Содержание к диссертации
СОКРАЩЕНИЯ К ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ ДИССЕРТАЦИИ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА I - СЕШНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ ГРАНУЛОЩТОВ ЧЕЛОВЕКА И
МЛИТОПИТАЮЩИХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Ї. Выделение и очистка сериновых протеиназ грану
лоцитов человека и млекопитающих И
2. Свойства, аминокислотный и углеводный составы
и элементы первичной структуры сериновых проте
иназ гранулоцитов ,. 17
Субстратная специфичность сериновых протеиназ гранулоцитов 20
Ингибирование сериновых протеиназ гранулоцитов природными ингибиторами 36
5* Экзогенные ингибиторы протеиназ гранулоцитов как
терапевтические средства 45
б- Физиологическая и патогенетическая роль сериновых
протеиназ гранулоцитов 48
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Материалы * 52
2, Методы исследования
2-ї* Выделение гранулоцитов из крови человека, субклеточных фракций и протеиназ гранулоцитов
2ЛА* Выделение гранулоцитов из крови человека 53
2Л.2. Выделение субклеточных фракций гранулоцитов
человека 54
2.Ї.З. Хроматография протеиназ гранулоцитов на КСИ-
сефарозе 4В 54
Хроматография на sF-сефадексе С-50 элюата протеиназ гранулоцитов с КСИ-сефарозы 4Б 55
Фракционирование протеиназ гранулоцитов человека с помощью препаративного ИЭФ лизата гранулоцитов человека 55
2Л.6. Оценка относительных молекулярных масс про
теиназ гранулоцитов 55
Получение и определение активности частично очищенных препаратов низкомолекулярного кинино-гена человека 56
Оценка содержания плазминогена в частично очищенных препаратах низкомолекулярного кининоге-
на человека 57
Методы измерения активностей протеиназ гранулоцитов человека (кининогеназной, кининазной, фибринолитической, эстеразной, амидазной) 58
Определение активности урокиназы человека 62
Определение антитриптической активности КСИ-сефарозы 4В 63
Исследование влияния белковых и синтетических ингибиторов на протеиназы гранулоцитов 63
Кинетические методы исследования
2.8.Ї. Определение кинетических параметров Кш и V
взаимодействия протеиназ гранулоцитов с син
тетическими субстратами , 63
2.8.2. Определение &Q и ккат гидролиза брадикинина
кининазой гранулоцитов 64
2,8.3- Определение константы скорости ингибирования
(к.) протеиназ гранулоцитов под действием КСИ
из сыворотки крови кролика 64
Определение кинетических параметров к^ и к^ торможения ЛеОЗисАІаЛІай'о'їаІНЛ-амидазной активности эластазы гранулоцитов необратимым ингибитором KeOSucAlaAlaEroVelCI^Ol 65
Определение величин к, и К^ ингибирования ZGiyGiyAreftk-амидазной активности активатора плазминогена гранулоцитов под действием z&ly-GiyArsCH2ci 65
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУНДЕНИЕ
1. Фракционирование сериновых протеиназ гранулоцитов
человека
Ї. Субклеточная локализация сериновых протеиназ грану
лоцитов 67
Фракционирование протеиназ гранульной фракции гра~ нулоцитов с помощью аффинной хроматографии на КСИ-сефарозе 4В 72
Фракционирование протеиназ лизата гранулоцитов человека методом препаративного ИЭФ 78
П. Субстратная специфичность сериновътх протеиназ гранулоцитов человека, очищенных методом ИЭФ
Идентификация и расцределение активностей сериновых протеиназ гранулоцитов человека во фракциях» полученных после ИЭФ лизата клеток 80
Кинетический подход к изучению субстратной специфичности протеиназ гранулоцитов человека 83
Ш. Действие кислотостабильных ингибиторов - производ
ных интер~*^-ингибитора трипсина на сериновые протеи-
назы гранулоцитов человека 93
ІУ. Установление ферментной специфичности кининогеназы
гранулоцитов человека
Ї. Кинетика взаимодействия множественных форм протеиназ
гранулоцитов человека со специфическими ингибиторами
эластааы гранулоцитов и тканевых активаторов плазми-
ногена Ї02
Доказательство идентичности кининогеназы и трипсино-подобного активатора плазминогена гранулоцитов человека НО
Возможные способы участия активатора плазминогена гранулоцитов человека в кининогенезе 121
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125
ВЫВОДЫ 129
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131
СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ даССЕРТАЦИИ
ИЭФ - изоэлектрофокусирование
КСИ - кислотостабильный ингибитор
ЕК - брадикинин
ctj-ПИ ИоШТ
DS-Na - додецилсульфат натрия
И^ - относительная молекулярная масса
oU-ингибитор протеиназ (чСх-антитрипсин)
cU-антихимотрипсин
^о-макроглобулин
интер-^-ингибитор трипсина
мкг-экв- потенц, БК - мкг-эквивалент потенциального брадикинина мкг инакт. БК - мкг инактивированного брадикинина
- 7 ~
К «M - константа Михаэлиса ш *
К ,М - константа субстратная К. ,М - константа ингибирования равновесная V ,М-мин - скорость ферментативной реакции при насыщающей концентрации субстрата v ,М-мин - скорость реакции при данной концентрации субстрата кд _,с ~ константа скорости ферментативной реакции каталитическая к п,мин - константа скорости образования ковалентного комплек
са фермента с необратимым ингибитором ^ »мин - кажущаяся псевдомономолекулярная константа скорости
взаимодействия фермента с необратимым ингибитором к. ,М мин - бимолекулярная константа скорости реакции
Введение к работе
Последние годы характеризуются интенсивными исследованиями в области изучения свойств, субстратной специфичности и биологической роли сериновых протеиназ гранулоцитов человека и животных; проводятся активные поиски их эндо- и экзогенных ингибиторов.
Интерес к сериновым протеиназам гранулоцитов обусловлен многообразием их биологических функций. Помимо хорошо известного свойства этих ферментов обеспечивать внутриклеточную деградацию белков в процессе фагоцитоза, протеиназы гранулоцитов (эластаза, натепсин G , активатор плаэминогена и др.) в условиях секреции их в окружающую среду осуществляют ограниченный протеолиз важных белковых макромолекул, сопровождающийся активацией ферментных систем крови (кининовой, комплемента, свертывания, фибринолиза), клеток и соединительной ткани, а также нарушением функций ряда биологически активных компонентов этих систем (ингибиторов протеиназ - <т-ПИ, ^.т-АХТ, антитромбина Ш; анафилатоксинов СЗа и С5а, кининов и др.). Таким образом, генерируя и (или) инактивируя многие биологические эффекторы, сериновые протеиназы гранулоцитов как усиливают так и ограничивают развитие воспаления-
Эти факты указывают на необходимость направленной регуляции активности сериновых протеиназ гранулоцитов в норме и при патологии с помощью природных и синтетических ингибиторов. В связи с этим поиски эндо- и экзогенных ингибиторов протеиназ гранулоцитов, а также изучение механизма их регуляторных функций являются весьма актуальными для медицинской биохимии и практического здравоохранения.
Известно, что активность сериновых протеиназ гранулоцитов in vivo' регулируется природными ингибиторами: кислотолабильны-ми ингибиторами плазмы крови { сіт-ПИ, oU-AXT и ^о-МГ), кислото-
стабильными ингибиторами (производными 1Ш1Т , обнаруженными в плазме крови и моче, и местносинтезируемыми железами внешней секреции) и внутриклеточными ингибиторами протеиназ.
Наименее изучено влияние на сериновые протеиназы гранулоцитов КСИ - производных ИЛИТ
Одним из представителей группы КСИ - производных 1W1T , является КСИ из сыворотки крови кролика (ранее ТКСТЙ), впервые обнаруженный Г.С.Пасхиной и В.Ф,Нартиковой в Ї966 году и детально в последующем изученный в данной лаборатории (Нартикова и Пас-хина, 1969, Ї970, 1975; Оглоблина, Якубовская и др., 1975, 976, Ї983). Использование аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе 4В (Оглоблина, Якубовская и др., 1975, Ї976) открыло пути к получению КСИ из сыворотки крови кролика в достаточно большом количестве, что позволило изучить природу полиморфизма этого ингибитора, механизм его взаимодействия с трипсином и химотрипсином, а также установить аминокислотную последовательность в области реактивного центра ингибитора (Оглоблина и др., І975-Ї983). Наименее изученными оставались вопросы, связанные с пониманием физиологической роли КСИ - производных И*1ИТ
Настоящая работа является частью комплексных исследований по изучению химии и биологии КСИ - производных И<АИТ - Основной целью данной работы являлась разработка подходов к изучению противовоспалительной функции КСИ, заключающейся в торможении сериновых протеиназ гранулоцитов, играющих роль провоспалительных факторов. Исходя из этого, получали частично очищенные препараты сериновых протеиназ гранулоцитов человека с использованием аффинной хроматографии на КСИ из сыворотки крови кролика, иммобилизованном на сефарозе 4В, и препаративного ИЭФ и изучали ингибирова-ние сериновых протеиназ гранулоцитов под действием КСИ из сыворот-
ки крови кролика.
Учитывая важность кининогеназы гранулоцитов как генератора биологически активных пептидов» играющих значительную роль в развитии воспалительных реакций, - второй целью данной работы явилось установление ферментной специфичности кининогеназы на основании данных по субстратной специфичности и ингибиторному спектру сериновых протеиназ гранулоцитов человека.
