том случае, если на смолу нанесено столько белка, что его молекулы начинают с достаточно высокой частотой взаимодействовать друг с другом, выход ренатурации может уменьшаться за счет агрегации белков на смоле. В работе Rudolph et al., посвященной ренатурации иммобилизованной на аффинной смоле альфа-глюкозидазе, было показано, что при нагрузке смолы белком более чем 5 мг/мл выход ренатурированного белка драматически падал. Авторы предположили, что в данном случае сворачивание индивидуальных полипептидных цепей оказывалось под влиянием соседних молекул. Примерные расчеты показали, что при нагрузке смолы 5 мг/мл, белок занимает примерно 50% поверхности носителя. Не смотря на ограничения по концентрации белка на смоле, при ренатурации иммобилизованного белка максимальный выход достигался при его концентрации на три порядка выше (5 мг/мл), чем при ренатурации разбавлением (5 мкг/мл) [206].
Еще одним важным фактором, влияющим на выход ренатурации, является способ нанесения белка на смолу. В случае если смола упакована в колонку, при нанесении белка его локальная концентрация в начале колонки может быть слишком высока. В этом случае, при переведении белка в ренатурирующий буфер, в месте повышенной концентрации, может происходить агрегация белковых молекул, и, как следствие, уменьшение выхода ренатурированного белка. Данная проблема может быть решена с помощью нанесения белка небольшими порциями, между которыми осуществлять промывку смолы денатурирующим буфером для равномерного перераспределения белковых молекул по колонке [205]. В этом случае возникает необходимость затратить больше времени и средств, чем при простом нанесении на колонку. В качестве альтернативы, можно наносить белок на смолу в растворе, затем упаковывать последнюю в колонку и проводить дальнейшие манипуляции. При таком подходе белок должен также распределяться по смоле равномерно. Это не потребует дополнительного времени и средств.
Несомненно, возникает вопрос о влиянии сорбента на процесс сворачивания иммобилизованного белка. Для проверки этого в разных работах проводилась ренатурации одного и того же белка с использованием разных сорбентов. Например, в работе Rudolph et al. для ренатурации использовали аффинные смолы с матрицей на основе агарозы. Было показано, что выход ренатурации не зависел от типа используемой смолы. В качестве контроля проводили ренату-рацию того же белка, не содержащего последовательности, обеспечивающей связывание со смолой, в присутствии смолы. Было показано, что присутствие смолы само по себе не увеличивало выход ренатурированного белка. Следовательно, именно разделение белковых молекул за счет их иммобилизации на смоле в процессе ренатурации способствовало повышению выхода процесса [206].
Основой большинства матриц, используемых в хроматографии, являются углеводы (сахароза, декстроза, агароза). Все они представляют собой не инертные вещества. В случае ренатурации маленьких гидрофильных белков, которые очень часто используются в качестве модельных белков, этот факт может играть не существенную роль в процессе сворачивания [206]. В случае больших гидрофобных белков с большим количеством дисульфидных связей основа матрицы может оказывать большое значение. В процессе сворачивание такие белки могут необратимо связываться с носителем за счет гидрофобных взаимодействий или реакций SH-группы цистеинов. Все это может существенно понижать выход ренатурированного белка. Использование матриц на более инертной основе, например, оксид кремния, возможно, было бы более приемлемо для ренатурации больших гидрофобных белков с большим количеством дисульфидных связей.
Процесс ренатурации иммобилизованного белка может происходить как за счет градиентного уменьшения концентрации денатурантов, так и резкой сменой денатурирующего буфера на ренатурирующий. Опять же для каждого отдельного белка может быть более предпочтителен тот или иной способ. Помимо этого, до начала ренатурации, можно промывать смолу соответствующими буферами, для удаления примесных белков.
Ренатурированный белок может быть элюирован со смолы в достаточно высокой концентрации, что является отличным заделом для дальнейших манипуляций с ним. Ренатурация с помощью хроматографии привлекательна еще и тем, что она может быть легко автоматизирована и позволяет за одни шаг производить очистку и ренатурацию белков. Это особенно важно для разработки коммерчески выгодной методики получения белков в крупных масштабах.
В заключение нужно подчеркнуть, что до сих пор подавляющее большинство работ по ренатурации иммобилизованных белков носило модельный характер, поскольку они делались с легко сворачивающимися небольшими белками. Примеров эффективной ренатурации сложно-сворачиваемых белков фактически нет, хотя в последние годы ренатурация иммобилизованных белков стала широко исследуемой альтернативой для сложно-сворачиваемых белков. Этот подход особенно перспективен для белков с высокой склонностью к агрегации [201].
Ренатурация очищенного белка методом диализа
Принято считать, что при ренатурации белка на смоле, упакованной в колонку, увеличение количества наносимого белка коррелирует с уменьшением выхода ренатурации из-за большей агрегации белковых молекул [206]. Причиной этого может быть неравномерное распределение белковых молекул на колонке в процессе нанесения. Локальное повышение концентрации белка в какой-либо части колонки может способствовать его агрегации при переводе в ренатурирующие условия и тем самым уменьшать выход ренатурированного белка. Нами было изучено влияние количества нанесенного на смолу белка на выход ренатурации. Разные количества белка (0,5 - 10,0 мг) наносили на один и тот же объем смолы (1мл, в инструкции производителя заявленная емкость смолы составляет 15 мг/мл) и ренатурировали при одинаковых условиях. Выход ренатурации не зависел от количества нанесенного белка в исследуемом диапазоне и составлял -100%. Такой результат можно объяснить тем, что при взаимодействии белка со смолой в пробирке его распределение происходит более равномерно, чем при нанесении на смолу, упакованную в колонку. Как следствие, выход ренатурации не зависел от количества нанесенного белка.
Сравнение ренатурации методом разбавления и с помощью IMAC В результате работы были разработаны две методики ренатурации фрагментов С-концевого домена АФП, обеспечивающие достаточно высокий выход ренатурированного белка (60 % и -100 % для ренатурации разбавлением и с помощью IMAC соответственно). Для сравнения этих двух методик и отбора максимально эффективной был проведен контрольный эксперимент по ренатурации одного и того же количества белка (1 мг) разными способами. Выходы белка при ренатурации на твердой фазе и разбавлением составляли -100% и 50%, соответственно. Основные различия заключались в необходимом времени ренатурации и количестве ренатурирующего буфера (табл. 4). В работе Chen было предложено оценивать продуктивность ренатурации по следующему уравнению: где P - продуктивность ренатурации (мг мл"1 ч"1), Y- выход ренатурированного белка (%), М - исходное количество белка, взятого для ренатурации (мг), V -объем ренатурирующего буфера (мл), t - время ренатурации (ч) [215]. Таким образом, данный критерий отражает не только процентный выход белка, но и связанные с этим затраты буфера и времени.
Определяли денситометрией электрофореграмм с помощью программы OnedScan ("Stratagen", США). Рассчитанная по данной формуле продуктивность для ренатурации разбавлением составила ІхІО"4 мг мл"1 ч"1, для ренатурации на твердой фазе -2,5x10"2 мг мл"1 ч"1. Значительное превосходство продуктивности ренатурации на твердой фазе по сравнению с ренатурацией разбавлением связано с меньшим временем инкубации и меньшим объемом ренатурирующего буфера (табл. 4). При этом чистота белка после ренатурации на твердой фазе (98%) была выше, чем при ренатурации разбавлением (90%). После ренатурации методом разбавления требуется производить концентрирование белка для дальнейшей работы, при этом происходят его дополнительные потери. Одним из недостатков методики ренатурации на Ni-смоле является необходимость удалять имидазол, который используется для элюции, из образца белка. Эта процедура может быть осуществлена с помощью гель-фильтрации. Однако, некоторые гидрофобные белки, в частности фрагменты АФП, в ренатурированном состоянии при обес-соливании связываются со смолой, что значительно влияет на конечный выход белка. Избежать этого можно за счет того, что белок с Ni-смолы может быть элюирован в достаточно высокой концентрации. При разведении его до рабочих концентраций сниженное содержание имидазола уже не влияет на функциональные свойства белка.
В работе Chen and Leong, посвященной ренатурации иммобилизованного на ионообменной смоле полноразмерного АФП (на колонке и в пробирке), рассчитанная продуктивность находилась в диапазоне 2,5х10"3 -1,4х10"2 мг мл"1 ч"1. Выход ренатурированного полноразмерного АФП составлял 15-42%. Эти параметры принципиально близки к полученным нами [215].
Взятые вместе, результаты свидетельствуют о том, что ренатурация С-концевых фрагментов АФП, иммобилизованных на смоле, по продуктивности значительно превосходит ренатурацию методом разбавления. Данный способ ренатурации впервые применен с высокой эффективностью для гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей. Как было показано, основа смолы имела огромное влияние на эффективность процедуры. Использова 83 ниє смолы на основе оксида кремния, вместо традиционно используемых смол, позволило значительно улучшить эффективность ренатурации (от практически О до -100%).
Разработанная методика ренатурации иммобилизованного белка на примере фрагментов АФП впервые продемонстрировала возможность высокоэффективной ренатурации гидрофобного белка с большим количеством дисуль-фидных связей. Ключевым критерием, определившим эффективность рефол-динга, было использование относительно инертного носителя (силикагеля) в качестве твердой фазы. Данный подход может быть с успехом применен для белков с похожими характеристиками, ренатурация которых в настоящий момент лимитирует использование их рекомбинантных форм в научной и прикладной областях.
При проведении процедур по ренатурации С-концевого фрагмента АФП было отмечено, что ренатурированный фрагмент rAFP3D609 более устойчив в растворе по сравнению с rAFP3D595.
Физико-химический анализ ренатурированных фрагментов АФП Подтверждение идентичности полученного целевого белка методом масс-спектрометрии Анализ проводили с помощью масс-спектрометрии по методу MALDI. В ходе анализа обоих рекомбинантных фрагментов были идентифицированы 9 пептидов третьего домена АФП. Значение вероятности нахождения указанных пептидов составляет 70 и является максимальным и единственно значимым в ходе проведенного анализа. Значимыми являются значения выше 65 (р 0,05). В соответствии с принятыми критериями, целевой белок идентифицирован как фрагмент АФП.
Сравнениеренатурации методом разбавления и с помощью ІМАС
Таким образом, фрагмент АФП в конъюгате обеспечил эффективную и адресную доставку ципрофлоксацина в раковые клетки, и конъюгирование не повлияло на биологические свойства ни белковой части, ни цитостатика.
Многообещающим результатом является то, что ципрофлоксацин в форме конъюгата с фрагментом АФП оказывал цитостатический эффект на раковые клетки в концентрациях на порядок меньше по сравнению со свободным ципрофлоксацином и не оказывал цитостатического эффекта на лимфоциты. Таким образом, отобранный рекомбинантный фрагмент АФП в форме конъюгата обеспечивал специфическую доставку цитостатика к раковым клеткам in vitro. Заключение
Нуклеотидная последовательность, кодирующая третий домен АФП, была оптимизирована для экспрессии в бактериальной системе. Были созданы две плазмиды для экспрессии двух фрагментов АФП на основе третьего домена. Уровень индукции белка составил от 150 до 250 мг с литра культуры при разных способах индукции. Была разработана эффективная методика ренатурации белка методом разбавления, с итоговым выходом мономерной формы не менее 50% с чистотой 95%. Была разработана высокоэффективная методика ренатурации иммобилизованного на металло-хелатной смоле фрагмента АФП. Данный способ ренатурации впервые применен с высокой эффективностью для гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей. Использование смолы на основе силикагеля, вместо традиционно используемых агароз-ных смол, позволило значительно улучшить эффективность ренатурации (от практически 0 до —100%). Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой 98%. Ренатурация белка на твердой фазе по продуктивности на два порядка превосходила ренатурацию методом разбавления. В экспериментах на клеточных культурах in vitro было показано, что по своим функциональным свойствам, т.е. способности связываться с рецептором на поверхности клеток и проникать внутрь, ренатурированные обоими способами фрагменты не уступали нативному полноразмерному АФП.
Была разработана методика конъюгирования фрагмента rAFP3D609 с ципрофлоксацином. ІС50 ципрофлоксацина в форме конъюгата (50 мкМ) была в 20 раз меньше, чем для свободного цитостатика ( 1000 мкМ) по отношению к раковым клеткам. Таким образом, отобранный фрагмент АФП в форме конъюгата обеспечивал специфическую доставку цитостатика к раковым клеткам. Процедура конъюгирования не повлияла на биологические свойства ни белкового фрагмента, ни цитостатика.
Подытожив вышесказанное, можно заключить, что отобранные в данной работе фрагменты АФП являются перспективными носителями для адресной доставки цитостатиков к раковым клеткам. Конъюгат фрагмента АФП с цито 99 статиком ципрофлоксацином как модельного объекта продемонстрировал перспективность дальнейшей разработки и исследования лекарств адресного действия на основе фрагментов АФП.
1. Получены штаммы-продуценты Е. coli BL21 (DE3) для получения двух вариантов С-концевого домена АФП: соответствующий структурному С-концевому домену (с 404 по 595 а.о. - rAFP3D595) и дополнительно содержащий не структурированный С-конец белка (с 404 по 609 а.о. - rAFP3D609).
2. Разработана эффективная методика ренатурации рекомбинантных фрагментов rAFP3D595 и rAFP3D609 методом быстрого разбавления. Выход ренатурированного белка составил не менее 50% с чистотой порядка 95%.
3. Впервые показана возможность высокоэффективной ренатурации гидрофобного белка с большим количеством дисульфидных связей, иммобилизованного на металло-хелатной смоле. Выход ренатурированного белка составил порядка 100% с чистотой не менее 98%. Продуктивность ренатурации иммобилизованных фрагментов АФП на два порядка превышала продуктивность ренатурации методом разбавления.
4. Показано соответствие структур рекомбинантных ренатурированных фрагментов АФП и природного белка несколькими независимыми методами. Установлено, что ренатурированные фрагменты АФП представляют собой белки в форме мономеров. Показано, что все остатки цистеинов вовлечены в образование дисульфидных связей, как и в природном белке. Вторичная структура обоих фрагментов состоит преимущественно из а-спиралей и соответствует вторичной структуре нативного полноразмерного АФП.
5. Показано, что оба фрагмента АФП связывались и подвергались рецептор-опосредованному эндоцитозу линией опухолевых клеток, несущих РАФП, и не проникали в нормальные клетки, не несущие РАФП (лимфоциты периферической крови человека). По способности проникать в клетки они были близки к природному АФП.
6. В экспериментах на клеточных культурах показано, что конъюгат фрагмента АФП с ципрофлоксацином подавлял рост раковых клеток в концентрации на порядок меньше, чем свободный ципрофлоксацин (1С5о 50 мкМ для конъюгата и 1000 мкМ для свободного ципрофлоксацина). Конъюгат оказывал специфический цитотоксический эффект именно на раковые клетки и, в отличие от свободного ципрофлоксацина, не влиял на рост нормальных клеток.
