Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 16
1.1 Современные представления о механизмах развития хронического гломерулонефрита у человека 16
1.2 Роль нейтрофилов в развитии гломерулонефритов 19
1.2.1. Роль медиаторов воспаления в модуляции функций нейтрофильных гранулоцитов при гломерулонефрите 20
1.2.2. Рецепторы нейтрофильных гранулоцитов при гломерулонефрите 26
1.2.3. Элиминация иммунных комплексов из почечной ткани нейтрофильными гранулоцитами 33
1.2.4. Деструктивная роль нейтрофильных гранулоцитов в почечной ткани при гломерулонефрите 34
1.2.4.1 Окислительные механизмы поражения почечной ткани 35
1.2.4.2. Неокислительные механизмы поражения почечной ткани 37
1.2.5. Динамика инфильтрации почки нейтрофильными гранулоцитами при гломерулонефрите 38
1.3. Методы лечения гломерулонефрита, основанные на представлении об активном участии нейтрофильных гранулоцитов в патогенезе заболевания 39
2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Условия получения образцов крови и почечной ткани у больных хроническим гломерулонефритом 44
2.2. Иммунофлюоресцентные методы исследования почечного биоптата 47
2.3. Иммунохимические методы исследования сыворотки крови 48
2.3.1. Определение уровня комплемента в сыворотке крови гемолитическим методом титрования по 50% гемолизу 48
2.3.2. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови 49
2.3.3. Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови методом осаждения полиэтиленгликолем 49
2.4. Субпопуляционная характеристика мононуклеаров периферической крови 50
2.4.1. Выделение фракции мононуклеаров периферической крови в градиенте плотности фиколл-верографин 50
2.4.2. Определение субпопуляции Т-лимфоцитов в периферической крови методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) 51
2.4.3. Определение субпопуляций Т-лимфоцитов с рецепторами к Fc-фрагментам иммуноглобулинов IgG, IgM(Тр., Ту) 51
2.4.4. Определение содержания В-лимфоцитов (ЕАС-РОК) в периферической крови 52
2.5. Изучение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов 53
2.5.1. Лизосомально-катионный тест 53
2.5.2. Субпопуляционная характеристика нейтрофильных гранулоцитов периферической крови 54
2.5.2.1.Выделение суспензии лейкоцитов из периферической крови 54
2.5.2.2. Определение уровня экспрессии рецепторов к СЗЪ-компоненту комплемента па мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови 55
2.5.2.3. Определение нейтрофильных гранулоцитов с рецепторами к эритроцитам барана (Е -рецептор) и к Fc-фрагменту IgG (Fcy-рецептор) 56
2.6 Статистическая обработка результатов... 57
3. Результаты исследования 58
3.1.Показатели лизосомально-катионного теста нейтрофильных гранулоцитов и уровень экспрессии Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных хроническим гломерулонефритом и у здоровых доноров 58
3.2. Корреляционная взаимосвязь активности нейтрофильных гранулоцитов и уровня иммунохимических показателей сыворотки крови и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных с изученными формами хронического гломерулонефрита 65
3.3 Корреляции уровня функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гломерулонефрите у человека с показателями функционального состояния почек и биохимического состава крови 71
3.3.1 Корреляции количества и степени функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с хроническим гломерулонефритом с уровнем протеинурищ лейкоцитурии и эритроцитурии 72
3.3.2. Корреляционные зависимости показателей функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, скорости клубочковой фильтрации и уровнем суточной протеинурии 75
3.3.3. Корреляции функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови с определенными изменениями биохимических показателей сыворотки крови у больных с МПГН1 типа, IgA-нефропатией иМезПГН. 81
4. Обсуждение результатов 92
5. Выводы 104
- Роль нейтрофилов в развитии гломерулонефритов
- Иммунохимические методы исследования сыворотки крови
- Изучение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов
- Корреляции уровня функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гломерулонефрите у человека с показателями функционального состояния почек и биохимического состава крови
Введение к работе
Актуальность проблемы
Гломерулонефрит - обобщенное название заболеваний почек, при котором происходит первичное вовлечение в патологический процесс клубочков с последующим поражением канальцев и интерстиция, что приводит к прогрессированию заболевания, а в итоге - к развитию хронической почечной недостаточности (Рябов СИ., 2000).
В группе заболеваний почек и мочевыводящих путей гломерулонефрит (ГН) занимает 3-4-е место, уступая по распространенности только пиелонефриту и мочекаменной болезни (Григорьев Е.А., 1988; Рябов СИ., 2000; Храйчик Д.Е., 2001; Арутюнян В.М. и соавтр., 2002). В связи с распространением хронических форм болезни, доля пациентов с ГН среди больных почечной недостаточностью, направленных на гемодиализ и трансплантацию, постоянно возрастает (Григорьев Е.А., 1988; Рябов СИ., 2000).
В настоящее время патофизиологические механизмы, ведущие к прогрессированию хронического гломерулонефрита (ХГН), принято разделять на иммунные и неиммунные - гемодинамические и метаболические. Ранее считалось, что основную роль в развитии ХГН играют иммунные комплексы и антитела к базальной мембране клубочков. Сейчас этим факторам повреждения отводят важную роль скорее в индукции процесса (Тареева И.Е., 1996). При исследовании пролиферативных форм ХГН у людей особое внимание уделяется гуморальным (системе комплемента, кининам, вазоактивным аминам, метаболитам арахидоновой кислоты) и клеточным (нейтрофилы, тромбоциты, моноциты, макрофаги, лимфоциты) медиаторам воспаления в почечной ткани (Шилов Е.М., 2000).
Известно, что нейтрофильные гранулоциты участвуют в развитии патофизиологических процессов при многих заболеваниях, высвобождая комплекс различных агентов, нарушающих нормальную деятельность клеток и разрушающих соединительную ткань (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Не является исключением и ХГН (Johnson R. et al., 1997), хотя роль нейтрофильных гранулоцитов при этой форме патологии исследовалась мало. Так как нейтрофилы являются первыми эффекторными клетками, поступающими в очаг воспаления, изучение их функциональной активности при развитии и прогрессировании пролиферативных форм ГН является актуальной задачей.
Перемещение нейтрофильных гранулоцитов из кровеносных сосудов в ткань почки - важный фактор развития многих почечных заболеваний (Segerer S. et al., 2000). Однако большинство исследований, подтверждающих активное участие нейтрофильных гранулоцитов в поражении почечной ткани, выполнено на экспериментальных моделях нефрита, патогенез которых значительно отличается от патогенеза первичных ХГН у человека. В этих исследованиях обнаружено, что динамика развития клинико-морфологического синдрома связана с количеством и активностью нейтрофильных гранулоцитов, инфильтрирующих почечную ткань (Linas S.L. et al., 1995; Huang X.R. et al., 1997).
Полученные на экспериментальных моделях данные свидетельствуют о том, что нейтрофилы привлекаются в почечную ткань иммунными комплексами и различными медиаторами воспаления (Noris М., Rerauzzi G.G., 1995; Donovan K.L., et al., 1995; Kitching A.R. et ah, 2002). Активную роль при поступлении нейтрофилов в ткань играют различные адгезионные молекулы, экспрессирующиеся как на нейтрофильных гранулоцитах так и на эндотелии капилляров почечного клубочка (Tipping P.G. et al., 1994; Lefkowith J.B., 1997; Lai К. R, 2002).
В настоящей работе проведено исследование функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови пациентов, страдающих ХГН, а именно IgA-нефропатией, мезангиально-пролиферативным гломерулонефритом (МезПГН) и с мембранозно-пролиферативным гломерулонефритом 1 типа (МПГН 1 типа). Исследованы изменения уровня экспрессии рецепторов к СЗЬ-компоненту комплемента на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с ХГН, что позволило установить связь изменений данного показателя с изменением функций почек у пациентов с исследованными морфологическими формами пролиферативных ГН.
Известно, что рецепторы нейтрофильных гранулоцитов к СЗЬ-компоненту комплемента (Мас-1) функционально связаны с экспрессируемыми на мембране этих же клеток Fcy-рецепторами (Tang Т. et al., 1997), которые участвуют в утилизации отложившихся в почечной ткани иммунных комплексов. При использовании экспериментальной модели ГН установлено, что продукция активных форм кислорода нейтрофильными гранулоцитами инициируется через активацию Fcy-рецепторов (Suzuki Y. et al., 2003), Исследования изменения уровня экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофилов периферической крови при ХГН у человека не проводились.
Попадая в почечную ткань и принимая участие в реализации защитных функций (Westerhuis R. et al., 2000), нейтрофильные гранулоциты могут поражать инфильтрируемую ткань, в результате высвобождения свободных кислородных радикалов (Poelstra К. et al., 1990; Baund L. et al., 1992; Shah S.V., 1995), или участия неокислительных механизмов (Matzner Y. et al., 1985; Lehrer R.I. et al., 1993; Janoff A. 1985). Катионные белки и пептиды (КБ), к которым относятся дефенсины, лизоцим, эластаза, катепсин G, лактоферрин, миелопероксидаза, обеспечивают антимикробный потенциал нейтрофилов, оказывая
комплексное воздействие на структуру и обменные процессы фагоцитированных микроорганизмов и обуславливают их киллинг (Кокряков В.Н., 1999). В то же время, КБ увеличивают проницаемость стенки кровеносных сосудов (Matzner Y. et al., 1985) и даже вызывают ее повреждение (Harlan J.M., 1987; Lehrer R.I. et al., 1993). Использованный в работе лизосомально-катионный тест (ЛКТ), позволил определить уровень содержания катионных белков в нейтрофильных гранулоцитах периферической крови пациентов, который характеризует функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов.
Поскольку повреждающая роль нейтрофильных гранул оцитов при ХГН не подвергается сомнению, актуальной задачей является поиск способов снижения их негативного влияния на инфильтрируемую почечную ткань (Ward К.Р. et al., 2000; Hruby Z. et al., 2000; Stambe C. et al., 2003). Поэтому информационно значимым представляется проведение корреляционного анализа показателей функциональной активности клеток нейтрофильно-гранулоцитарного звена периферической крови при пролиферативных формах хронического гломерулонефрита у людей с другими широко используемыми иммунологическими показателями и клинико-лабораторными данными, характеризующими функциональное состояние почек, полученными при обследовании госпитализированных пациентов. До настоящего времени подобные сведения в литературе отсутствуют.
Таким образом, изучение функциональной активности нейтрофилов
при различных морфологических формах ХГН у человека с одной стороны
позволяет расширить существующие представления о
патофизиологических механизмах развития этих заболеваний, а с другой -может иметь научно-практическое значение, позволяя определять тактику лечения больного и прогнозировать динамику развития процесса.
Цель и задачи исследования
Целью работы явилось исследование значения изменений
функциональной активности нейтрофильных гранулоците в
периферической крови в развитии ХГН у больных, страдающих различными формами этого заболевания (мезангиально-пролиферативный гломерулонефрит, мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит 1 типа, IgA — нефропатия),
В задачи работы входило:
1. Исследование содержания катионных белков в нейтрофильных
гранулоцитах периферической крови у больных с IgA-нефропатией,
МезПГН, МПГН 1 типа и здоровых доноров;
Изучение уровня экспрессии Е+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с IgA-нефропатией, МезПГН, МПГН 1 типа и здоровых доноров;
Изучение уровня экспрессии СЗЬ+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранул оцитов периферической крови у больных с IgA-нефропатией, МезПГН, МПГН 1 типа и здоровых доноров;
Изучение уровня экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с IgA-нефропатией, МезПГН, МПГН 1 типа и здоровых доноров;
Исследование следующих иммунологических показателей: содержания в периферической крови пациентов различных субпопуляций лимфоцитов, уровня гемолитической активности комплемента сыворотки крови, концентрации циркулирующих иммунных комплексов и иммуноглобулинов М, G и А классов в сыворотки крови, определение наличия отложений иммуноглобулинов М, G и А классов в ткани почечных биоптатов;
Определение корреляционных взаимосвязей между исследованными в работе функциональными показателями активности нейтрофильных
гранулоцитов и данными лабораторных исследований
госпитализированных больных.
Научная новизна исследования
Проведенное исследование позволило выявить ряд особенностей
изменения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов
периферической крови при мембранозно-пролиферативном
гломерулонефрите 1 типа, IgA-нефропатии и мезангиально-пролиферативном гломерулонефрите у людей.
Впервые для этой цели была проведена комплексная оценка уровня экспрессии Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, а также изучение содержания катионных белков и пептидов в нейтрофильных гранулоцитах при следующих пролиферативных формах ХГН: МПГН 1 типа, IgA-нефропатия и МезГТГН. Использование ЛКТ позволило получить новые данные о снижении содержания КБ в нейтрофильных гранулоцитах периферической крови при изученных формах ХГН у людей. Впервые показано значительное повышение уровня экспрессии СЗЬ+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с изученными формами ХГН.
Приоритетный характер носят результаты корреляционного анализа исследованных показателей и лабораторных данных, полученных при обследовании госпитализированных пациентов. Они позволили выявить существенные различия в характере защитных реакций при МПГН 1 типа, IgA-нефропатии и МезПГН. Показано, что изменения уровня экспрессии Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, а также содержания в них катионных белков и пептидов, коррелирует с ухудшением функции почек при МПГН 1 типа, IgA-нефропатии и МезПГН.
Теоретическая и практическая значимость работы
Представленная работа, посвященная исследованию
функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов
периферической крови при мембранозно-пролиферативном
гломерулонефрите 1 типа, IgA-нефропатии и мезангиально-пролиферативном гломерулонефрите, носит фундаментально-прикладной характер. Результаты исследования расширяют и дополняют сложившееся в настоящее время представление о роли нейтрофильных гранулоцитов в прогрессировании изученных форм хронического гломерулонефрита. Основное значение работы состоит в установлении корреляции между изученными показателями функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови с активностью МПГН 1 типа, IgA-нефропатии, МезПГН, определенного по изменению показателей, характеризующих функции почек.
Комплекс проведенных исследований, а также их корреляционный анализ, выявили ряд взаимосвязей между изменениями показателей функциональной активности и показателями, характеризующими функцию почек, позволяющих предложить новые критерии для прогнозирования течения МПГН 1 типа, IgA-нефропатии, МезПГН у людей: исследование лизосомально-катионного теста, уровня Е+-} СЗЬ+- и Fcy-рецепторов, что может быть использовано в клинической практике.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В нейтрофильных гранулоцитах периферической крови больных мембранозно-пролиферативным гломерулонефритом 1 типа, IgA-нефропатией и мезангиально-пролиферативным гломерулонефритом снижено содержание катионных белков и повышена экспрессия СЗЬ+-рецепторов на плазматической мембране этих клеток. Интенсивность
экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов у этих больных сохраняется в пределах нормальных величин.
Уровень экспрессии Е+-рецепторов на плазматической мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных IgA-нефропатией и МезПГН ниже соответствующего показателя у здоровых людей. У больных МПГН 1 типа этот показатель варьирует в пределах нормы.
Выявлены изменения коэффициентов корреляции функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови с иммунохимическими показателями сыворотки крови и субпопуляционным составом лимфоцитов периферической крови.
4. Определены корреляционные зависимости между показателями
функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и ряда
показателей, характеризующих функциональное состояние почек,
позволяющие предложить ряд новых прогностически значимых критериев
прогрессирования МПГН 1 типа, IgA-нефропатии, МезПГН.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 154 источников, из них 115 -зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 14 рисунками и 7 таблицами.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ в отечественных журналах, а также в сборниках по материалам Всероссийских и Международных конференций.
Материалы работы докладывались и обсуждались на заседаниях Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ «НИИ ЭМ РАМН» совместно с НИИ нефрологии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (С. Петербург) в 2003 и 2004 гг, а также на Российских и Международных научных конференциях: 1-м съезде нефрологов России (Казань, Россия, 1994), 3-м ежегодном Санкт-Петербургском нефрологическом семинаре (СПб, Россия, 1995), 33-м Congress of EDTA (Amsterdam, the Netherlands, 1996), the Second Bantao Congress (Macedonia, Skopie, 1997), Научной конференции "Актуальные проблемы внутренней медицины и стоматологии", EDTA - ERA Annual Congress (Italy, Rimini, 1998), 2-м съезде нефрологов России (Москва, Россия, 1999), 9-ой Всероссийской конференции по физиологии и патологии почек и водно-солевого обмена (СПб, Россия, 2001), 5-м Конгрессе общества иммунологов и аллергологов (Москва, Россия, 2002).
Роль нейтрофилов в развитии гломерулонефритов
Важная роль нейтрофильных гранулоцитов в патофизиологических процессах, протекающих при развитии и прогрессировании хронического гломерулонефрита, не подвергается сомнению (Johnson R. et al., 1997). Перемещение нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови в ткань почки является важным фактором в развитии многих почечных заболеваний (Segerer S. et al., 2000). К сожалению, большинство исследований, подтверждающих активное участие нейтрофильных гранулоцитов в патогенезе поражения почечной ткани, выполнено на экспериментальных моделях нефрита, динамика и механизмы развития которых значительно отличается от развития первичных ХГН у человека. В многочисленных исследованиях, выполненных на экспериментальных моделях гломерулонефрита, установлено, что лейкоциты, инфильтрирующие почечный клубочек, являются главными эффекторами, обуславливающими гломерулярное повреждение при пролиферативном гломерулонефрите. Хорошо описанной экспериментальной моделью нейтрофил-зависимого иммунного поражения является гетерологическая фаза нефротоксического сывороточного нефрита (анти-ГБМ ГН). В этой модели ГН вызывается путем введения гетерологаческих антител против гломерулярной базальной мембраны (ГБМ). Гломерулярные повреждения, обусловленые аккумуляцией нейтрофильных гранулоцитов в клубочке, развиваются, преимущественно, в результате дегрануляции нейтрофилов, высвобождения их протеолитических ферментов и химически реактивных кислородных радикалов (Schrijver G. et al., 1990). 1,2,1, Роль медиаторов воспаления в модуляции функций нейтрофилъных гранулоцитов при гломерулонефрите Начальным этапом развития гломерулонефрита является поражение почечной ткани в результате отложения иммунных комплексов на ГБМ Инфильтрация почечных клубочков нейтрофильными гранулоцитами выявляется также на ранних стадиях обострения большинства форм ГН.
Отложение ИК внутри клубочковых капилляров вызывает местный синтез хемотаксических веществ (лейкотриены, интерлейкин-8 (ИЛ-8)), которые в совокупности с компонентами комплемента вызывают приток полиморфноядерных и мононуклеарных лейкоцитов в почечную ткань (Noris М., Remuzzi G.G., 1995). Медиаторы, синтезируемые в поврежденной почечной ткани, обуславливают привлечение в очаг иммунной реакции нейтрофильных гранулоцитов и участвуют в регуляции их функций. Так, инъекция интерлейкина-1 (ИЛ-1) или фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) крысам с анти-ГБМ-нефритом значительно усиливает инфильтрацию клубочков нейтрофилами и протеинурию (Isha N,, 1989). Интерферон-у, возможно, не влияет на приток нейтрофилов в почечную ткань, так как при индукции анти-ГБМ-гломерулонефрита у нокаутных по гену интерферона-у мышей число инфильтрирующих почечную ткань нейтрофильных гранулоцитов не отличалось от такового у мышей дикого типа (Ohse Т. et al., 2004). С другой стороны, липоксины при экспериментальном гломерулонефрите уменьшают нейтрофильную инфильтрацию почечной ткани и, соответственно, снижают степень ее повреждения (О Меага Y.M., Brady H.R., 1997), так как они являются эндогенно продуцируемыми эйкозаноидами с антивоспалительными эффектами (McMahon В. et al., 2001), Их биосинтез был продемонстрирован при многих воспалительных заболеваниях, включая и гломерулонефрит (Papayianni A. et al., 1994; Mayadas T.N. et al., 1996; Munger K.A. et al., 1999). Липоксин A4 и липоксин В4 подавляет лейкотриен В4-индуцированный хемотаксис нейтрофильных гранулоцитов и их адгезию на эндотелиальных клетках, поддерживаемую CD11/CD18 интегринами (Papayianni A. et al., 1996). Количество внутриклубочковых нейтрофильных гранулоцитов при лейкоцитарной инфильтрации зависит от концентрации ФНО-а, который индуцирует респираторный взрыв нейтрофильных гранулоцитов. Адгезия нейтрофилов к эндотелиальной клетке, вызванная присутствием ФНО-а, происходит благодаря рецептору СО 18. Активация нейтрофилов ФНО-а происходит через Fc-рецепторы, экспрессируемые на нейтрофильных гранулоцитах (Donovan КХ. et al., 1995). Существенную роль играют отложения интерлейкина-8 (ИЛ-8) в почечной ткани, так как известно, что ИЛ-8 привлекает в почечную ткань и активирует нейтрофильные лейкоциты, которые участвуют в ее повреждении (Harada A. et al., 1994). Более того, в литературе имеются данные, что одним из ключевых факторов, способным вызывать миграцию нейтрофильных гранулоцитов в почечную ткань при IgA-нефропатии, является ИЛ-8, продуцируемый моноцитами. Установлено, что нейтрофильная инфильтрация присутствует в ткани почки у больных с IgA-нефропатией при наличии там ИЛ-8 (Peichl P. et al., 1992). В почечной ткани при IgA-нефропатии выявлены инфильтрирующие ее моноциты, которые продуцируют ИЛ-8 и высвобождают его в повышенном количестве даже при отсутствии клинического обострения (Yoshioka К. et al., 1993; Li H.L. et al., 1990; Matsumoto K., 1995). Кроме того, уровень ИЛ-8 в сыворотке крови у больных с IgA-нефропатией даже в период ремиссии значительно выше, чем у здоровых людей (Chen Н.С. et al., 1992). У 39,5 % пациентов с IgA-нефропатией T.Wada с соавтр (Wada Т. et al., 1994) обнаружили в моче ИЛ-8.
У больных непролиферативными формами гломерулонефрита ИЛ-8 в моче не выявляется. Концентрация ИЛ-8 в сыворотке крови коррелирует с уровнем лейкоцитарной инфильтрации в клубочке, повышается во время обострения заболевания и снижается при наступлении ремиссии или при применении иммуносупрессивной терапии (WadaT.etal.,1994). ИЛ-4, напротив, подавляет приток нейтрофильных гранулоцитов в ткань почки и, соответственно, ограничивает повреждение гломерулы. Этот факт был выявлен при исследовании течения экспериментального гломерулонефрита у мышей, нокаутных по гену ИЛ-4 (ИЛ-4 -/-), и у мышей дикого типа (ИЛ-4 +/+). В почках мышей, нокаутных по гену ИЛ-4 (ИЛ-4 -/-) после индукции НТН число инфильтрирующих почечную ткань нейтрофилов было больше, чем у мышей дикого типа (ИЛ-4 +/+). При лечении мышей, нокаутных по гену ИЛ-4, рекомбинантным мышиным ИЛ-4, количество нейтрофилов в почечной ткани снижалось до уровня, выявленного у мышей дикого типа. Авторы установили, что при индукции НТН у мышей, дефицитных по продукции ИЛ-4, экспрессия мРНК межклеточных молекул адгезии 1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule 1) в клетках сосудистого эндотелия почек значительно выше, чем у мышей дикого типа с вызванным НТН. При лечении мышей ИЛ-4 -/-рекомбинантным мышиным ИЛ-4 выявлено снижение уровня экспрессии мРНК ICAM-1 до значений, характерных для мышей дикого типа с НТН. Соответственно, гистологические и функциональные изменения почек у мышей, дефицитных по продукции ИЛ-4, после индукции НТН были более выражены, чем у мышей дикого типа с НТН (Saleem S. et al., 1998). Возможно, эти факты связаны с тем, что ИЛ-4 подавляет продукцию нейтрофильными гранулоцитами ИЛ-8 (Wertheim W.A. et al., 1993).
Иммунохимические методы исследования сыворотки крови
Уровень комплемента сыворотки крови определяли по стандартному методу Kabat A., Mayer М. (1968). Принцип метода заключается в том, что в присутствии комплемента происходит лизис эритроцитов, сенсибилизированнх антителами. За гемолитическую единицу комплемента (СН5о) принимают активность, необходимую для гемолиза 50% (2,5x10 ) оптимально сенсибилизированных эритроцитов барана из общего количества 5x10б эритроцитов в присутствии оптимального количества Са2+ и Mg2+ при ионной силе 0,147 в течении 1 часа при 37С и общем объеме 7,5 мл. В качестве гемолизина использовалась сухая гемолитическая сыворотка кроликов, иммунизированных эритроцитами барана (НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, г. Москва), рабочее разведение которых определялось методом титрования в присутствии эритроцитов барана и комплемента морской свинки в разведении 1:200 или человеческой сыворотки в разведении 1:40, что обеспечивало гемолиз 50-70% сенсибилизированных эритроцитов. Наибольшее разведение гемолитической сыворотки, которое еще дает максимальный лизис эритроцитов, называется гемолитической единицей гемолизина.
Готовые пробы фотометрировали на СФ-26 (ЛОМО, СПб) используя лампу накаливания с длинной волны 541, кюветы шириной 1 см. По калибровочной кривой находили тот объем исследуемой сыворотки, при которой происходит 50% гемолиз. Титр комплемента определяли числом СН5о в 1,0 мл неразведенной сыворотки. У здоровых доноров уровень гемолитической активности комплемента равнялся 25,68 ± 1,638 ед. 2.3.2. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови (Manchini G. etal, 1965) Количество иммуноглобулинов (Ig) G, М, А в сыворотке определяли методом простой радиальной иммунодиффузии по Manchini G. и соавтр. (1965). Определение иммуноглобулинов производили с помощью моноспецифических сывороток против IgG, IgM, IgA и стандарта (эталонных сывороток, содержащих IgG, IgM, IgA) производства института Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва. Уровень иммуноглобулинов определяли по калибровочной кривой, выражающей зависимость между концентрацией иммуноглобулинов и диаметром колец преципитации, образующихся при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в агаре, в котором предварительно была диспергирована моноспецифическая антисыворотка. У здоровых доноров содержание иммуноглобулинов составило: IgG = 14,03 ± 1,34 г/л, IgM = 1,92 ± 0,395 г/л, IgA = 2,49 ± 0,407 г/л. Согласно стандартизации ВОЗ от 1970 г., допустимыми считаются следующие колебания иммуноглобулинов в сыворотке здоровых доноров; IgG = 9,0 — 16,0 г/л, IgM = 0,6 - 1,8 г/л, IgA = 0,9 - 2,7 г/л. 2.3.3. Определение циркулирующих иммунных комплеков в сыворотке крови методом осаждения полиэтиленгликолем (м.м.6000) (Riho J. et al., 1979) Метод основан на осаждении циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке 4,166% раствором полиэтиленгликоля (мм 6000) на боратном буфере рН 8,4 (состав буфера: 6,7 г Н3В03, 13,4 г Na2B4O7 10H2O растворяют в 1000 мл Н20). Результат оценивали на спектрофотометре СФ-26 (ЛОМО), при длине волны 450 нм. Результат выражали в единицах экстинции. По данным автора метода, уровень сывороточных иммунных комплексов в норме колеблется от 0,06 до 0,08 ед. В группе здоровых доноров содержание иммунных комплексов составляло 0,063 ± 0,0086 ед. 2.4.
Субпопуляционная характеристика мононуклеаров периферической крови 2,4,1, Выделение фракции мононуклеаров периферической крови в градиенте плотности фиколл-верографин (по Воуит А., 1969, в модификации Хейфец Л.Б., Абалакин В. А., 19 73) Для приготовления смеси фиколл-верографин использовали фиколл (Sigma, США), 76% верографин (Спофа, Чехословакия). Плотность полученного градиента доводили до 1,077 г/мл. Гепаринизированную кровь в объеме 6-8 мл наливали в стеклянную чашку Петри и инкубировали в течении 1 час при 37С для удаления «прилипающих» клеток, преимущественно моноцитов. После удаления моноцитов кровь разводили в 4 раза 0,9% NaCl, 7-8 мл полученной смеси наслаивали на 3 мл градиента фиколл-верографин, центрифугировали в течение 40 мин при 400g. После центрифугирования с интерфазы собирали слой лимфоцитов и дважды отмывали его в 0,9% NaCl в течение 10 мин в том же режиме и однократно - 10 мин при 200g (для уменьшения примеси тромбоцитов). Выход мононуклеаров после отмывания состовлял 84-88% от общего количества в крови. Из 3 мл крови выделяли около 3-5 млн мононуклеаров, жизнеспособность клеток, оцененных при окраске трипановым синим, - до 87-96%. 2.4.2. Определение субпопуляции Т-лимфоцитов в периферической крови методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) (Bach J., 1973) Для определения процентного содержания иммунокомпетентных Т-лимфоцитов применяли общепринятый метод спонтанного розеткообразования по J Bach (1973) с эритроцитами барана. В работе использовали бараньи эритроциты, сохранявшиеся в консерванте Олсвера при 4С до 10 дней. Концентрацию отмытых лимфоцитов доводили до 2x10 клеток в 1 мл среды №199. Бараньи эритроциты после трехкратного отмывания 0,9% NaCl разводили средой №199 до 0,5% концентрации. Затем равные объемы суспензии смешивали в отношении лимфоциты/эритроциты 1:30. Отсчет результатов производили через 18 ч инкубации суспензии при 4С. Подсчитывали общее число розеткообразующих (Е-РОК) на 200 клеток. За розеткообразующую клетку, в соответствии с принципом метода J. Bach (1973), принимали лимфоцит, к поверхности которого прикрепляются более 3-х эритроцитов барана. В группе здоровых доноров среднее значение процента Е-РОК-клеток составляло 45,5±5,03%, что совпадает с данными других авторов (54,3±0,98%) (Меньшиков В.В., 1987). 2.4.3. Определение субпопуляций Т-лимфоцитов с рецепторами к Fc- фрагментам иммуноглобулинов IgG, IgM (Тц, Ту) (Новиков Д.Н., 1987) Для определения Тц и Ту клеток, из общей фракции мононуклеаров периферической крови, полученных методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин, путем разделения через нейлоновое волокно на колонке получали очищенную взвесь Т-лимфоцитов (суммарную фракцию).
В качестве частиц-носителей использовали эритроциты резус отрицательной АВ (4) группы крови, которые после отмывания изотоническим раствором NaCl фиксировали в 6% растворе формалина и обрабатывали IgG- или IgM-антителами для выявления соответственно Ту и Тх клеток. Отсчет производили через 12-18 часов инкубации. Подсчитывали общее количество Тц клеток на 200 лимфоцитов и Ту клеток на 200 лимфоцитов. У здоровых доноров процентное содержание Ту-лимфоцитов составляло 20,08±2,83%, процентное содержание Тц-клеток - 31,5±2,63%. 2.4.4. Определение содержания В-лимфоцитов (ЕАС-РОК) в периферической крови (Bianco С, etal., 1970) Для определения содержания В-лимфоцитов в крови использовали общепринятый метод розеткообразования с эритроцитами барана, сенсибилизированными антителами в присутствии мышиного комплемента по Bianco С. et al., (1970). Раствор суспензии эритроцитов (2,5 %) отмытых 0,9% NaCl, смешивался в равных объемах с гемолитической сывороткой в субагглютинирующей дозе с последующей инкубацией 30 мин при 37 С. Затем суспензию сенсибилизированных бараньих эритроцитов отмывали в растворе Хенкса и смешивали в равных объемах с мышиным комплементом (разведение 1:20), инкубировали в течении 30 мин при 37 С. Полученную суспензию эритроциты-антитела-комплемент (ЕАС-система) смешивали в равных объемах с суспензией лимфоцитов. Подсчет розеткообразующих клеток производили на 200 лимфоцитов. В качестве гемолитической сыворотки использовали сухую гемолитическую сыворотку кроликов, иммунизированных эритроцитами барана. В группе здоровых доноров содержание ЕАС-РОК составляло 18,8±1,94%. По данным Bianco С. и соавтр. содержание ЕАС-РОК в крови 18,1±6,6%.
Изучение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов
Метод позволяет цитохимически выявить гранулы нейтрофильных лейкоцитов, содержащие катионные белки и пептиды. Для исследования приготовляли тонкие равномерные мазки крови на чистых обезжиренных стеклах. Высушенные мазки крови погружали на 15-20 минут в забуференный спиртовой раствор прочного зеленого (рН-8,5). Далее препараты отмывали дважды в дистиллированной воде и окрашивали в 0,25% растворе Азура А (рН 7,0-7,4) в течении 15-20 секунд. Краситель смывали дистиллированной водой и стекла высушивали. Для приготовления раствора прочного зеленого использовали прочный зеленый (Colour index 42053, Sigma). Раствор приготавливали на метиловом буфере с трис-соляной кислотой (рН 8,1-8,2), используя сухой порошок (оксилитил-аминометан) (трис) производство НПО «Биохимреактив». В приготовленном метиловом трис-буфере растворяли 0,1 г сухого красителя прочного зеленого. Оценку результатов производили с помощью иммерсионного объектива микроскопа МБИ-15 (ЛОМО) (Ув х 1000). Лизосомы нейтрофильных, эозинофильных и базофильных гранулоцитов окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а клеточные ядра и аномальные гранулы - в синий цвет. Оценку результатов цитохимического выявления катионных белков и пептидов нейтрофильных гранулоцитов проводилась методом полуколичественного определения содержания катионных белков и пептидов путем расчета среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по формуле: СЦК = 3,0а + 2,5b +2,0с + l,5d +1,0е +0,5f + 0,0g/100 где a-g — количество однотипных клеток с определенной степенью окрашиваемости цитоплазмы прочным зеленым, а цифры 3-0 — степень интенсивности окрашивания: 0 — отсутствие окраски цитоплазмы или ее слабое диффузное прокрашивание; 0,5 - в цитоплазме все гранулы бледно окрашены или единичные светлоокрашенные; 1,0 - половина цитоплазмы заполнена светлоокрашенными гранулами, остальные бледно-зеленые; 1,5 - цитоплазма равномерно заполнена гранулами, окрашивающимися в светло-зеленый цвет; 2,0 — на фоне светло-зеленых гранул 1/3 цитоплазмы заполнена темно-зелеными гранулами; 2,5 — цитоплазма поровну заполнена темно- и светло-зелеными гранулами; 3,0 - 2/3 или более гранул окрашиваются в темно-зеленый цвет. В одном мазке учитывали 100 клеток. В группе здоровых доноров величина СЦК составляла 1,47±0,02, что соответствует данным автора метода В.Е. Пигаревского. 2.5.2.
Субпопуляционная характеристика нейтрофильных гранулоцитое периферической крови (Петрова И.В. и соавтр., 1980) 2.5.2.1.Выделение суспензии лейкоцитов из периферической крови. В пробирку с 3 мл гепаринизированной крови, из расчета 20 ME гепарина на 1 мл крови, добавляли 3% раствор желатина в количестве 1/3 часть от объема крови, перемешивали и выдерживали 35-40 мин при 20С. Отделенную надосадочную жидкость переливали в силиконированные пробирки с добавлением среды №199 из расчета 1/3 часть объема и центрифугировали 5 мин при 200g. Надосадочную жидкость удаляли и к осадку добавляли 2-3 капли дистиллированной воды, перемешивали 20 сек и заливали средой №199. Осадок дважды отмывается средой №199 в том же режиме. Конечную концентрацию лейкоцитов доводили средой №199 до 2 х 10б клеток/мл. 2.5.2.2. Определение уровня экспрессии рецепторов к СЗЬ-компопенту комплемента на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови (Петрова КВ. и соавтр., 1980) В работе использовали эритроциты барана, обработанные гемолитической сывороткой и мышиным комплементом (ЕАС - система), как это описано выше в подразделе 2.4.4. В силиконированных пробирках смешивали 0,1 мл лейкоцитарной взвеси и 0,1 мл ЕАС — системы. Центрифугировали 5 мин при 200g.
В центрифужную пробирку добавляли глютаровый альдегид в конечной концентрации 0,6% и выдерживали в течении 20 мин при 20С. К полученной лейкоцитарно-эритроцитарной смеси добавляли дистиллированную воду и центрифугировали в течении 5 мин при 200g. Надосадок сливали, а полученный осадок пипетировали и наносили на обезжиренные стекла. Высушенные мазки фиксировали 10-15 мин в метаноле. Окраску мазков производили раствором Азур II - эозин натрия приготовленном на забуференном физиологическом растворе (рН-7,4). Фиксированные мазки окрашивали в горизонтальном положении в течении 5 минут, затем споласкивали водой и высушивали. Подсчет розеткообразующих клеток проводили под иммерсионной системой микроскопа при увеличении ОКхЮ, 06x60. Подчитывали не менее 100 нейтрофилов. За розеткообразующий нейтрофил принимали клетку, к которой прикреплены не менее 5 эритроцитов. В группе здоровых доноров содержание нейтрофилов, несущих рецепторы к комплементу, составляло 8,08±1,62%. 2.5.2,3. Определение нейтрофильных гранулоцитов с рецепторами к эритроцитам барана (Е+-рецептор) и к Fc-фрагменту IgG (Fcy-рецептор) (Новиков ДЛ., 1987) В работе использовали Е-систему и Fcy-систему, которые готовили по описанной выше методике (раздел 2.4. пункты 2 и 3). Смешивали равные объемы - 0,1 мл лейкоцитарной взвеси и ОД мл системы (Е- или Fey-). Пробирки инкубировали 5 минут при 37С в термостате, далее центрифугировали при 200g в течении 2 минут и инкубировали 1 час при 6 С. К полученному осадку добавляли глютаровый альдегид в конечной концентрации 0,6% на 20 мин при 20 С.
К полученной лейкоцитарно-эритроцитарной смеси добавляли дистиллированную воду и центрифугировали 5 мин при 200g. Надосадок сливали, осадок пипетировали и распределяли на обезжиренные сухие стекла. Мазки высушивали при комнатной температуре и фиксировали 10-15 мин в метаноле. Окраску мазков производили так же, как описано выше для определения нейтрофилов, несущих рецепторы к комплементу (раздел 2.5., пункт 2, подпункт 2). Подсчет розеткообразующих клеток проводили под иммерсионной системой микроскопа при увеличении ОКхЮ, 06x60. Подсчитывали не менее 100 нейтрофильных гранулоцитов, и определяли процент розеткообразующих клеток. За розеткообразуюший нейтрофил с рецепторами к эритроцитам барана принимали клетку, к поверхности которого прикрепляются не менее 3 эритроцитов. За розеткообразующий нейтрофильный гранулоцит с Fcy-рецепторами принимали клетку, к поверхности которой прикрепляются не менее 5-ти эритроцитов. У здоровых доноров относительное содержание нейтрофилов экспрессирующих Е+-рецептор - 39,8±2,33%, нейтрофилов с Fcy-рецепторами - 13,58±2,89%, что совпадает с данными авторов метода (Новиков Д.Н., 1987; Петрова И.В. и соавтр., 1980) 2.6 Статистическая обработка результатов При статистической обработке данных вычисляли средние значения и их стандартные ошибки. Для сравнения средних использовали t-критерий Стьюдента. Вычисляли коэффициенты линейной корреляции Пирсона (г) и непараметрические коэффициенты Спирмена (rs) с использованием компьютерной программы Statistica 5.0. За достоверные принимались значения, при которых р 0,05 (Гланц С, 1999).
Корреляции уровня функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гломерулонефрите у человека с показателями функционального состояния почек и биохимического состава крови
Наиболее распространенными лабораторными методами обследования больных ХГН является анализ мочи, пробы, характеризующие функциональное состояние почек (определение скорости клубочковой фильтрации, суточная протеинурия) и биохимическое исследование крови (исследования концентрации общего белка, альбумина, креатинина, мочевины в сыворотке крови). Эти методы характеризуют патофизиологические изменения почек при данном заболевании, так как позволяют определить активность заболевания и прогнозировать его течение. В отличие от морфологического исследования почечной ткани и других сложных методов оценки состояния почек (преимущественно с использованием веществ с радиоактивной меткой), лабораторные исследования, перечисленные выше, могут выполняться с достаточной частотой, необходимой для наблюдения за динамикой развития заболевания. Так как, установлено, что никакие лабораторные данные, определенные в день исследования нейтрофильных гранулоцитов, корреляционно не связаны с исследованными в работе показателями функциональной активности нейтрофилов, были проанализированы данные лабораторных анализов, полученные в последующие дни после изучения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови до проявления значимых корреляций.
Проявлялись эти взаимосвязи для разных показателей в разные сроки. В исследовании приведены сроки, на которых проявлялись корреляционные зависимости. 3.3.1. Корреляции количества и степени функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с хроническим гломерулонефритом с уровнем протеинурии, лейкоцитурии и эритроцитурии Протеинурия, лейкоцитурия и эритроцитурия характеризуют состояние почечного фильтра у больных с ХГН. Средние значения содержания белка в моче, лейкоцитов и эритроцитов на момент изучения количественных и функциональных показателей нейтрофильно-гранулоцитарных клеток у обследованных нами пациентов представлены в табл. 3. Концентрация белка в клиническом анализе мочи не была корреляционно взаимосвязана с изменениями уровня исследованных показателей активности нейтрофилов периферической крови у больных с МПГН 1 типа и у пациентов с МезПГН. У больных с IgA-нефропатией выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии СЗЬ+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов и концентрацией белка в моче (rs = - 0,545; р = 0,0357), определенной через 1 неделю после исследования морфо-функционального состояния нейтрофилов. У больных IgA-нефропатией уровень экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов взаимосвязан с содержанием белка в моче, оцененым через 2 нед. после исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов (г = 0,633; р = 0,011). Уровень КБ в нейтрофильных гранулоцитах коррелировало с уровнем лейкоцитурии, развившейся через 3-4 недели, у больных с МПГН 1 типа (г - 0,621; р = 0,003) (рис. 7). С другими показателями функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов уровень лейкоцитурии у больных МПГН 1 типа связан не был. Как, и у больных с IgA-нефропатией и с МезГТГН цитохимические показатели ЛКТ и относительное содержание нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, экспрессирующих Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторы, не коррелировали с уровнем лейкоцитурии. У пациентов с IgA-нефропатией величина ЛКТ отрицательно коррелировала только с уровнем эритроцитурии (г = - 0,570; р = 0,026), определенной через 2 мес. после исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови.
У больных с МПГН 1 типа таких взаимосвязей не выявлено. У больных с МезПГН интенсивность экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофилов коррелировала с количеством эритроцитов в моче (r=0,596 , р=0,006), определенных через две недели после проведенного исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов. 3.3.2, Корреляционные зависимости показателей функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, скорости клубочковой фильтрации иуровнем суточной протеинурии При обследовании больных с заболеваниями почек, одним из наиболее информационно значимых являются тесты, характеризующие функциональное состояние почек. Основным из них является определение скорости клубочковой фильтрации. Этот показатель принято определять по выделению вещества, которое хорошо фильтруется, но не подвергается секреции и реабсорбции в канальцах. В клинической практике обычно используют уровень эндогенного креатини на (Сг), так как он является стабильной для каждого человека величиной и его количество зависит только от его мышечной массы. Зная содержание Сг в сыворотке крови и в моче, а также зная величину диуреза за определенный промежуток времени, клубочковую фильтрацию расчитывают в мл/мин. В норме у здорового человека она колеблется от 80 до 140 мл/мин (Рябов СИ., 2000). Определение суточной потери белка также является значимым показателем, характеризующим состояние почечного фильтра. Средние показатели скорости кл у бочковой фильтрации (СКФ) и суточной потери белка (СПБ) на момент исследования морфо- функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с МПГН 1 типа, IgA-нефропатией и МезПГН представлены в табл.4. При проведении корреляционного анализа у пациентов с TgA -нефропатией обнаружена отрицательная непараметрическая корреляция уровня экспрессии рецепторов к эритроцитам барана на мембране нейтрофильных гранулоцитов со скоростью кл у бочковой фильтрации, зафиксированной в день исследования морфо-функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов, (rs = -0,567; р = 0,027). При МезПГН, вместе с тем выявлена линейная положительная корреляция между уровнем экспрессии Е+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов и СКФ (г = 0,481, р = 0,027), которая определялась через 2 недели после исследования экспрессии Е+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови.
При исследовании взаимосвязей между показателями количественного и функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов периферической крови с СКФ в группе больных с МПГН 1 типа, обнаружена отрицательная корреляционная зависимость между цитохимическим показателем ЛКТ и скоростью клубочковой фильтрации, оцененной по эндогенному креатинину (г = -0,473, р = 0,035) и зафиксированной спустя два месяца после исследования ЛКТ (рис.8). На графике, представленном на рис. 8, видно, что при исходных показателях ЛКТ ниже 1,00, через два месяца после определения ЛКТ уровень СКФ у пациентов выше, чем у пациентов, исходная величина ЛКТ-теста которых более 1,00, то есть именно у последних наблюдается снижение скорости клубочковой фильтрации. Для подтверждения правильности этого наблюдения пациенты были разделены на две группы: 1-ая группа - пациенты с цитохимическим показателем ЛКТ менее 1,00 (п=10); 2-ая - с цитохимическим показателем более 1,00 (п=10). В каждой группе были вычислены средние уровни СКФ на день исследования нейтрофильных гранулоцитов и спустя два месяца после изучения морфо-функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов. Различий уровня СКФ в день исследования у пациентов обеих групп не было выявлено. Но спустя два месяца констатированы достоверные различия у пациентов 1-ой и 2-ой групп (табл.5). Интенсивность экспрессии СЗЬ+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с МПГН 1 типа коррелировала со скоростью клубочковой фильтрации, оцененной по клиренсу эндогенного креатинина, измеренной спустя две недели после исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов (rs = 0,587;p = 0,0065). У больных с МПГН 1 типа также выявлена отрицательная непараметрическая зависимость между содержанием КБ в нейтрофильных гранулоцитах и уровнем суточной протеинурии, измеренной через два месяца после исследования функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов (rs = - 0,468; р = 0,037).
