Введение к работе
Актуальность исследований. Современные интенсивные технологии сельского хозяйства требуют эффективных способов защиты растений от повреждений патогенами. Химические средства защиты растений в основной массе являются одними из опаснейших поллютантов, кроме того, в популяциях патогенов идет отбор наиболее резистентных к ним форм, что приводит к потере их эффективности. Поэтому поиск альтернативных, экологически чистых путей решения проблемы защиты растений, направленных не на уничтожение биологического разнообразия агроценоза, а на биохимическую регуляцию иммунного потенциала растений и формирование целевой устойчивости к патогенам является актуальной задачей. В литературе широко обсуждается участие салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот в механизмах системной устойчивости, однако многие данные крайне противоречивы [Pieterse, 2012; Robert-Senialitz, 2011; Denance et al., 2013]. Считается, что СК индуцирует в растениях биохимические процессы, приводящие к устойчивость против биотрофных патогенов, а ЖК - против фитофагов и некротрофов [Pieterse, 2012]. Неоднократно отмечалось, что эти соединения, индуцируя соответствующие сигнальные пути, способны подавлять защитноое действие друг друга, что выражается в подавлении устойчивости растений к патогенам, связанном с отсутствием патоген-специфической экспрессии всего спектра генов, кодирующих защитные белки, либо только СК- или ЖК- зависимых генов [Boatwright et al., 2013].
Возбудитель фитофтороза картофеля - Phytophthora infestans, являясь гемибиотрофным паразитом, сочетает в своем жизненном цикле биотрофную и некротрофную стратегии патогенеза. Следовательно, растения для своей защиты от этого патогена должны комбинировать защитные стратегии. Следует задаться вопросом, возможна ли в этих условиях одновременная активация СК- и ЖК-индуцируемых защитных реакций, в том числе - связанных с окислительным взрывом и активностью оксидоредуктаз?
Пероксидазы представляют собой обширное семейство белков, различающихся по спектру окисляемых субстратов и роли в онтогенезе, что связано с многообразием их молекулярных форм. Это требует от исследователей идентификации физиологических функций отдельных изоформ этого фермента [Cosio, Dunand, 2009;
Mathe et al., 2010]. Например, в отношении ряда изопероксидаз, в особенности анионных, выдвигаются предположения об их причастности к формированию устойчивости растений к патогенам [Dowd, Lagrimini, 2006; Maksimov et al., 2011; Van Loon, 2006].
Цель исследования: выявление сигнальной роли салициловой и жасмоновой кислот в регуляции защитного ответа растений картофеля в ответ на инфицирование возбудителем фитофтороза P. infestans, связанного с системой про-/анти-оксидантного статуса.
Задачи исследований:
1) Изучить вклад салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот в
формирование устойчивости растений картофеля к фитофторозу;
-
Оценить характер изменения содержания перекиси водорода и активности пероксидаз в растениях картофеля под влиянием СК, ЖК и инфицирования;
-
Провести анализ локализации лигнина, фенольных соединений и активности пероксидаз в обработанных СК и ЖК растениях картофеля в ходе инфицирования;
-
Выявить в растениях картофеля изопероксидазы, взаимодействующие с хитином и полисахаридами клеточных стенок возбудителя фитофтороза;
-
Изучить транскрипционную активность генов картофеля, кодирующих пероксидазу М21334, белки PR-1 и PR-6 в качестве маркеров салицилат- и жасмонат-индуцируемых защитных реакций;
-
Для оценки роли изопероксидазы М21334 в защите растений картофеля от фитофтороза создать растения с подавленной экспрессией ее гена.
Научная новизна. Выявлено, что одновременное совместное воздействие салициловой и жасмоновой кислот увеличивает устойчивость растений картофеля к фитофторозу, повышая активность пероксидаз, усиливая накопление активных форм кислорода и интенсифицируя отложение фенольных соединений и лигнина в тканях инфицированных растений. Тогда как при последовательном применении СК после ЖК, напротив, прослеживается значительное подавление транскрипции защитных белков - изопероксидазы М21334 и ингибитора протеиназ (PR-6), что ведет к восприимчивости растений к возбудителю фитофтороза. Впервые определены полисахарид-специфичные изопероксидазы картофеля с изоэлектрическими точками (р7) ~ 3.5, ~ 3.7 и ~ 9.3, активирующиеся при инфицировании и под действием ЖК.
Для оценки роли изопероксидазы М21334 в защите растений картофеля от фитофтороза подобраны условия для агробактериальной трансформации и органогенеза пробирочных растений картофеля сорта Невский. На основе полученных с использованием генно-инженерной конструкции гена пероксидазы М21334 в антисмысловой ориентации растениях картофеля обнаружена подавленная активность изоформы р/ ~ 3.5, что приводило в последующем к снижению интенсивности лигнификации растительных клеточных стенок в зоне инфицирования и повышению восприимчивости к фитофторозу. Показана ведущая роль ЖК в защитном ответе картофеля против возбудителя фитофтороза, в котором задействованы полисахарид-специфичные изопероксидазы.
Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных расширяет современные представления о биохимических и молекулярных механизмах регуляции устойчивости растений к патогенам с участием СК и ЖК. Предложенный способ культивирования безвирусных пробирочных растений картофеля на средах, содержащих защитные соединения, может способствовать получению посадочного материала с индуцированной устойчивостью к фитофторозу. Показана возможность регламентирования применения композиций сигнальных молекул СК и ЖК в качестве средств защиты растений природного происхождения для индуцирования в растениях картофеля выработанной за длительный период эволюционного взаимодействия между хозяином и патогеном системной приобретенной и системной индуцированной устойчивости. Изопероксидазы с р/ ~ 3.5, кодируемая геном М21334, и ~ 9.3 могут быть использованы в качестве биохимических маркеров при проведении скрининга современных средств защиты растений с иммуноиндуцирующим эффектом, а также при разработке новых сортов картофеля, устойчивых к возбудителю фитофтороза и чувствительных к подобным иммуномодулирующим соединениям.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на международных конференциях «Биология - наука XXI века» (Пушино, 2008), "Стратегия взаимодействия микроорганзмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008), "Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера" (Апатиты, 2009), «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2010), «Растения и микроорганизмы» (Казань.
2011), «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (Пушкин, 2012); II (X) Ботанической конференции (Санкт-Петербург, 2012). На Всероссийских конференциях «Биостимуляторы в медицине и сельском хозяйстве» (Уфа, 2010), «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2011), VI съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011), «Экология: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2012), III съезде микологов России (Москва, 2012). Результаты так же были представлены на Всероссийских 2-й и 3-ей школах-конференциях по физико-химической биологии и биотехнологии «БИОМИКА -наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), на зарубежных конференциях "Symbiose" (Eskiehir, 2010) и «International symposium on secondary metabolites» (Denisli, 2011).
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье 10-04-97021, государственным контрактом Министерства образования и науки № П339 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. и АЦВП «Развитие научного потенциала высшей школы» № 2.1.1./5676.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в журналах «Перечня ВАК» и 3 статьи в тематических сборниках зарубежного издания.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего источников. Работа изложена на 153страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 29 рисунками.
Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Сурину О.Б., к.б.н. Черепанову Е.А., к.б.н. Бурханову Г.Ф., к.б.н. Машкова О.И., а также с.н.с. лаборатории молекулярной биологии и нано биотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Б.Р. Кулуева за помощь при выполнении и обсуждении работы.
