Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Ферментативные гидролизаты пищевых белков: получение и физико-химическая характеристика 12
2.2. Новые пищевые источники органических соединений
эссенциальных микроэлементов-переходных металлов 18
2.3. Биологическая роль цинка, его эссенциальность для организма человека 22
2.4. Оценка обеспеченности организма человека и животных цинком 25
3. Материалы и методы
3.1.1. Реактивы, оборудование 37
3.1.2. Лабораторные животные 38
3.2. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков 40
3.2.1. Ферментативный гидролизат белков коровьего молока 40
3.2.2. Ферментативный гидролизат белка куриного яйца 40
3.2.3. Ферментативный гидролизат изолята соевых белков 41
3.3. Получение комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков 43
3.4. Методы исследования 43
3.4.1. Хроматографическое определение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в составе ферментативных гидролизатов пищевых белков и их комплексов 43
3.4.2. Определение содержания общего белка 46
3.4.3. Определение содержания ингибитора трипсина -овомукоида куриного яйца 46
3.4.4. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс 47
3.4.5. Определение общего белка в сыворотке крови крыс 48
3.4.6. Определение содержания цинка в составе комплексов с ферментативными гидролизатами пищевых белков и биологическом материале 48
3.4.7. Количественный метод оценки антигенных свойств ферментативных гидролизатов пищевых белков и их комплексов с цинком 50
3.4.8. Метод оценки влияния комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных (крыс) 52
3.4.9. Оценка в опытах на лабораторных животных (крысах) всасывания и ретенции цинка в составе его комплекса с ферментативными гидролизатом белков коровьего молока 54
3.4.10. Оценка эффективности использования комплекса Zn-ФГБКМ и сульфата цинка в «восстановительном» кормлении лабораторных животных (крыс) 55
3.4.11. Статистическая обработка результатов исследований 56
4. Результаты и обсуждение
4.1. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков 57
4.1.1. Ферментативный гидролизат белков коровьего молока 57
4.1.2. Ферментативный гидролизат белков куриного яйца 60
4.1.3. Ферментативный гидролизат изолята соевых белков 63
4.2. Получение и физико-химическая характеристика комплексов
цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков 65
4.2.1. Содержание цинка в комплексах с ферментативными гидролизатами пищевых белков 66
4 4.2.2. Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков. Содержание цинка в пептидных фракциях 67
4.3. Определение in vitro антигенных свойств ферментативных гидролизатов пищевых белков и микроэлементных премиксов, содержащих комплексы этих гидролизатов с цинком 71
4.4. Влияние премиксов, содержащих комплексы цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков, на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных (крыс) 74
4.6. Оценка всасывания и ретенции цинка в составе комплекса цинка с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока 78
4.5. Сравнительная оценка эффективности использования комплекса Zn-ФГБКМ и сульфата цинка в «восстановительном» кормлении лабораторных животных (крыс), получавших предварительно цинкдефицитный корм 80
5. Заключение 84
6. Вывода 93
7. Список литературы 95
- Ферментативные гидролизаты пищевых белков: получение и физико-химическая характеристика
- Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков
- Метод оценки влияния комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных (крыс)
- Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков
Введение к работе
Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма как макро, так и микронутриентами, в том числе и эссенциальными микроэлементами. При этом предполагается не только необходимое количественное содержание микроэлементов в пище, но также их соответствующие химические формы и физиологически обоснованные соотношения с другими компонентами пищи, наиболее полно удовлетворяющие потребности организма.
Цинк наряду с железом, медью, селеном, йодом, марганцем, молибденом, хромом и кобальтом относится к эссенциальным микроэлементам, массовая доля которых в организме человека составляет 10 3-10"5%. Биохимические механизмы действия цинка связаны с участием в построении и функционировании более 200 ферментов, катализирующих различные метаболические процессы, включающие синтез и распад углеводов, жиров, белков и нуклеиновых кислот. Неадекватная обеспеченность организма данным микроэлементом приводит к задержке роста, развития, полового созревания; снижению иммунитета, репродуктивной функции; нарушениям кроветворения, вкуса и обоняния; репарации ран и другим нарушениям [1, 66, 111, 127]. На основании балансовых исследований, проведенных специалистами ФАО в 176 странах, Международная консультативная группа по цинку в питании (International Zinc Nutrition Consultative Group) сделала заключение, что около 20% населения мира имеют риск неадекватной обеспеченности цинком [136] с учетом имеющихся сведений по усвоению цинка из наиболее употребляемых продуктов питания в данной стране. Согласно данным эпидемиологических исследований в ряде регионов Российской Федерации выявлена высокая частота встречаемости недостаточной обеспеченности цинком, особенно у детского населения [12, 26, 28]. Соответственно весьма актуальной является задача профилактики и диетической коррекции недостаточной обеспеченности этим эссенциальным для организма человека микроэлементом путем использования в питании специализированных обогащенных продуктов и биологически активных добавок (БАД) к пище - дополнительных источников цинка. При этом фактическое содержание цинка, как и других микроэлементов, в диете без учета его биологической доступности (химической формы, содержания других компонентов в пище, способствующих или препятствующих его усвоению) не является показателем объективной оценки адекватной обеспеченности пищи минеральными микронутриентами [63, 130]. В связи с тем, что обогащение пищевых продуктов микронутриентами является серьезным вмешательством в традиционно сложившуюся структуру питания человека, к дополнительным пищевым (и часто нетрадиционным) источникам эссенциальных микроэлементов должны предъявляться повышенные требования, обеспечивающие как их полную безопасность, так и достаточную эффективность. Известно, что цинк из продуктов животного происхождения усваивается намного лучше, чем из растительных источников. Главным диетическим фактором, препятствующим усвоению цинка из растительной пищи, являются фитаты. Значение молярного отношения фитатыщинк в диете, превышающее 15, сопряжено с нарушением статуса цинка у обследуемого контингента населения [85]. Эффективным фактором, способствующим лучшему усвоению цинка организмом, является белок животного происхождения, а также аминокислоты и пептиды [1, 19, 86], с которыми цинк может образовывать растворимые и достаточно устойчивые комплексы. В повседневной жизни человек потребляет эссенциальные микроэлементы, в том числе и цинк, в составе растительных и животных продуктов, в связи с этим представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами цинка. Одним из
возможных вариантов решения проблемы поиска таких новых пищевых источников эссенциальных микроэлементов, к которым относится цинк, является его комплексирование с аминокислотами и пептидами в составе ферментативных гидролизатов пищевых белков. Целью данной работы явились получение новых пищевых источников органических форм цинка, их комплексная физико-химическая, физиолого-биохимическая характеристика и экспериментальная оценка возможности использования этих пищевых источников для профилактики и диетической коррекции недостаточности данного микроэлемента. Основные задачи исследования 1. Оптимизировать условия ферментативного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков) для дальнейшего использования ферментолизатов при получении новых пищевых источников цинка. 2. Получить комплексы ферментативных гидролизатов вышеперечисленных пищевых белков с цинком, охарактеризовать молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе комплексов и определить в них содержание цинка. 3. В исследовании in vitro оценить антигенные свойства ферментативных гидролизатов пищевых белков и их комплексов с цинком. 4. Количественно охарактеризовать протекание реакции системной анафилаксии к модельному антигену - овальбумину у крыс, получавших с кормом комплексы цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков. 5. Охарактеризовать всасывание и ретенцию цинка в форме комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока у лабораторных животных (крыс) в условиях недостаточного потребления этого микроэлемента. 6. Дать сравнительную оценку эффективности потребления лабораторными животными (крысами), предварительно получавшими цинкдефицитный корм, органической формы цинка - комплекса ферментативного гидролизата белков коровьего молока с этим микроэлементом и сульфата цинка. Научная новизна Определены оптимальные условия ферментативного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков) для их последующего комплексирования с цинком в целях получения новых пищевых источников этого микроэлемента.
Охарактеризовано молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе комплексов ферментативных гидролизатов пищевых белков с цинком и определено фракционное содержание этого микроэлемента.
В опытах in vitro установлено практически полное отсутствие в составе комплексов ферментативных гидролизатов пищевых белков с цинком антигенных детерминант, взаимодействующих с антителами к пищевым белкам в сыворотках крови детей, страдающих пищевой непереносимостью.
В опытах in vivo установлено, что длительный пероральный прием комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков не влияет на тяжесть проявлений реакций системной анафилаксии у лабораторных животных (крыс), многократно сенсибилизированных модельным антигеном (анафилактогеном) - овальбумином.
Количественно охарактеризованы всасывание и ретенция органического соединения цинка - его комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока у лабораторных животных (крыс) в условиях недостаточного потребления ими этого микроэлемента.
Дана сравнительная оценка эффективности использования нового пищевого источника органической формы цинка (его комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока) и сульфата цинка в «восстановительном» питании крыс, предварительно получавших в течение 14 дней цинкдефицитный полусинтетический корм.
Практическая значимость
Предложенные для лабораторных условий схемы проведения процессов ферментативного гидролиза пищевых белков (концентрата белков коровьего молока, белка куриного яйца, изолята соевых белков) могут быть использованы для разработки схем промышленного получения пищевых ферментативных гидролизатов перечисленных белков. Полученные таким способом ферментативные гидролизаты при комплексировании с цинком представляют собой новые пищевые источники органических форм этого микронутриента.
Высокое содержание в составе полученных комплексов цинка и отсутствие сенсибилизирующих и аллергизирующих свойств свидетельствуют о возможных перспективах их использования в целях алиментарной профилактики случаев недостаточной обеспеченности этими микронутриентами детского и взрослого населения. На примере органического соединения цинка - его комплекса с ферментативным гидролизатом белков коровьего молока предложен и апробирован метод оценки всасывания и ретенции микроэлемента в опытах на лабораторных животных (крысах). Метод может найти своё применение для характеристики биодоступности различных пищевых источников микро- и макроэлементов.
Апробация работы
Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на XIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2005 г.; на 7-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро 2005»; на XI Российской гастроэнтерологической неделе, Москва, 2005г.; на VIII Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации», Москва, 2005г; на I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты», Москва, 2006.
Ферментативные гидролизаты пищевых белков: получение и физико-химическая характеристика
История использования ферментативных гидролизатов пищевых белков в специализированных продуктах питания насчитывает уже более 50 лет, тем не менее, вопросы производства и использования ферментативных гидролизатов белка и продуктов на их основе остаются по-прежнему предметом интенсивного научного исследования технологами, биохимиками и нутрициологами. Ферментными препаратами животного происхождения, традиционно используемыми при гидролизе белка, являются трипсин (К.Ф. 3.4.21.4), химотрипсины (К.Ф. 3.4.21.1), пепсины (К.Ф. 3.4.23.1-3.4.23.3), химозин (ренин) (К.Ф. 3.4.23.4), эластаза (К.Ф. 3.4.21.11) и коллагеназа (3.4.24.3), панкреатические карбоксипептидазы (К.Ф. 3.4.17.1, 3.4.17.2). Для повышения эффективности гидролиза применяются коммерческие панкреатические ферментные препараты, из поджелудочной железы свиньи или крупного рогатого скота, полученные с использованием мембранных технологий, и различных способов активации проферментов [58, 91]. Для устранения горьких пептидов, - особенно характерных для гидролизатов казеина, - применяются ферментные препараты, обладающие аминопептидазной активностью, обычно их получают из слизистой кишечника свиньи [44, 61]. Для промышленного получения ферментативных гидролизатов пищевых белков в настоящее время активно используются протеазы микроорганизмов, поскольку грибы, актиномицеты, бактерии и бациллы являются высокоэффективными продуцентами протеолитических ферментов широкого спектра действия [30]. Наиболее популярные промышленные протеазы вырабатываются из культур Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, В Amyloliquefaciens, Rhizopus sp (нейтральные протеазы); В. Licheniformis, В Thermoproteolyticus, Endothia parasitica, Mucor miehei, Mucor pussilus (микробный реннин). В качестве распространенной альтернативы ферментативным гидролизатам белка в большинстве видов специализированных продуктов рассматриваются смеси кристаллических L-аминокислот. Однако, согласно положениям теории рационального питания академика АМН СССР А.А. Покровского [21] и теории адекватного питания, сформулированной академиком А.М.Уголевым [32], нутритивные потребности организма в наилучшей степени удовлетворяются теми формами пищевых веществ, к которым организм адаптирован в ходе своего эволюционного развития. С этой точки зрения использование в питании больных смесей, белковый компонент которых представлен смесями кристаллических L-аминокислот, представляется не оптимальным, поскольку в составе продуктов, составляющих естественный рацион человека (как взрослого, так и ребенка), свободные аминокислоты в сколько-нибудь значимых количествах, как правило, отсутствуют. Преимуществами пептидных препаратов в сравнении со смесями аминокислот является их значительно меньшая осмолярность, способность ряда пептидов проявлять полезные виды биологической активности при пероральном приеме: стимулирующее влияние пептидов на активность ферментов пристеночного пищеварения, эффекты усиления абсорбции ряда эссенциальных минеральных веществ (кальций, цинк, медь, возможно железо) под действием пептидных фрагментов пищевых белков, а также существенно лучшие, чем у свободных аминокислот, функциональные свойства (растворимость, эмульгирующая способность) [30, 80, 89].
В настоящее время можно выделить следующие основные направления использования ферментативных гидролизатов в питании:
1) Гипоаллергенные продукты (смеси) для питания детей раннего возраста, страдающих аллергическими реакциями или входящих в группу риска по развитию таких состояний. 2) Продукты с модифицированным аминокислотным составом, предназначенные для питания больных с врожденными нарушениями белкового обмена (такими, как фенилкетонурия). 3) Использование гидролизатов в качестве легкоусвояемого источника белка в продуктах для больных с нарушенной функцией пищеварения, продуктах для энтерального зондового питания и специализированных белковых продуктов для питания спортсменов. 4) Получение премиксов на основе комплексов пептидов с эссенциальными микроэлементами (ЭМ) (цинком, медью, хромом и др.) для использования в качестве обогатителей различных видов продуктов детского и диетического питания, а также в составе БАД к пище. Отличительная особенность этих премиксов - органическая форма составляющих их ЭМ. Одним из известных способов получения органических соединений эссенциальных микроэлементов (ЭМ) d-ряда периодической таблицы химических элементов является реакция хелатирования с аминокислотами и пептидами. Данный методический подход представляется перспективным для получения новых пищевых источников органических форм этих микроэлементов путем комплексирования с ферментативными гидролизатами пищевых белков. Ниже будут кратко охарактеризованы методы получения ферментативных гидролизатов пищевых белков, физико-химические свойства этих гидролизатов и их комплексирование с микроэлементами d-ряда периодической таблицы химических элементов.
Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков
Ферментативный гидролиз концентрата белков коровьего молока (БКМ) проводили по одностадийной схеме с использованием «Панкреатина» в различных концентрациях. Для этого 5% водный раствор концентрата белков коровьего молока выдерживали при температуре 50С в течение 1 ч при перемешивании, затем доводили рН раствора до 7,5 и добавляли «Панкреатин» в количестве 1,5; 3,0; 6,0; 9,0% от массы субстрата. Ферментолиз проводили в течение 2 и 4 часов при 50С и перемешивании, поддерживая рН реакционной среды 7,3-7,5 добавлением 1,0 М NaOH.
Через каждый час после начала гидролиза отбирали пробы и выдерживали 5 мин на водяной бане. Затем анализируемые пробы центрифугировали при 4000 g в течение 30 мин и в супернатантах оценивали молекулярно-массовое распределение методом эксклюзионной хроматографии, как описано в разделе 3.4.1.
По окончании времени гидролиза реакционную смесь выдерживали на водяной бане при 95 С в течение 10 минут для инактивации фермента и осаждения негидролизованного белка. После центрифугирования при 3000 g в течение 30 мин отбирали супернатант, который в дальнейшем использовали для получения комплексов с цинком.
Ферментативный гидролиз белка куриного яйца (БКЯ) проводили по двухстадийной схеме с последовательным использованием ферментных препаратов «Флавоэнзим» и «Панкреатин» с нативным и термически денатурированным субстратом.
Белки свежих куриных яиц отделяли от желтков и лиофильно высушивали. Лиофильно высушенный нативный субстрат БКЯ хорошо растворялся в воде, значение рН 5%-ного водного раствора составляло 9,6. Денатурированный субстрат БКЯ получали, растворяя лиофильно высушенный нативный БКЯ в дистилированной воде (3,3% раствор) и нагревая на водяной бане при 80-85С в течение 25 мин.
Протеолиз нативного БКЯ проводили по следующей схеме. На первой стадии к 200 мл 5%-ного водного раствора яичного белка при 50С и перемешивании добавляли 500 мг «Флавоэнзима» при трех различных начальных значениях рН растворов: 5,5; 6,5 и 7,5. Гидролиз вели в течение 22 ч при 50 С и перемешивании, рН растворов поддерживали в пределах ± 0,1 единиц от исходного значения. После этого на второй стадии всех трех экспериментов рН растворов доводили до 7,5 добавлением 1,0 N NaOH, затем вносили 300 мг «Панкреатина» и продолжали вести гидролиз при 50 С и перемешивании, поддерживая значение рН растворов 7,5±0,1 в течение 5 ч. Гидролиз денатурированного БКЯ (3,3% раствор) проводили аналогично при двух различных начальных значениях растворов 5,5 и 6,5. Через 3, 6 и 22 ч после начала гидролиза «Флавоэнзимом», а также 3 и 5 ч после гидролиза панкреатином отбирали пробы на анализ (раздел 3.4.1.).
После 22 ч гидролиза, последующего выдерживания реакционной среды на водяной бане и центрифугирования (как описано в разделе 3.2.1.) отбирали супернатант для следующей стадии работы.
Ферментативный гидролиз изолята соевых белков (ИСБ) проводили по одно- и двухстадийной схемам, каждая из которых включала два варианта. Одностадийный гидролиз осуществляли с использованием «Флавоэнзима» или «Панкреатина».
Для этого к 200 мл 5% водного раствора ИСБ (при 50С и перемешивании) добавляли ферментные препараты: «Флавоэнзим» (3 и 5% от массы субстрата) или «Панкреатин» (1,5; 3 и 6% от массы субстрата). Гидролиз «Флавоэнзимом» проводили в течение 22 ч при температуре 50С, рН реакционной среды поддерживали на уровне 6,3-6,5. Продолжительность гидролиза «Панкреатином» составляла 6 ч при рН 7,3-7,5 и температуре 50С.
Через 3, 6 и 22 ч после начала гидролиза «Флавоэнзимом» или через 3 и 6 ч после гидролиза «Панкреатином» отбирали пробы на анализ. Анализируемые пробы предварительно выдерживали на кипящей водяной бане в течение 10 мин; затем охлаждали и центрифугировали при 4000 g в течение 40 мин; в супернатантах оценивали молекулярно-массовое распределение пептидов.
В 1-ом варианте двухстадийного гидролиза использовали на I стадии «Флавоэнзим» в концентрации 5% от массы субстрата; длительность этой стадии гидролиза составляла 22 ч. Затем реакционную смесь выдерживали на водяной бане в течение 15 минут при температуре 85С. После охлаждения до 50С рН реакционной смеси доводили до 7,5 добавлением 1н. NaOH для проведения II стадии - ферментолиза «Панкреатином», который добавляли в количестве 3% от массы исходного ИСБ; время ферментолиза - 6 часов.
Во 2-ом варианте двухстадийного гидролиза I стадию гидролиза проводили с использованием «Панкреатина» в количестве 3% от массы ИСБ (время реакции 6 ч), II стадию - с «Флавоэнзимом» в количестве 5% от массы исходного субстрата (время реакции - 22 ч). Гидролиз проводили в условиях, описанных ранее и оптимальных для каждого фермента.
Метод оценки влияния комплексов цинка с ферментативными гидролизатами пищевых белков на степень сенсибилизации и протекание реакции анафилаксии у лабораторных животных (крыс)
Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Вистар, с исходной массой тела 180±10 г. На протяжении всего эксперимента животные получали стандартный рацион вивария ГУ НИИ питания РАМН и воду без ограничений. Комплексы Zn-ФГПБ вводили в корм животных опытной группы в составе микроэлементного премикса, содержащего дополнительно медь, марганец, хром в форме комплексов с ФГПБ в определенных соотношениях. Состав премиксов 3 серий опыта приведен в табл. 7.
Проведено 3 серии экспериментов с использованием премиксов, составленных на основе комплексов ЭМ-ФГБКМ, ЭМ-ФГБКЯ, ЭМ-ФГИСБ. Крысы контрольной группы получали стандартный рацион без добавок. Общая продолжительность кормления животных рационами составляла 28 дней. Модель системной анафилаксии воспроизводилась согласно [119] с незначительными модификациями, как описано в работе [8, 16].
На 1-й, 3-й и 5-й день опыта крыс внутрибрюшинно сенсибилизировали дозой 100 мкг овальбумина куриного яйца (ОВА, 5 кратно перекристаллизованный препарат), адсорбированного на 10 мг гидроксида алюминия. На 21-й день опыта вводили дополнительно еще 10 мкг ОБА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа. По окончании кормления животных опытными рационами на 29-й день у крыс отбирали по 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения ответа антител, после чего вводили внутривенно разрешающую дозу 30 мг ОБА на 1 кг массы тела в 0,5 мл изотонического апирогенного 0,15 М NaCl. Наблюдали развитие симптомов активного анафилактического шока в течение 24 часов.
Тяжесть реакции анафилактического шока оценивали в баллах в соответствии со шкалой: + (1)- озноб, одышка ++ (2) - слабость, атаксия, цианоз конечностей +++ (3) - судороги, паралич ++++ (4) - летальный исход.
Величину анафилактического индекса (АИ) рассчитывали согласно [132] как среднее арифметическое балльных оценок тяжести анафилаксии по группе по данным наблюдения через 24 ч после введения разрешающей дозы.
Интенсивность гуморального иммунного ответа оценивали по концентрации циркулирующих специфических антител IgG антител (суммы фракций IgGl и IgG4) с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (ELISA) на полистироле.
В лунки полистирольных планшет вносили по 1,0 мкг ОВА в 0,1 М Na-бикарбонатном буфере рН 9,7 и оставляли на 16 часов при температуре 4-6С в холодильнике. По окончании адсорбции антигена буфер удаляли путем промывки 0,01 М Na-фосфатным буфером (PBS) рН 7,3 с 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-PBS. Отмывку повторяли, после чего вносили в лунки по 100 мкл стандартов крысиных антител к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии, или исследуемых сывороток крови крыс в разведении 1:2000. Разведения выполнили в PBS с 0,2% бычьего сывороточного альбумина (BSA-PBS). Планшеты инкубировали 120 мин при 20С при встряхивании, после чего 5-кратно отмывали Твин-PBS и вносили по 100 мкл кроличьих антител к IgGl+4 крысы, конъюгированных с пероксидазой (производства НИИЭМ им. Гамалеи РАМН), в разведении 1:4000 в BSA-PBS. Инкубацию и отмывку повторяли, после чего проводили реакцию со 100 мкл субстрата 0,04% о-фенилендиамина и 0,04% Н202 в 0,1 М Na-цитрат фосфатном буфере рН 6,00±0,05 в течение 15 мин при 37 С. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1н. H2SO4. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Эфос 9305».
Концентрации IgG антител в сыворотках крыс определяли по стандартной кривой путем линейной экстраполяции в полулогарифмических координатах. Эксперимент проводили на 6 крысах самцах линии Вистар с исходной массой тела 140-150 г. После 7 дней карантина животных кормили базовым полусинтетическим кормом с пониженным содержанием цинка (1,3мг/кг рациона). На 12 день эксперимента животным вводили внутрижелудочно через зонд по 270 мкг Zn в виде Zn-ФГБКМ. Затем крыс помещали в обменные клетки и собирали кал и мочу в течение суток для определения показателей, характеризующих усвояемость в составе Zn-ФГБКМ. При этом использовали показатели, аналогичные коэффициентам, применяемым в балансовых исследованиях, характеризующих биодоступность белка [6].
Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков
При получении ферментативных гидролизатов цельного белка коровьего молока (БКМ) применяли схему одностадийного гидролиза при рН 7,5 и температуре 50С с использованием ферментного препарата «Панкреатина». В табл. 9 приведено изменение молекулярно-массового распределения пептидных фракций в составе ферментолизата в ходе гидролиза БКМ «Панкреатином» в зависимости от времени гидролиза и фермент-субстратного соотношения.
Из приведенных результатов видно, что увеличение концентрации «Панкреатина» в реакционной смеси приводит к увеличению содержания низкомолекулярных структур (менее 1,0 кД), причем при концентрациях фермента 3, 6 и 9% уже через 2 ч практически достигается максимальное содержание низкомолекулярных структур. Увеличение времени гидролиза более 4 ч и фермент-субстратного соотношения (до 6% и 9% фермента), по всей видимости, не приводит к заметному увеличению степени гидролиза. Таким образом, использование ферментного препарата «Панкреатин» позволяет получать гидролизаты БКМ со значительной степенью гидролиза при концентрации фермента 3% от массы белка. При получении ФГБКМ в препаративных количествах для дальнейшего использования в реакциях комплексообразования проводили гидролиз в течение 3 ч при 2% содержании «Панкреатина» и значении рН 7,3-7,5. На рис. 4 приведена эксклюзионная хроматограмма ФГБКМ (ультрафильтрата), полученная с использованием колонки «Superose 12».
В отличие от ферментолиза белков коровьего молока, при получении ФГБКЯ использовали двухстадийную схему проведения гидролиза с предварительной термической денатурацией. Использование двухстадийной схемы объясняется наличием в составе БКЯ высокоактивного ингибитора сериновых протеиназ - овомукоида в субстанциальных количествах (около 10%) [115], а также ряда других ингибиторов (овоингибитора, овостатина, цистатина), затрудняющих проведение ферментативного гидролиза БКЯ. Термическая обработка частично или полностью инактивирует данные ингибиторы, при этом температура и рН имеют существенное влияние [94, 129].
Нами была проведена предварительная тепловая денатурация 3,3% водного раствора БКЯ при значениях рН 9,6 (рН раствора нативного БКЯ) и рН 7,6; температуре 80 и 90 С в течение 15 и 30 мин. В образцах определяли содержание ингибитора трипсина в условных единицах, эквивалентных содержанию ИТБС (см. раздел 3.4.3.).
Как видно из рис. 5 (А и Б), наименьшее содержание ингибитора трипсина отмечается при проведении тепловой обработки при рН 9,6 в течение 30 мин как при 80 С, так и при 90С. Тепловая обработка при рН 7,6 оказалась менее эффективной, так как достигнуто снижение содержания ингибитора трипсина в 5,9 раза против 26 при рН 9,6.
В дальнейших экспериментах нами были изучены схемы ферментативного гидролиза БКЯ как со стадией предварительной термической денатурации, направленной на уменьшение активности ингибитора активности протеолитических ферментов и увеличения доступности белка для протеолиза, так и без нее; исследована зависимость эффективности гидролиза от рН и времени проведения эксперимента. С целью увеличения выхода растворимой белково-пептидной фракции проводили вторую стадию гидролиза всех субстратов с использованием «Панкреатина» при рН 7,5 в течение 5 ч.
В итоговом гидролизате с предварительно денатурированным БКЯ содержание структур с молекулярной массой менее 2,1 кД составило 63,8 и 65,5%. Но в варианте с проведением первой стадии гидролиза «Флавоэнзимом» при рН 6,5 выход растворимого белкового продукта составлял более 90%, а при проведении первой стадии гидролиза при рН 5,5 потери белкового материала оказались значительными: около 30% осталось в осадке.
Таким образом, в результате проведенного исследования нами определено, что предварительная термическая обработка БКЯ облегчает дальнейшее проведение ферментативного гидролиза. Наиболее оптимальными условиями явились: термическая денатурация БКЯ при температуре 80С в растворе с рН 9,6; проведение ферментативного гидролиза по двухстадийной схеме с использованием «Флавоэнзима» при значении рН 6,5 и последующим гидролизом «Панкреатином» в течение 5 ч. В итоговом гидролизате более 60% приходится на долю низкомолекулярных пептидов (менее 2,1 кД) при минимальных потерях исходного белка.
При получении ФГБКЯ в препаративных количествах, использовавшегося в дальнейшем для получения комплексов с ЭМ, проводили двухстадийный гидролиз БКЯ с предварительной термической денатурацией согласно условиям, приведенным на рис. 3.
