Содержание к диссертации
Введение
II. Литературный обзор 8
2.1. Локализация, основные свойства, структура и механизм действия NAD+- зависимых формиатдегидрогеназ 8
2.1.1. Локализация ФДГ 8
2.1.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ФДГ .. 15
2.1.3. Молекулярный механизм ФДГ 20
2.1.4. Трехмерная структура МАЕ)+-зависимой формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp.101 24
2.1.5. Экспрессия ФДГ в клетках E.coli 31
2.1.6. Кинетические параметры и взаимодействие активных центров ФДГ.. 33
2.1.7. Субстратная специфичность ФДГ 35
2.1.8. Коферментная специфичность ФДГ 36
2.2. Термостабильность формиатдегидрогеназ из различных источников 38
2.2.1. Механизмы инактивации ФДГ 38
2.2.2. Сравнение термостабильности ФДГ из различных источников 39
2.2.3 Увеличение термостабильности ФДГ из Pseudomonas sp.101 42
2.3. Дифференциальная сканирующая калориметрия как метод изучения структуры белков 43
2.3.1. Техника сканирующей калориметрии 43
2.3.2. Калориметрические измерения 45
2.3.3. Анализ результатов ДСК 48
III. Экспериментальная часть 51
3.1. Материалы 51
3.2. Методы исследований 52
3.2.1. Трансформация клеток .coli 52
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК 52
3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 53
3.2.4. Наработка биомассы 53
3.2.5. Выделение формиатдегидрогеназы 54
3.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле 55
3.2.7. Определение концентрации ФДГ 55
3.2.8. Измерение активности ФДГ 55
3.2.9. Исследование термоинактивации ФДГ 55
3.2.10. Анализ кинетических данных и расчет кинтеических констант 56
3.2.11. Анализ трехмерных структур ФДГ 56
3.2.12. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 56
3.2.13. Анализ кривых плавления 57
3.2.14. Круговой дихроизм (КД) 58
IV. Результаты и их обсуждение 59
4.1. Экспрессия формиатдегидрогеназ в клетках Е.coli 59
4.1.1. Экспрессия формиатдегидрогеназ из Arabidopsis thaliana и Glycine max в клетках E.coli 59
4.1.2. Экспрессия формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp.101, Candida boidinii, Moraxella sp.C-1, Saccharomyces cerevisiae в клетках E.coli 62
4.2. Изучение кинетических свойств рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ 63
4.3. Изучение кинетики термоинактивации рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ 68
4.4. Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии... 76
4.5. Изучение термостабильности формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью спектров кругового дихроизма 94
4.6. Исследование структуры формиатдегидрогеназ из различных источников с помощью рентгеноструктурного анализа 100
V. Выводы 105
Vi. Список литературы 106
Благодарности 121
- Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ФДГ
- Сравнение термостабильности ФДГ из различных источников
- Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)
- Изучение кинетических свойств рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ
Введение к работе
NAD+-3aBHCHMbie формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2), окисляющие формиат-ион до углекислого газа, представляют собой несколько групп ферментов, отличающихся как по четвертичной структуре, так и по наличию (или отсутствию) простетических групп и кофакторов. Среди большого разнообразия формиатдегидрогеназ наиболее простым по структуре и составу является фермент, состоящий из двух идентичных субъединиц и не содержащий в активном центре ни ионов металлов, ни простетических групп (ФДГ).
Формиатдегидрогеназа данного типа представляет большой интерес с точки зрения фундаментальной науки, поскольку этот фермент принадлежит к большому суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. Субстрат ФДГ -формиат-ион является самым простым по структуре среди субстратов для всех ферментов данного суперсемейства, и в механизме его действия отсутствуют стадии кислотно-основного катализа переноса протона. Сравнение структуры ФДГ со структурами дегидрогеназ из семейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот показало исключительно высокую пространственную гомологию (в среднем около 80-90%) при очень низком значении степени гомологии на уровне аминокислотных последовательностей (менее 30%). Поэтому формиатдегидрогеназа данного типа рассматривается как модельный фермент для выяснения механизма переноса гидрид-иона в активном центре дегидрогеназ.
Этот фермент широко распространен в метанол-утилизирующих микроорганизмах и играет важную роль в снабжении клетки энергией при окислении метанола до С02 с помощью полиферментной системы -метанолдегидрогеназа, формальдегиддегидрогеназа и формиатдегидрогеназа. Наиболее изученными у метилотрофных микроорганизмов являются ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 (РбєФДГ) и дрожжей Candida boidinii (СЬоФДГ). Эти ферменты используются в качестве универсального биокатализатора регенерации NAD(P)H в процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ. В нашей лаборатории для обоих ферментов были созданы
рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие выход до 3-5 граммов целевого продукта с литра среды. Несмотря на получение различных мутантов РбєФДГ и СЬоФДГ с улучшенными свойствами, проблема получения новых мутантов и их физико-химическая характеристика (в первую очередь изучение стабильности и механизма инактивации в различных условиях) является одним из основных условий успешного применения биокатализаторов на практике. До наших исследований в литературе отсутствовали систематические данные по химической, операционной и температурной стабильности ФДГ в зависимости от различных факторов.
Формиатдегидрогеназы также ранее были найдены в семенах фасоли, гороха и сои. Секвенирование геномов различных растений, выполненное в последнее десятилетие, показало, что этот фермент присутствует во всех высших растениях и мхах. На примере картофеля (а позднее для ячменя и Arabidopsis thaliana) было показано, что ФДГ расположена в митохондриях и является белком стресса. В условиях стрессовых воздействий содержание ФДГ достигает до 9% от общего количества митохондриальных белков! Основным сдерживающим фактором изучения растительных ФДГ был низкий выход фермента, кроме того, его свойства сильно зависели от метода выделения. Несмотря на то, что были получены трансгенные растения A.thaliana, тем не менее, так и не удалось наладить получение ФДГ в больших количествах. Все описанные в литературе попытки экспрессии растительных ФДГ в клетках E.coli были неудачными, поскольку фермент синтезировался в нерастворимой и неактивной форме в виде телец включения. Получение ФДГ из растений в больших количествах (десятки и сотни миллиграмм) также очень важно для получения кристаллов этих ферментов. К моменту начала нашей работы в банке трехмерных структур белков PDB имелось только две структуры для апо- и холо-форм РэеФДГ. Поэтому получение, изучение свойств и определение трехмерной структуры растительных ФДГ является исключительно актуальной научной задачей.
В работе в качестве объектов исследования были использованы реком-бинантные ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (РвеФДГ) и Moraxella sp.C-1 (МогФДГ), метилотрофных дрожжей C.boidinii (СЬоФДГ) и пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (ЗсеФДГ) и растений A.thaliana (АгаФДГ) и сои Glycine max (вІуФДГ). Гены РэеФДГ, СЬоФДГ и ЗсеФДГ были клонированы в нашей лаборатории, ген МогФДГ был клонирован нами совместно с проф. К. Асано из Университета префектуры Тояма и проф. Н. Есаки из Университета Киото (Япония). Плазмиды с полноразмерными генами АгаФДГ и ЄІуФДГ (включая сигнальные последовательности для транспорта в митохондрии) были любезно предоставлены проф. Марквелом из Университета штата Небраска (Линкольн, США) и проф. Н. Лабру из Сельскохозяйственного Университета Афин (Греция) соответственно.
Целью данной работы являлось получение рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ и комплексное изучение структуры и термостабильности ФДГ из бактерий (РзеФДГ, МогФДГ), дрожжей (СЬоФДГ, ЗсеФДГ) и растений (АгаФДГ, СІуФДГ).
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ФДГ
В настоящее время в базах данных имеются полные нуклеотидные последовательности для 33 генов ФДГ - 15 генов из бактерий, 7 генов из растений, 5 генов из дрожжей и 6 генов из микроскопических грибов. Кроме того, набор доступных последовательностей кДНК позволяет собрать полные аминокислотные последовательности для ферментов из 3 растений. Также в базах данных имеются последовательности кДНК, кодирующие отдельные участки аминокислотных последовательностей ФДГ, более чем из 25 источников.
Характерной особенностью бактериальных ФДГ является более длинная N-концевая часть (рис. 2.1). Этот участок полипептидной цепи представляет собой протяженную петлю, которая покрывает значительную часть субъединицы фермента. Несмотря на то, что в ней отсутствуют элементы вторичной структуры, эта петля обладает большой жесткостью из-за содержания 7 остатков пролина. Ее взаимодействие с другими остатками субъединицы является причиной более высокой термостабильности бактериальных ФДГ по сравнению с ферментами из других источников. Например, разрушение всего одной ионной пары между находящимся в петле остатком Asp43 и остатком Lys61 из спирали al (рис. 2.1) приводит к увеличению скорости термоинактивации ФДГ из Pseudomonas sp.101 в 6 раз [57]. В дополнение к большому количеству взаимодействий с остатками внутри субъединицы, эта петля участвует в образовании межсубъединичных контактов.
Если не принимать во внимание различия в N-концевой последовательности, все ФДГ можно разделить на две группы. В первую входят ферменты из бактерий и растений, а во вторую - ФДГ из дрожжей и микроскопических грибов. Наиболее интересным является наличие у ферментов второй группы дополнительного остатка между третьим остатком глицина в консервативной триаде (Gly/Ala)XGlyXXGly и остатком Asp221 (нумерация по ФДГ из Pseudomonas sp.101), играющим важную роль в обеспечении специфичности к NAD+ [58,59]. Еще два разрыва располагаются между двумя парами каталитически важных остатков Не 122 -Asnl46 и Gln313 и His332 (рис. 2.1).
ФДГ является высококонсервативным ферментом. Внутри одной группы степень абсолютной гомологии составляет не менее 80-85%, а между двумя ферментами из разных групп - 50-55% и выше. Сравнение известных на настоящий момент 36 полных и 25 частичных последовательностей ФДГ из различных источников позволяет выявить 71 консервативный остаток, что в пересчете на среднюю длину фермента около 365 остатков (длина петли в бактериальных ФДГ не учитывается) составляет почти 20% от всех остатков. Анализ их пространственного положения в структуре ФДГ из Pseudomonas sp.101 показал, что эти консервативные остатки играют разную роль. Часть из них обеспечивает стабильность структуры субъединицы (например, ионная пара Lys2-Asp89), другие участвуют в межсубъединичных взаимодействиях (Argl63, Asnl64, Trpl77, А1а180, Asp 188), и только небольшая часть участвует в катализе. На рисунке 2.1 звездочками отмечены каталитически важные аминокислотные остатки Рго97, Phe98, Ilel22, Asnl46, (Ala/Gly)198, Gly200, Gly203, Arg284, Gln313 и His 332. Кроме того, звездочкой отмечено 255-е положение (в большинстве ФДГ это остаток Cys), так как остаток в этом положении отвечает за взаимодействие с адениновым кольцом NAD+ [1, 60]. Подвижность ряда остатков (Phe98, Cys255, Gln313 и His332) сильно ограничена за счет соседства с остатком Pro. Особенно хорошо это проявляется для остатка Gln313, который в подавляющем большинстве ферментов зафиксирован двумя остатками Pro. В случае остатка в 122-ом положении (Не или Val) картина абсолютно противоположная. Наличие разных остатков в этом положении связано с тем, что в образовании водородной связи с молекулой субстрата принимает участие не боковая группа, а атом кислорода из карбонильной группы в основной цепи [60]. По-видимому, повышенная гибкость полипептидной цепи в этом положении, создаваемая за счет двух соседних остатков Gly, обеспечивает оптимальную ориентацию карбонильной группы 122-го остатка относительно субстрата. Остатки Gly200 и Gly203 также обеспечивают максимальный контакт между участком р-тяжа рА и спиралью ссВ для оптимального связывания NAD+ в активном центре.
Для выявления общих остатков, необходимых для катализа во всех D-специфичных дегидрогеназах 2-гидроксикислот, можно использовать «портрет» обобщенного активного центра на основе значений энтропии Шеннона [24]. Этот подход широко применяется при поиске каталитически важных остатков активного центра на основе анализа аминокислотных последовательностей ферментов [61]. Энтропия Шеннона Д- для /-положения в аминокислотной последовательности рассчитывается, используя величины p j - вероятности встречи y -аминокислоты в этом положении:
Если вероятность встречи той или иной аминокислоты в каком-то положении стремится к 1, то вероятности для других аминокислот будут стремиться к 0. В этом случае величина энтропии Н-, также будет стремиться к нулю, а для консервативных инвариантных остатков для /-положения Я,- = 0. Таким образом, нулевое значение энтропии Шеннона может быть использовано для поиска консервативных остатков в семействах тех или иных ферментов.
Сравнение термостабильности ФДГ из различных источников
Механизмы инактивации бактериальных и дрожжевых формиатдегидрогеназ исследованы в широком диапазоне температур [96]. Инактивация фермента из Pseudomonas sp.101 при 4-37 С связана с окислением сульфгидрильных групп, в первую очередь остатка Cys255 [97]. Окисление SH-группы этого остатка приводит к полной и необратимой инактивации фермента. Кривая инактивации имеет S-образный вид за счет сложности механизма реакции окисления. Процесс катализируется ионами переходных металлов, в частности, Cu2+, Ni2+ и Мп +.
Поэтому эффективными стабилизаторами фермента являются различные SH-соединения (ДТТ, Р-меркаптоэтанол), которые в концентрации 1-Ю мМ блокируют протекание первой стадии процесса инактивации - окисление сульфгидрильной группы остатка Cys255, а также хелатирующие реагенты, например ЭДТА (10 мМ), которые сильно снижают концентрацию свободных ионов металлов в растворе, в результате чего скорость окисления SH-групп также резко падает.
В случае дрожжевых ферментов кинетика процесса потери активности в диапазоне температур 4 - 37 С описывается простой экспонентой, а соответствующие процессу большие величины АҐ и AS? указывают на то, что происходит разворачивание белковой глобулы [65]. Однако было показано, что при комнатных температурах в присутствии ионов тяжелых металлов инактивация дрожжевых ФДГ частично связана с окислением сульфгидрильных групп молекулярным кислородом [14, 98-100]. Данные ферменты так же, как и РэеФДГ, стабилизируются восстановительными агентами, например, дитиотреитолом.
При температурах выше 50 С падение активности как бактериальной, так и дрожжевых ФДГ обусловлено исключительно термоденатурацией и описывается кинетикой реакции первого порядка [96].
В литературе можно найти большое количество способов количественного представления термостабильности ферментов. В случае ФДГ, многие авторы используют значения остаточной активности фермента после инкубации при определенной температуре в течение какого-то периода времени (15-30 мин) [9,10,24], или приводят значение Тм- температуры, при которой за 20 мин теряется 50% активности [14, 80, 87]. Недостатком первого подхода является то, что термоинактивация ферментов из разных источников может протекать по разным механизмам, и кинетика инактивации будет иметь сложную временную зависимость. Поэтому использование разных временных интервалов может привести к противоположным результатам. Более того, механиз термоинактивации фермента изменяется при увеличении температуры. Например, в случае ФДГ из S.cerevisiae, инактивация фермента при температурах до 42 С обратима, а при более высоких температурах протекает по механизму, включающему обратимую и необратимую стадии [27].
Сложный механизм инактивации также может быть причиной того, что при использовании разных периодов инкубации фермента профили значений Тм для одной и той же серии мутантов будут сильно отличаться друг от друга. Кроме того, значения Тм не дают возможность количественно оценить термостабильность фермента при других температурах. Наиболее объективно температурная стабильность ферментов может быть охарактеризована или с помощью исследования кинетики инактивации при разных температурах, или с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Первый подход дает количественные характеристики стабильности фермента при разных температурах, а метод ДСК позволяет количественно определить теплоту температурного перехода между нативным и денатурированным состояниями белковой глобулы.
Изучение термоинактиваци ФДГ дикого типа и мутантных форм из C.boidinii, Pseudomonas sp.101, M.vaccae N10, Moraxella sp.C-1 и S.cerevisiae показало, что процесс потери активности при увеличении температуры для всех этих ферментов, кроме БсеФДГ, является необратимым мономолекулярным процессом [77].
В таблице 2.4 представлены значения констант скоростей термоинактивации при 55 С для ФДГ из различных источников, а также значения Тм. Как следует из приведенных данных, ФДГ из Thiobacillus sp. KNK65MA является наименее стабильным ферментом. Учитывая результаты по замене остатков цистеина в других ФДГ, можно полагать, что одной из причин такой низкой стабильности может быть наличие в 255-м и 288-м положениях аминокислотной последовательности ТЬаФДГ остатков Val и Ala вместо остатка Cys (рис. 2.1). Наиболее стабильными ферментами оказались РвеФДГ и ее мутантные формы.
Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)
Измерения параметров тепловой денатурации белков: Тт - температуры денатурации (плавления) и Шкал - калориметрической энтальпии денатурации -проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (НПО «Биоприбор», Пущино, Россия). Рабочий объём капиллярных калориметрических ячеек из платины составлял 0,48 мл. Для предотвращения образования пузырьков и закипания растворов при повышении температуры в ячейках калориметра поддерживалось избыточное давление 2 атм. Калибровка приборов ДАСМ-4 осуществлялась путём подачи на одну ячейку фиксированной мощности (AW=25 МКВТ). Для каждого калориметрического эксперимента определяли инструментальную базовую линию. В обе калориметрические ячейки (рабочую и контрольную) помещали исходный буферный раствор и проводили прогрев при заданной скорости. Затем обе ячейки перезаправляли: в контрольную помещали тот же буферный раствор, а в рабочую - раствор исследуемой ФДГ. Концентрации ферментов варьировали от 0,25 до 3 мг/мл, а скорость прогрева - от 0,125до2С/мин.
Для проверки обратимости/необратимости процесса тепловой денатурации, после первого прогрева образца и записи зависимости теплоемкости раствора от температуры раствор фермента охлаждали и проводили повторный нагрев. Экспериментальные кривые корректировали путём вычитания приборной базовой линии, чтобы учесть имеющийся разбаланс ячеек. Калориметрическую энтальпию денатурации (Д#кал) рассчитывали из площади под кривой зависимости избыточной теплоемкости белка от температуры, температуру плавления (Тт) - как температуру максимума пика тешюпоглощения. Погрешность при расчете АНкал составляла 5-8%. Экспериментальная ошибка измерения Тт не превышала 0,2 С.
Для обработки и анализа кривых плавления использовали программные пакеты "Arina" (Россия) и "Origin" версий 1.16 и 7.0 фирмы «MicroCal». Для этой цели сначала из экспериментальной кривой плавления фермента вычитали базовую линию буферного раствора, а затем собственную химическую базовую линию, определённую с помощью тех же программных пакетов (получая при этом функцию избыточной теплоёмкости, отличную от нуля лишь в области, где происходит плавление образца), и после этого проводили анализ полученных кривых.
Спектры КД снимали на спектрополяриметре J-715 фирмы «Jasco» (Япония) в дальней УФ-области (190-250 нм). Для измерений использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 0,1 см («Hellma Cells», США). Концентрации ФДГ составляли 0,08-0,15 мг/мл. Результаты измерений выражали в единицах молярной эллиптичности, [0] (град-см -дмоль ), приходящейся на средний аминокислотный остаток, считая среднюю массу остатка равной 111 для ФДГ. Молярную эллиптичность рассчитывали по формуле [0] = (#xl00xMRW)/(c Z), где в- измеряемая эллиптичность в градусах, MRW-средняя масса остатка, с - концентрация белка в мг/мл и / - длина оптического пути в см. Спектрополяриметр калибровали с помощью (ё)-Ю-камфорсульфоновой кислоты, принимая [0]29i = 782O град-см2-дмоль"1 [127] и с помощью негигроскопического стандарта фирмы "Jasco" d-10-камфорсульфоната аммония, для которого [0]29о,5 = 7910 град-см2-дмоль 1 [128]. Шумы в спектрах КД сглаживали с помощью специальной программы спектрополяриметра J-715, которая позволяет выделять сигнал на фоне шума без искажения формы полос КД. Процент а-спиральности в белках рассчитывали по методу, разработанному Ченом и др. [129], используя формулу /н = -([0]222+234О)/ЗОЗОО, где [0]г22 - величина молярной эллиптичности раствора белка на длине волны 222 нм.
В отличие от бактериальных и дрожжевых ферментов, роль формиатдегидрогеназ в высших растениях довольно мало изучена. В высших растениях формиатдегидрогеназа локализована в митохондриальном матриксе, а также (как это было показано для Arabidopsis thaliana [53]) в хлоропластах. Исследования последних лет свидетельствуют, что в фотосинтезирующих тканях ФДГ является белком шока и ее синтез резко возрастает в листьях при различных воздействиях на растения (химические реагенты, пониженная температура, засуха, жесткий ультрафиолет и др.), а также при неблагоприятном составе почвы [40-42].
Гены всех растительных формиатдегидрогеназ на N-конце содержат сигнальный пептид, который отщепляется после транспорта внутрь митохондрий и хлоропластов. Структура этой последовательности очень консервативна - удаление с N-конца всего двух аминокислот полностью блокирует транспорт ФДГ в митохондрии [38]. На рисунке 4.1 представлены N-концевые последовательности генов растительных ФДГ из картофеля, Arabidopsis thaliana и сои Glycine max. Для сравнения приведена аналогичная последовательность для ФДГ из Pseudomonas sp.101. В последовательности ФДГ из картофеля курсивом выделена часть сигнального пептида, отщепляющаяся после попадания внутрь митохондрий [37]. Наличие сигнальной последовательности на N-конце растительных формиатдегидрогеназ осложняет получение этого фермента экспрессией в клетках E.coli. На данный момент в литературе нет данных по успешной экспрессии растительных ФДГ в клетках E.coli. Предпринятая попытка экспрессии ФДГ из картофеля Solanum tuberosum в клетках E.coli привела к образованию нерастворимых телец включения [37].
Изучение кинетических свойств рекомбинантных растительных формиатдегидрогеназ
Можно выделить следующие наиболее интересные результаты этой части работы: 1) Оказалось, что лучше всех кристаллизуется рекомбинантная ФДГ из бактерий Moraxella sp.C-1. Именно для нее были получены кристаллы с высоким разрешением до 1,1 А (табл. 4.14). Этот фермент высокогомологичен ФДГ из Pseudomonas sp.101 - в аминокислотных последовательностях РБЄФДГ И МОГФДГ имеется 86% идентичных остатков (92% с учетом подобных остатков). При этом в полученной структуре холо-формы ФДГ из Moraxella sp.C-1 были локализованы 399 из 401 аминокислотных остатков (рис. 4.26), в то время как в случае апо- и холо-форм РБЄФДГ [60] видны только 373 и 390 остатков из 400 в первой и второй субъединицах соответственно. Аминокислотные остатки с 388 по 395 в холо-форме МогФДГ образуют дополнительный элемент вторичной структуры - а-спираль аЮ (в соответствии с номенклатурой элементов вторичной структуры РзеФДГ, предложенной в работе [60]). Конформация С-концевых аминокислотных остатков в структуре МогФДГ показана на рисунке стабилизировано в основном гидрофобными контактами с боковыми группами аминокислотных остатков 316-319 ( -поворот) кофермент-связывающего домена МогФДГ. Кроме того, остатки с 392 по 399 в кристалле тройного комплекса МогФДГ образуют контакты с аминокислотными остатками 174-178 (/ -поворот) соседней молекулы димера. В структуре холо-формы РБЄФДГ аминокислотные остатки 374-391 фиксируют положение кофермента в активном центре, образуя четыре водородные связи с молекулой NAD+, и закрывают активный центр от растворителя. В описываемой структуре холо-формы МогФДГ аминокислотные остатки С-концевого участка полипептидной цепи 375-399 более плотно закрывают активный центр от растворителя за счет дополнительных 8 остатков, которые не удалось локализовать в структуре холо-формы РБЄФДГ (рис. 4.26). 2) В одной из структур РзеФДГ было показано, что атом серы остатка Cys354, консервативного для всех ФДГ, находится в виде -SO или даже -S03, (рис. 4.27). Т.е. со временем этот остаток окисляется, с чем, по-видимому, и связано образование различных изоформ при длительном хранении фермента в растворе. Проведенные ранее эксперименты по направленному мутагенезу Cys354 на остатки Ala, Ser и Arg показали, что этот остаток очень слабо влияет на стабильность, однако его окисление приводит к увеличению значения Кт по формиату в два-три раза и изменению значения pi. 3) Впервые получены кристаллы растительной АгаФДГ (рис. 4.28). Данные для тройного комплекса [АгаФДГ+NAD +N3 ] свидетельствуют о возможном образовании не только димерных, но и других олигомерных форм более сложного состава. Из рисунка 4.28 видно, что в случае холо-формы АгаФДГ элементарная ячейка содержит 6 димерных молекул или 12 отдельных субъединиц.
Таким образом, экспрессия ФДГ в клетках E.coli позволила выделить рекомбинантные ферменты в препаративных количествах, достаточных для оптимизации условий проведения кристаллизации. Были получены кристаллы 19 типов различных форм ФДГ из Pseudomonas sp.101 (и двух ее мутантных форм -РзеФДГОАУ, РзеФДГТ7), Moraxella sp.C-1 и A.thaliana. Кроме того, переход на фермент из Moraxella sp.C-1 впервые позволил локализовать всю аминокислотную последовательность ФДГ и получить качественные кристаллы, которые были сняты при высоких разрешениях. 1. Впервые проведена экспрессия растительных ФДГ в клетках Е.соїі в виде активных растворимых ферментов. Получены высокоочищенные препараты рекомбинантных ФДГ из Arabidopsis thaliana и Glycine max, изучены их кинетические свойства. Показано, что фермент из сои имеет наиболее низкие значения Кт по обоим субстратам; 2. Проведено исследование стабильности формиатдегидрогеназ из 6 источников с помощью ДСК, КД-спектроскопии и изучения кинетики инактивации. Показано, что тепловая денатурация исследованных ФДГ (кроме ЗсеФДГ) протекает в одну стадию и является необратимым процессом. В случае ФДГ из Saccharomyces cerevisiae процесс термоденатурации состоит из двух стадий, причем первая стадия является обратимой, а вторая - необратимой; 3. Различными методами определены количественные характеристики процесса теплового перехода при денатурации белковой глобулы формиатдегидрогеназ; 4. Изучено влияние ионной силы и присутствия кофермента (NAD+) и ингибитора (N3) на процесс денатурации. Показано, что повышение ионной силы, а также связывание ФДГ в двойной комплекс с [ФДГ+NAT/] И, особенно, тройной комплекс flr+NAD++N3 ] приводят к значительной стабилизации фермента; 5. Получены и решены кристаллические структуры различных форм исследуемых формиатдегидрогеназ.
