Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм селена Егорова Екатерина Александровна

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 14

2.1. Селен - эссенциальный микроэлементе питании человека 14

2.2 Новые пищевые источники селена - объекты современной биотехнологии 23

2.2.1. Spirulina platensis (Arthrospira platensis) 24

2.2.2. Селенсодержащая Spirulina platensis 27

2.2.3. Дрожжи пищевые 31

2.2.4. Селенсодержащие пищевые дрожжи 32

2.2.5. Лактобациллы 34

2.2.5. Селенсодержащие лактобациллы 38

3. Экспериментальная часть 41

3.1. Материалы и методы исследований 41

3.1.1 .Объекты исследования 41

3.1.1.1 .Штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3 41

3.1.1.2. Селенсодержащий штамм Lactobacillus plantarum 8RA -3 41

3.1.1.3. Spirulina platensis (Arthrospira platensis) 42

3.1.1.4. Селенсодержащая Spirulina platensis 42

3.1.1.5.Фикоцианин 43

3.1.1.6. Селенсодержащий фикоцианин 44

3.1.1.7. Лабораторные животные 45

3.1.2.Методы исследований 46

3.1.2.1. Биохимические и иммунологические методы 46

3.1.2.1.1. Метод оценки биодоступности селена в составе исследуемых препаратов 46

3.1.2.1.2.Метод определения клеточного состава перитонеального экссудата мышей 47

3.1.2.1.3. Метод определения фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата мышей 48

3.1.2.1.4. Метод определения количества антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей 50

3.1.2.1.5. Метод оценки вторичного иммунного ответа к куриному овальбумину у крыс 51

3.1.2.2.Физико - химические методы анализа 54

3.1.2.2.1. Метод определения селена 54

3.1.2.2.2. Электрофоретический метод определения молекулярной массы фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина 55

3.1.2.2.3. Методы спектрофотометрии и флуоресценции, использованные для определения содержания и спектральных характеристик фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина 58

3.1.2.3. Статистическая обработка результатов исследований 59

3.2. Результаты исследований и их обсуждение 60

3.2.1. Получение селенсодержащего штамма Lactobacillus plantarum 8RA-3 60

3.2.2. Выделение и характеристика фикоцианина из Spirulina platensis (Arthrospira platensis) 63

3.2.3. Выделение и характеристика селенфикоцианина из селенсодержащей Spirulina platensis (Arthrospira platensis) 68

3.2.4. Оценка биодоступности селена в составе исследуемых препаратов 71

3.2.5. Влияние фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина на клеточный состав перитонеального экссудата мышей 80

3.2.6.Влияние селенсодержащего фикоцианина на фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата мышей 84

3.2.7. Влияние фикоцианина и селенфикоцианина на количество антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей 85

3.2.7. Оценка влияния препарата селенфикоцианина

на вторичный иммунный ответ к куриному овальбумину у

крыс 86

4.3аключение 89

5.Выводы 101

6.Список литературы 103

• Селен - эссенциальный микроэлементе питании человека
• Селенсодержащие пищевые дрожжи
• Метод оценки вторичного иммунного ответа к куриному овальбумину у крыс
• Оценка биодоступности селена в составе исследуемых препаратов

Введение к работе

Так же, как и в других научных дисциплинах, результаты исследований, накопленные в различные периоды развития науки о питании (нутрициологии) получали своё теоретическое выражение в виде определенных концепций. В настоящее время в стадии становления находится концепция оптимального питания - система современных представлений науки о питании, основанная на последних достижениях фундаментальных физиолого-биохимических и эпидемиологических исследований и новых научных дисциплин: нутригеномики, протеомики и метаболомики. Продолжая и одновременно развивая основные положения теории рационального питания А.А. Покровского [32] и теории адекватного питания A.M. Уголева [42], концепция оптимального питания предполагает необходимость адекватного обеспечения организма человека как макро, так и микронутриентами и минорными компонентами пищи [40]. В настоящее время существенно расширились представления об эссенциальности для организма человека многих микронутриентов и минорных компонентов пищи, не рассматривавшихся ранее в качестве факторов, необходимых для обеспечения его нормальной жизнедеятельности. Получены убедительные свидетельства их участия в метаболизме, и с позиций доказательной медицины, соответственно, установлено, что при дефиците (недостаточности) этих биологически активных веществ в рационе человека имеет место снижение резистентности к неблагоприятным факторам окружающей среды (феномен маладаптации), формирование иммунодефицитных состояний, нарушение функций систем антиоксидантной защиты, хронизация болезней, повышение риска развития распространенных заболеваний, снижение качества жизни и эффективности лечебных мероприятий [39].

Чрезвычайно важным в плане значения концепции оптимального питания для практического обеспечения здоровья населения является положение о том, что у современного человека имеет место недостаточное

поступление с пищей микронутриентов и минорных компонентов пищи вследствие снижения энерготрат и, соответственно, уменьшения общего количества потребляемой пищи. Негативное влияние на обеспеченность населения микронутриентами и минорными компонентами пищи оказывают также новые технологии, используемые в сельском хозяйстве (как в земледелии, так и животноводстве) и современные способы переработки пищевой продукции.

Положение о регулярном потреблении пищевых продуктов,
обогащенных микронутриентами, как важнейшем факторе оптимизации
питания и здоровья человека является научным обоснованием, во-первых, для
обогащения ими продуктов массового потребления для всех групп детского и
взрослого населения и регулярно используемых в повседневном питании и,
во-вторых, для широкого производства биологически активных добавок к
пище (БАД) и специализированных продуктов, используемых
преимущественно в профилактическом питании. Недопустимость

бесконтрольного обогащения БАД, специализированных продуктов и тем более продуктов массового потребления микронутриентами, вследствие опасности возможных передозировок последних и соответствующего неблагоприятного воздействия их на организм человека, предполагает физиологическое обоснование адекватного и верхнего допустимого уровней их потребления. Это положение концепции оптимального питания реализовано Методическими рекомендациями МР.2.3.1.1915-04 «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ» (утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и введены в действие 02.07.2004 г.). Важно представлять, что все перечисленные в документе природные вещества и соединения характерны для традиционных пищевых продуктов животного и растительного происхождения, однако, их содержание в последних недостаточно высоко. Это обстоятельство в свою очередь определяет необходимость получения новых пищевых источников микронутриентов и

других минорных биологически активных компонентов пищи, оценки их безопасности и эффективности. Концепция оптимального питания предъявляет жесткие требования к форме, в которой искомое биологически активное соединение находится в составе нового пищевого источника. Правила соответствия химического состава пищи ферментным взаимоотношениям организма на всех уровнях её ассимиляции относятся и к определенным микронутриентам, в первую очередь эссенциальным микроэлементам (ЭМ). Констатируется целесообразность использования в составе БАД и для обогащения пищевых продуктов органических форм ЭМ, так как на протяжении эволюции человека как вида и в его современной жизни преимущественно органические соединения этих микронутриетов потреблялись и потребляются им в составе растительной и животной пищи [22]. Особенно убедительно, на наш взгляд, этот тезис иллюстрируется на примере селена - микроэлемента, токсичность которого была известна уже очень давно, а представления об эссенциальности берут начало с 1957 года в связи с открытием селенсодержащего фермента антиоксидантной защиты -глутатионпероксидазы [7].

Селен относится к микроэлементам, для которых интервал между адекватным и максимально допустимым уровнем потребления сравнительно узок и во многом зависит от того, в какой форме селен поступает в организм. В пищевых продуктах животного и растительного происхождения, практически весь селен представлен в органической форме. При этом, в продуктах животного происхождения преобладает селеноцистеин, а в продуктах растительного происхождения - селенометионин [44]. Однако в достаточно большом количестве БАД отечественного и зарубежного производства в качестве пищевого источника селена используются его неорганические соединения, в основном в виде селенитов и селенатов. Как органические, так и неорганические соединения селена достаточно эффективно всасываются в желудочно - кишечном тракте. При этом селенит и селенат анионы восстанавливаются ферментативным путем до селеноводорода. Возможности

утилизации последнего в организме ограничены в количественном отношении, и при поступлении в организм избыточных количеств неорганического селена он может накапливаться в тканях в форме свободного высоко токсичного гидроселенид аниона. В то же время селенометионин и селеноцистеин, наряду с метаболизацией до селеноводорода, утилизируются по иному пути, включаясь в состав селенометионина и селеноцистеина тканевых белков, что существенно повышает значение предельно допустимой концентрации (ПДК) и, соответственно, уменьшает риск неблагоприяного воздействия на организм в случае передозировки селена в этой форме по сравнению с его неорганическими соединениями. Исходя из вышеизложенного, проблема поиска новых пищевых источников органических форм селена и оценки их биологического действия весьма актуальна. Перспективен биотехнологический путь получения пищевых источников этого несомненно эссенциального для организма человека микроэлемента, в частности, использование в качестве «объектов для биотехнологического встраивания» бактерий рода Lactobacillus и микроводоросли Spirulina platensis. В нашей работе предпринята попытка провести исследования, позволяющие оценить возможности использования вышеназванных биоматриц для встраивания селена с целью получения новых пищевых источников этого ЭМ.

Научная новизна

Оптимизированы условия культивирования биомассы селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и в опытах in vivo охарактеризована биодоступность селена в составе выращенной биомассы.

Впервые при использовании в качестве исходного сырья биомассы селенсодержащей Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) выделен и очищен препарат селенсодержащего фикоцианина. Сравнительными исследованиями in vivo установлена высокая биодоступность селена в составе препарата селенсодержащего фикоцианина.

11 Впервые получены результаты, свидетельствующие о стимулирующем влиянии препаратов селенсодержащего фикоцианина различной степени очистки на клеточное и гуморальное звенья иммунитета у лабораторных животных (мыши линии DBA и крысы линии Вистар).

При относительно продолжительном пероральном введении препарата селенсодержащего фикоцианина невысокой степени очистки у животных, сенсибилизированных модельным антигеном - куриным овальбумином, усиливался ответ антител класса G, специфичных к этому белку. Показано, что при внутрибрюшинном введении высокоочищенного препарата селенсодержащего фикоцианина имеет место активация лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов перитонеальной полости и повышение фагоцитарной активности клеток перитонеального экссудата.

Практическая значимость

Экспериментально отработанные оптимальные условия выращивания селенсодержащей биомассы лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) с высоким содержанием селена могут быть использованы при масштабировании процесса для промышленного биотехнологического получения нового пищевого источника этого эссенциального микроэлемента.

Высокоочищенный препарат фикоцианина, выделенный из биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas), может быть использован для получения моноклональных антител к этому белковому пигменту и разработки иммуноферментного метода идентификации Spirulina platensis в составе биологически активных добавок к пище и специализированных продуктов питания.

Установленное в опытах in vivo иммуностимулирующее действие водорастворимого экстракта из биомассы Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) при пероральном способе введения свидетельствует о перспективности его использования в составе нового поколения продуктов профилактического питания, повышающих иммунную защиту

неспецифическую резистентность организма. Высокая биодоступность селена в составе селенсодержащего фикоцианина определяет перспективность его использования для профилактики селеновой недостаточности.

Цель работы Получение и характеристика в опытах in vitro и in vivo новых пищевых источников селена: биомассы селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) и препарата селенсодержащего фикоцианина, выделенного из биомассы селенсодержащей Spirulina platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas).

Основные задачи исследования

1 .Вырастить в лабораторных условиях биомассу селенсодержащих лактобацилл (штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3) с высоким содержанием этого микроэлемента.

2. Получить высокоочищенные препараты фикоцианина и селенсодержащего
фикоцианина, используя в качестве исходного сырья биомассу Spirulina
platensis (штамм Nordst. Geitl. Ippas) и биомассу селенсодержащей Spirulina
platensis соответственно.

3. В опытах in vivo провести сравнительную оценку всасывания и
депонирования источников органического селена и селенита натрия в печени и
семенниках крыс.

4.Охарактеризовать в опытах in vivo иммуномодулирующее действие препаратов фикоцианина и селенсодержащего фикоцианина при их внутрибрюшинном введении.

5. Исследовать влияние перорального введения водорастворимого экстракта, выделенного из селенсодержащей биомассы Spirulina platensis на гуморальный иммунный ответ у сенсибилизированных животных.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены на Третьем московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,2005), на XI (Гурзуф, 2003), XII (Гурзуф, 2004) и XIII (Гурзуф, 2005) международных конференциях "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии".

Публикации

По результатам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах и 7 публикаций в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 47 отечественных и 131 зарубежный источник. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, включает 14 таблиц и 19 рисунков.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Селен - эссенциальный микроэлемент в питании человека

Селен (Se), 34-й элемент VI группы, главной подгруппы Периодической

системы Менделеева, является химическим и электронным аналогом серы. Селен - достаточно редкий элемент, его кларк в земной коре составляет 1-5 х 1(Г⁶% [26].

Данный микроэлемент (МЭ) поступает в организм человека и животных главным образом в виде селенсодержащих аминокислот- селеноцистеина и селенометионина растительного происхождения. Растения получают его из почвы и грунтовых вод, поэтому селеновый статус организма человека косвенно определяется по содержанию селена в почвах и грунтовых водах. В России выявлено 3 биогеохимических провинции с повышенным содержанием селена в грунтовых водах - Тувинская, Уральская и Алтайская. Глубокий дефицит селена в почве отмечен в Бурятии, Читинской области, Хабаровском крае [39].

Селен входит в состав организма человека и животных, главным образом, в виде двух химических форм - селеноцистеина и селенометионина. Первый образует активные центры различных селенсодержащих ферментов, второй включается на место метионина в различные белки, образуя нерегулируемый запас селена в организме. Все селенопротеины подразделяются на 3 группы [6]:

1. Неспецифические тканевые селенсодержащие белки. Данные белки характеризуются прочной ковалентной связью селен - углерод, степень насыщенности селеном этих белков зависит от обеспеченности организма серой. Селен представлен в них селенометионином [57].

2. Селенсвязывающие протеины. Эти белки активно связывают селен при поступлении его в организм в неорганической форме. Форма связи в этих белках, равно как и их биологические функции до конца не

15 выяснены, однако они, по - видимому, могут служить депо селена в организме человека. 3. Селенспецифические белки. К ним относятся все известные селенсодержащие ферменты, а также селенопротеин Р и селенопротеин W, не проявляющие ферментативной активности. Селен встраивается в состав полипептидных цепей данных белков в виде остатка селеноцистеина по специфическому котрансляционному механизму. Данный механизм был впервые изучен на примере форматдегидрогеназы Escherichia coli, однако потом оказалось, что он характерен и для селенспецифических протеинов высших эукариот [172]. Включение остатка селеноцистеина в селенспецифические белки кодируется кодоном ТГА, который при синтезе всех других белков означает остановку трансляции. Соответствующий кодон в мРНК должен иметь структуру УГА, а антикодон в тРНК - АЦУ. В ходе биосинтеза обычных белков рибосома, доходя до этого триплета, останавливает синтез полипептидной цепи, диссоциирует на субъединицы и покидает матрицу, однако в данном случае этого не происходит.

Была обнаружена тРНК, несущая антикодон АЦУ, имеющая необычную длину - 95 остатков нуклеотидов (как правило, тРНК содержат 75 - 80 нуклеотидов), а также уникальную структуру D- петли. Данная тРНК ацилируется остатком серина. В момент включения остатка серина в полипептидную цепь (котрансляционно) происходит ферментативное замещение гидроксила серина на SeH при участии селенофосфата. Эта реакция катализируется пиридоксальфосфат-зависимой селеноцистеин-синтетазой (L - серил -tPHK(Sec) селенотрансферазой). Далее синтез белка продолжается по обычному механизму. При достижении рибосомой кодона УГА трансляция не прекращается благодаря некоторым особенностям структуры мРНК селенопротеинов. Для всех селенопротеинов, структура генов которых секвенирована, установлено наличие на примыкающем к 3'

концу нетранслируемом участке их мРНК особой консервативной олигонуклеотидной последовательности, обозначаемой как SECYS (selenocysteine insertion sequence - селеноцистеин - встраивающая последовательность). Она обладает уникальной третичной структурой в виде петли, стабилизированной 4-мя нуклеотидными парами, основания которых взаимодействуют не в соответствии с каноническими правилами Уотсона-Крика. В тот момент, когда рибосома достигает кодона УГА, в мРНК происходит конформационный переход, вследствие которого структура SECYS сближается с центром распознавания триплета и производит его "перекодирование", то есть вместо остановки трансляции происходит котрансляционное встраивание селеноцистеина по вышеописанному механизму. Необходимым условием для этого является также взаимодействие рибосомы со специфическим белком - фактором элонгации Sel-B [106, 140,159, 155, 172].

Уникальные биохимические свойства селена определяются именно селеноцистеином, так как он входит в состав активных центров селенсодержащих ферментов, относящихся к рассматриваемой группе белков [87]. В экспериментальных исследованиях на крысах было показано, что при дефиците селена в диете (менее 0,02 мг/кг диеты) синтез этих белков (глутатионпероксидазы, селенопротеина W) значительно подавлен. По мере возрастания содержания селена в рационе их синтез в организме увеличивается и далее поддерживается на постоянном уровне [124]. В настоящее время исследованы и охарактеризованы 12 селенспецифических белков (см. табл. 1) [39,125]. Отдельно следует отметить семейство ферментов глутатионпероксидаз, посредством которых селен осуществляет свою основную функцию в организме - антиоксидантную. Различные формы глутатионпероксидаз, имея разную локализацию (см. табл. 1), катализируют реакции нейтрализации пероксида водорода или перекисей липидов, при этом в реакции всегда участвует восстановленный глутатион [81, 150]:

17 H₂0₂ + 2GSH = GSSG + 2Н₂0 или ROOH + 2GSH = GSSG + ROH + Н₂0

где R - алкильный радикал (обычно фосфолипид).

Таблица 1

Селенспецифические белки и их локализация

Биологической функцией селенопротеина Р по современным представлениям является защита организма от воздействия перекисей и, следовательно, оксидативного стресса, а также нейтрализация токсического действия тяжелых металлов [51,83, 95,167,164].

Йодтирониндейодиназы типа I и II принимают активное участие в метаболизме тиреоидных гормонов: тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т₃) [55,73,96,171]. Основной функцией тиоредоксинредуктазы является катализ НАДФН - зависимого восстановления тиоредоксина - белка, ответственного за поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке [60]. Кроме этого, данный фермент обладает широкой субстратной специфичностью и участвует в процессах восстановления ряда биологически активных соединений: глутатионпероксидазы, селенита, селендиглутатиона, гидроперекисей и др. [80,90,169].

Количество и распределение селенсодержащих белков в органах и тканях млекопитающих зависит от специфичности их экспрессии, селенового статуса организма и химической формы селена в рационе [39].

Известно, что хорошей бидоступностью обладает селен, содержащийся в пшенице и других продуктах растениеводства. Повышению биодоступности микроэлемента способствуют окисление в селенат или селенит, а также высокие дозы витаминов и других антиоксидантов. Плохой биодоступностью обладает селен, содержащийся в мясе, рыбе, продуктах переработки сой, горохе [1,7, 39].

При дефиците селена уровень селенсодержащих белков снижен, однако включение микроэлемента осуществляется в первую очередь в наиболее важные белки и ткани - репродуктивные и эндокринные органы, мозг [56].

Данные, полученные при исследовании влияния глубокого дефицита селена в сравнении с нормальным уровнем потребления этого микроэлемента на его содержание в органах и тканях крыс, представлены в табл. 2 [53]. Крысы получали полусинтетическую диету на основе дрожжей Torula с низким (5 мкг/кг корма) и нормальным (200 мкг/кг корма) содержанием селена в виде селенита натрия.

Таблица 2 Влияние низкого(І) и нормального (И) поступления селена с кормом на

его содержание в сыворотке крови, органах и тканях крыс

*Содержание селена в семенниках выражено в мкг/г сырой массы органа, для

остальных органов в мкг/г сухой массы. Согласно современным представлениям кроме антиоксидантных свойств биологическая роль селена определяется его иммуномодулирующим действием [117,143], которое затрагивает как гуморальное, так и клеточное звенья иммунной системы. Так, например, дефицит селена в организме снижает продукцию антител, нарушает дифференцировку тимоцитов (снижает число CD8⁺ и CD4*CD8" тимоцитов). В то же время в системах in vitro и in vivo показано, что добавление селена повышает митогенную активность Т-клеток, презентацию антигена Т-клеткам, пролиферацию Т-клеток, фагоцитарную активность макрофагов [117,143].

Помимо вышеописанных свойств селен обладает антиканцерогенным действием, соединение - селенотри-сульфидглутатион запатентовано в качестве противоопухолевого препарата [109]. Селеноглутатион, селенит натрия и селеноцистин также проявляют противоопухолевую активность [54].

В 60-х годах XX века, с установлением антиоксидантных свойств селена, его начали рассматривать как эссенциальный микроэлемент для человека и животных [1,39]. Роль дефицита селена в развитии патологических нарушений у человека была установлена после описания селенодефицитной кардиомиопатии в Китае, а также явлений недостаточности селена при полном парентеральном питании [1,39]. Болезнь Кешана - эндемическая кардиомиопатия, зарегистрированная в Китае и Забайкалье, является крайней степенью дефицита селена. Ее клинические проявления - аритмия, увеличение размеров сердца, некрозы миокарда, сердечная недостаточность, тромбэмболия. Болезнь Кашина - Бека - это эндемическая остеоартропатия, характерная для Забайкалья, Северной Кореи и Китая. Чаще всего болезнь поражает детей 6-13 лет и проявляется в атрофии, дегенерации и некрозе хрящевой ткани суставов.

Селенодефицитные состояния могут быть вызваны также применением некоторых диет. Например, как уже отмечалось, выраженный дефицит селена, сопровождающийся кардиомиопатией, развивается у больных, длительное время находившихся на парентеральном питании [39]. Считается, что специфическая патология, связанная с дефицитом селена, развивается у человека при поступлении селена менее 19 мкг/сут для мужчин и 14 мкг/сут для женщин [165].

Следует отметить, что развитие селенодефицитных состояний происходит при целом ряде заболеваний. К ним относятся: атрофический гастрит, гастродуоденит, нарушения репродуктивной функции, некоторые аллергические состояния, ряд онкологических заболеваний, СПИД и др. [39]. Недостаточность селена наблюдается в старческом возрасте, при беременности, дефицит селена возникает у детей, получающих низкокалорийное и низкобелковое питание [144].

Вместе с тем, к настоящему времени накоплено достаточно данных о том, что селен является одним из самых токсичных элементов, и избыточное

21 потребление его с пищей приводит к развитию острых и хронических селенозов.

При исследовании влияния высокого потребления селена с пищей на здоровье населения в эндемичных провинциях: Южная Дакота (США), некоторые районы Венесуэлы, провинция Енши (Китай) было обнаружено, что уровень потребления селена 10 мкг/кг массы тела приводил к развитию ряда патологических проявлений. У обследуемых развивались нарушения деятельности ЖКТ, кариес, алопеция, потеря ногтей, кожные нарушения [148,166].

В нашей стране адекватный уровень потребления и верхний допустимый уровень потребления селена составляют 70 мкг/сут и 150 мкг/сут, соответственно [25].

В настоящее время в России основным пищевым источником селена является пшеничная мука, содержащая от 80 до 600 мкг селена/кг продукта. При сравнительных исследованиях влияния содержания селена в зерне ржи, сухом молоке и пшенице [34] на уровень селена в сыворотке крови у населения было выявлено, что концентрация селена в пшенице оказывает наибольшее влияние на обеспеченность этим ЭМ населения. При этом высокий показатель содержания селена в пшеничной муке (600 мкг /кг) соответствует продукту, импортируемому из Северной Америки и Австралии, в муке же отечественного производства содержание микроэлемента составляет 80 - 120 мкг/кг [39].

Содержание селена в продуктах питания городов России (с учетом привозных продуктов колеблется в пределах, указанных в табл. 3 [39].

Таблица З

Содержание селена в продуктах питания городов России

Исследования обеспеченности селеном населения России, проведенные в последние годы сотрудниками НИИ питания РАМН, показали, что в ряде регионов население нашей страны обеспечено этим эссенциальным микроэлементом не оптимально. Данные о содержании селена в сыворотке крови обследованного населения позволяют выделить 3 группы регионов РФ по степени обеспеченности селеном:

3. с низким уровнем селена: 60 - 80 мкг/л (Иркутская, Новгородская, Псковская обл.), то есть 7,5 % от общего числа обследованного населения;

4. с умеренным уровнем селена: 81 - 110 мкг/л (Москва, Санкт - Петербург, Нижний Новгород, Тверь, Вологда, Челябинск, Екатеринбург, Уфа и др.), что составляет около 87% от обследованного населения;

5. с высоким уровнем - более 115 мкг/л. Число городов с высокой обеспеченностью селеном невелико: четыре из них находятся на Сахалине, три в различных регионах Европейской части России и один в Западной Сибири (Новосибирск) [39].

23 Таким образом, результаты эпидемиологических исследований обеспеченности населения России селеном показали, что существует насущная необходимость коррекции селенового статуса во многих регионах страны, так как обеспеченность селеном населения очень часто не достигает оптимальных значений. Решение этой задачи возможно как с помощью обогащения селеном продуктов массового потребления в процессе их производства, так и введения данного ЭМ в селенсодержащие БАД и в специализированные продукты. Как уже отмечалось во "Введении" (стр. 9 -10), в повседневной жизни человек в основном потребляет селен в органической форме в составе растительных и животных продуктов, поэтому есть определенные основания отдавать предпочтение органическим формам ЭМ. Кроме того, неорганические соли селена, обладают низким пределом допустимой концентрации (ПДК), что повышает опасность их токсического действия на организм человека при возможных передозировках. По этой причине значительный интерес представляют новые пищевые источники органических форм селена, получаемые методами биотехнологии.

2. 2. Новые пищевые источники селена - объекты

современной биотехнологии

В настоящее время интенсивно развиваются методы биотехнологического получения новых пищевых источников селена. В этом отношении большой интерес представляют так называемые биологические "матрицы", при "встраивании" в которые селена происходит биотрансформация последнего и он переходит из неорганической формы в органическую. Ряд таких объектов представлен в данном обзоре.

2.2.1.Spirulina platensis (Arthrospira platensis)

Одним из объектов массового культивирования во многих странах мира (Мексика, Бразилия, Египет, ФРГ и др.) является микроводоросль

24 спирулина (Spirulina sp.). Спирулина относится к царству цианобактерий и имеет современное систематическое родовое наименование Arthrospira sp. В качестве потенциальных источников нутриентов в питании человека выступают несколько представителей этого рода: Spirulina platensis, S. maxima, S. msiformis и др., которые обладают высоким содержанием белка в биомассе. Спирулина используется в лечебно-профилактическом питании, из данной микроводоросли также получают пищевой белок и биологически активные вещества (каротиноиды, пищевые красители фикоцианин и хлорофилл) [65,110,119,132, 130].

Спирулину обычно культивируют либо в искусственных водоемах, либо в фотобиореакторах закрытого и открытого типов.

Spirulina(Arthrospira) platensis - это микроскопическая нитчатая, фотосинтезирующая спиралевидная сине-зеленая водоросль (цианобактерия), относящаяся к прокариотам. Белок спирулины по своему аминокислотному составу является достаточно полноценным. Согласно исследованиям последних лет, аминокислотный состав спирулины по незаменимым аминокислотам близок «идеальному белку» [64]. В зависимости вида, штамма и условий культивирования спирулины содержание белка в ее клетках колеблется от 50 до 75% от веса сухой биомассы [70].

Микроводоросль содержит в своем составе широкий спектр витаминов: витамины Вь Вг, Вз, Вб, Е, фолиевую кислоту, биотин и пантотеновую кислоту. Исключение составляют витамин С, который в спирулине отсутствует. Имеются данные о том, что витамин Ві2 в спирулине является "псевдоформой", которая не используется в качестве пищевого источника [160,161]. Содержание (З-каротина в сухой биомассе спирулины может достигать 3 мг/г и общее количество каротиноидов в спирулине также высоко [86].

25 Основные пигменты спирулины включают каротиноиды (в том числе

Р- каротин), хлорофилл а (до 1,5% от веса сухой биомассы S.platensis и S.maxima), миксоксантофилл и С-фикоцианин [62].

Фикоцианин основной светопоглощающий пигмент

фотосинтезирующих комплексов цианобактерий и, в частности, спирулины, представляет собой хромопротеин, содержащий ковалентно связанный хромофор фикоцианобилин, определяющий его биологические свойства и спектральные характеристики. Фикоцианин представлен в сине-зеленых водорослях различными формами: С - фикоцианин, R - фикоцианин, аллофикоцианин и др. Максимумы поглощения фикоцианина соответствуют длинам волн 258 нм (белковая часть) и 620 нм (фикоцианобилин), максимумы флуоресценции соответствуют длине волны возбуждения 621 нм и эмиссии 646 нм. Фикоцианин состоит из 2х субъединиц А и В с молекулярными массами 17-21 кД, организованных в нативном белке в гексамерный комплекс [84,99]. Изоэлектрическая точка (pi) фикоцианина соответствует 5.11 [99].

Согласно литературным данным фикоцианин проявляет широкий спектр биологических свойств. Установлено, что антиоксидантная активность белковых фракций, полученных из Spirulina platensis, по отношению к гидроксильным и пероксильным радикалам, связана в основном с содержанием в этих фракциях фикоцианина.(Ріпего et. al., 2001) Имеются также сведения об антиканцерогенном действии фикоцианина, исследования показали, что он способен вызывать апоптоз раковых клеток [152]. Известно, что фикоцианин является ингибитором циклооксигеназы -2, что в сочетании с его антиоксидантными свойствами позволяет ему проявлять противовоспалительную активность [136,138,139]. Сообщается о способности С-фикоцианина снижать уровень фактора некроза опухолей (TNF-a) в сыворотке крови. С-фикоцианин при исследовании на экспериментальной модели воспаления уменьшал отеки, подавлял

26 выделение гистамина из тучных клеток, понижал уровень простагландина PGE₂ и лейкотриена LTB₄ в очаге воспаления [141].

В работах [137,146] сообщается о противовирусной активности фикоцианина и его гепатопротекторном действии. Фикоцианин обладает также способностью к подавлению аллергических реакций что подтверждено исследованиями [121] и [139].

Содержание липидов в спирулине колеблется от 1,5 до 12% от веса сухой биомассы. Установлено, что содержание пальмитиновой кислоты составляет 1,65%, линолевой - 1,09%, у-^{линоленовои} - 0,8-2,0% [72,127]. Углеводы составляют 10-20% в расчете на сухую биомассу спирулины и представлены преимущественно рамнозой (6-дезокси-манноза) и крахмалом [133]. Энергетическая ценность 100 г сухой спирулины составляет около 370 ккал, однако, учитывая, что содержание ее в рационе человека может составлять 3 - 5 г в сутки, то и вклад в общую калорийность может быть около 0,5%.

В спирулине содержатся калий, железо, магний, фосфор, кальций, а также эссенциальные микроэлементы, такие как цинк, марганец и медь. Причем минеральные вещества находятся в спирулине в основном в виде хелатных соединений, что обусловливает хорошую усвояемость их организмом человека. Биомасса спирулины может служить нутритивно значимым пищевым источником железа даже без специального обогащения им в ходе культивирования [89, 103 - 105].

Однако, за исключением железа, количества МЭ недостаточны для полного обеспечения потребностей организма человека.

Биомасса спирулины содержит также рибонуклеиновые (2,2 - 3,5%) и дезоксирибонуклеиновые (0,65 - 1,0%) кислоты.

В отличие от большинства водорослей клеточная оболочка спирулины состоит из комплекса полисахаридов (|3-1,2-глюкана), а не целлюлозы.

27 Благодаря отсутствию целлюлозы в клеточных стенках спирулина относительно легко переваривается [58].

2.2.2.Селенсодержащая Spirulina platensis

Спирулина является одним из наиболее перспективных объектов в качестве «биоматрицы» для встраивания селена, поскольку добавление в среду для культивирования биомассы спирулины неорганических солей селена приводит к его интенсивному включению в состав спирулины. При этом, как уже отмечалось, в результате «биоконверсии» спирулина становится обогащенной органическими формами встраиваемого микроэлемента: селенсодержащими аминокислотами и белками [65].

Функциональные и технологические преимущества спирулины как пищевого источника селена связаны с тем обстоятельством, что биомасса этого микроорганизма может быть получена как культивацией в открытых водоемах, в том числе природного происхождения [58,65], так и выращиванием в фотобиореакторах закрытого типа [2,19,20,70,71,72]. Последняя технология отличается существенно большими финансовыми затратами, однако позволяет получать биомассу при строго постоянных параметрах среды культивации и может осуществляться в любых климатических условиях. Спирулина обладает очень высокой степенью приспособляемости обменных процессов к неблагоприятным факторам среды обитания, что находит выражение в способности этого микроорганизма расти при таких высоких концентрациях "встраиваемых" ЭМ, которые, безусловно, летальны для подавляющего числа других прокариотических и эукариотических организмов, и накапливать ЭМ в составе биомассы в высоких концентрациях [33,119,134].

Установлено, что в ходе обогащения биомассы Spirulina platensis селеном, концентрации селенита натрия менее 400 мг/л стимулируют рост микроводоросли, причем, наиболее выраженным этот эффект является в

28 диапазоне концентраций 5-40 мг/л. Однако, при концентрации селенита натрия выше 500 мг/л отмечается его токсическое действие на рост культуры. Если при низких уровнях четырехвалентного селена в среде культивирования подавляющая часть микроэлемента усваивается спирулиной в виде органических производных, то в области токсических концентраций отмечается защитная реакция, состоящая в переводе значительных количеств селена в не биодоступную, а так называемую, нульвалентную форму (металлический, серый или красный селен) [116]. В ряде других работ оптимальная концентрация селенита натрия в среде представлена существенно меньшей величиной (не более 300 мг/л); показано также, что возможная токсичность четырехвалентного селена для S.platensis зависит от рН среды и от содержания в ней сульфита [34,97].

При получении селенсодержащей спирулины следует учитывать, что в присутствии производных шестивалентного селена (селенатов) данная микроводоросль не растет [34].

В отличие от некоторых высших растений, таких как астрагал [126], в которых в больших концентрациях могут присутствовать неорганические соединения селена (селениты и селенаты), в составе биомассы спирулины «биотрансформированный» селен представлен главным образом его органическими соединениями. Значительные количества селена включаются в состав двух белковых фракций молекулярной массой 20-30 кД и 80 кД [64], а по данным других исследователей [14] - 8-Ю кД и 35-40 кД. При эксклюзионной хроматографии водно-солевого экстракта спирулины один из ее селенсодержащих белков совпадает по объему выхода с фракцией хромопротеинов (фикоцианинов) [15]. Ассимиляция соединений селена спирулиной сопровождается также включением этого ЭМ в состав фракции сульфолипидов [130]. Что касается формы связывания селена в составе белков спирулины, авторы большинства цитированных статей высказывают предположение, что это селенсодержащие аминокислоты - селеноцистеин и

29 селенометионин, встроенные в полипептидные цепи, что требует, однако, дополнительного экспериментального подтверждения.

В литературе описаны различные варианты фракционирования биомассы спирулины, обогащенной различными ЭМ [14, 15, 114]. На первой стадии осуществляют осторожную отмывку клеток водно-солевым изотоническим раствором с получением внеклеточной фракции, представляющей собой ЭМ, сорбированный на внешней поверхности клеток и/или на экскретируемых ими полисахаридах, а также продуктов частичной деструкции клеток. Далее производят экстракцию липофильной составляющей органическим растворителем (чаще всего метанолом). В остатке после экстракции представлена фракция гидрофильных внутриклеточных макромолекул (в первую очередь белков).

С использованием одного из вариантов данного метода показано, что внеклеточная фракция селена в обогащенной им биомассе спирулины составляет в разных образцах от 16 до 26%, внутриклеточная липофильная фракция - от 4 до 25%; внутриклеточная гидрофильная (белковая) является преобладающей (54-75%) [14]. Установлено, что селен внеклеточной фракции сосредоточен в основном в составе пептидов и белков с молекулярной массой не ниже 6 кД, а неорганическая форма данного ЭМ практически отсутствует. Близкие оценки распределения селена были получены с использованием другого варианта фракционирования [33, 34]. Эти результаты качественно согласуются с данными исследований, в которых при фракционировании биомассы были использованы принципиально иные подходы, основанные на многостадийной экстракции солевыми растворами и детергентами, обработке протеазами и ультрафильтрации [70, 79].

Исследования биодоступности селена на модели крыс с дефицитом селена показали, что его биодоступность в составе биомассы

селенсодержащей спирулины меньше по сравнению с селенитом натрия и селенометионином [66]. Однако селен в составе водорастворимой фракции селенсодержащей спирулины, очищенной методом ультрафильтрации через мембрану с размером пор 30 кД, был высокобиодоступен [67].

В исследовании, проведенном на здоровых добровольцах [18] показано, что всасывание неорганического селена происходит значительно быстрее по сравнению с органическими соединениями селена, в том числе в составе спирулины. Всасывание органических форм селена не приводит к резкому увеличению содержания селена в плазме крови и поддерживает его уровень в крови в течение большего времени по сравнению с неорганическим селеном.

В литературе имеются данные об исследовании антианафилактических свойств селенсодержащей спирулины в комплексе с восстановленным глутатионом, проведенном на лабораторных животных [8,23]. Так, в работе [23] оценивали влияние перорального приема БАД содержащей селен-спирулину в комплексе с восстановленным глутатионом на степень сенсибилизации к овальбумину и проявления системной анафилаксии у крыс линии Вистар. Показано, что прием данной БАД достоверно снижал уровень специфических антител к овальбумину, и показатель кишечной проницаемости у сенсибилизированных крыс. В работе [8] изучали гомеостаз селена при экспериментальной системной анафилаксии у крыс. Использование комплексной добавки восстановленного глутатиона с обогащенной селеном спирулиной нормализовало как макромолекулярную проницаемость кишечного барьера, так и распределение селена в элементах крови.

Свидетельства эффективного применения селенсодержащей спирулины в качестве БАД в питании больных со сниженным селеновым статусом, страдающих неспецифическим язвенным колитом, сахарным

31 диабетом 2-го типа, пневмонией и некоторыми онкологическими заболеваниями представлены в ряде работ [27,28,36].

2.2.3.Дрожжи пищевые

Пекарские дрожжи - Saccharomyces cerevisiae, как представители одноклеточных микроорганизмов являются перспективным пищевым сырьем. Биотехнологический процесс выращивания дрожжевой биомассы характеризуется независимостью от климатических условий и времени года, коротким производственным циклом, невысокой стоимостью компонентов питательных сред и высокой скоростью роста биомассы [150]. Для культивирования дрожжей используют среды, обычно содержащие в различных концентрациях глюкозу, дрожжевой экстракт, гидрофосфат калия, и аминокислоты [68,170]. Культивирование проводят в ферментерах в среде стерильного воздуха, подаваемого в аппарат под давлением [59].

Saccharomyces cerevisiae в расчете на сухую массу содержат 35 -55% белка, 25 - 40 % углеводов, до 3% жиров, 7-9% азотистых веществ (из них 18 - 20 % приходятся на небелковый азот). Дрожжи являются хорошим пищевым источником витаминов группы В и витамина Д. Высокое содержание нуклеиновых кислот, пуринов, наличие недостаточно изученных липидов (парафинов и стеринов), D - изомеров некоторых аминокислот может оказать нежелательное воздействие на организм человека и требует определенной технологической обработки дрожжевой биомассы.

Особенностью дрожжевой клетки является наличие плохо перевариваемой клеточной стенки, которая представляет собой жесткую структуру толщиной 25 нм и состоящую в основном из гликанов, маннатов, хитина и белка [3]. Гликаны и маннаты являются полимерами глюкозы и маннозы, а хитин - полимер N - ацетилглюкозоамина. Полисахаридный комплекс с хитином и белком составляет 80 - 90 % от сухой массы клеточной стенки [4]. Известно, что сухая масса клеточной стенки и ее полисахаридный состав может сильно варьировать в зависимости от природы источников

32 углерода в питательной среде, содержания в ней азота, рН, температуры и способа аэрации, а также от способа культивирования дрожжей [48].

В дрожжах имеются различные ЭМ: хром, селен, йод, железо, цинк, медь, марганец, однако их содержание явно недостаточно для удовлетворения физиологических потребностей человека, при использовании дрожжей как таковых в качестве БАД - источников ЭМ, то есть в количествах, не превышающих нескольких граммов. Например, в одном грамме сухих дрожжей Saccharomices cerevisiae, шведская раса НР-1, содержится около 14 мкг железа, 47 мкг цинка, 5 мкг меди и 18 мкг марганца [17].

2.2.4. Селенсодержащие пищевые дрожжи

В настоящее время обогащенные селеном Saccharomyces cerevisiae являются одним из наиболее часто используемых пищевых источников селена [10,52,85,135,153,156]. При определенных условиях дрожжи способны аккумулировать большие количества селена, переводя его из неорганической в органическую форму. Искомый результат достигается путем введения неорганической соли селена или селенистой кислоты в состав среды культивирования в определенной концентрации. При введении селенита натрия в концентрации 30 мкг/мл жидкой питательной среды, селен обнаруживается в сухой биомассе Saccharomyces cerevisiae в концентрации 1200-1400 мкг /г. Согласно данным (Suhajda A, et al. 2000) при большей концентрации селенита натрия в среде происходит стойкое ингибирование прироста биомассы. Самыми важными параметрами, влияющими на процесс инкорпорации селена в дрожжевые клетки, являются рН и концентрация кислорода в среде культивирования [10,129].

В нашей стране производятся обогащенные селеном пищевые дрожжи, содержание селена в которых составляет 450 - 500 мкг/г в виде селенометионина [10, 128].

Показано, что устойчивость Saccharomyces cerevisiae к высоким концентрациям селенита натрия связана с уровнем экспрессии глутатионредуктазы. Это указывает на тот факт, что токсичность селена для дрожжевых клеток тесно связана с состоянием их антиоксидантнои системы [128].

Установлено, что присутствие в среде культивирования метионина значительно понижает усвоение селена дрожжами, а цистеин полностью ингибирует активный транспорт селенита внутрь дрожжевой клетки [85]. В данной работе также сообщается о способности дрожжей, выращенных при высоких концентрациях селена, образовывать его внутриклеточные включения, как способе борьбы с интоксикацией.

Органический селен в Saccharomyces cerevisiae представлен в основном селенометионином. Он был обнаружен как основной компонент при анализе обогащенных селеном дрожжей, хранившихся при комнатной температуре в течение более чем 10 лет, кроме него был получен селенометионин селеноксида гидрат, а также ранее не обнаруженная селенсодержащая аминокислота - S -(метилселено)цистеин [61]. Анализ экстракта обогащенных селеном дрожжей показал, что водорастворимые селенсодержащие компоненты представлены двумя фракциями со значительным разбросом молекулярных масс: низкомолекулярной (Мм < 10000) и высокомолекулярной (10000< Мм <100000) [69].

При исследовании материала, полученного после обработки обогащенных селеном дрожжей трипсином, было обнаружено, что селен представлен в данном объекте селенометионином (74,8%), селеноцистеином (9,9%), селенитом (5,1%) и фракцией, включавшей три неизвестных селенсодержащих компонента (10,2%). Таким образом селен входит в состав селенсодержащих дрожжей в основном в виде селенометионина, неспецифически встроенного в полипептидные цепи [168].

34 2.2.5. Лактобациллы

Бактерии рода Lactobacillus (молочнокислые палочки) давно привлекают к себе внимание исследователей, так как являются важнейшей составной частью нормальной микрофлоры человека, они принимают активное участие в поддержании бактериального баланса и иммунного статуса макроорганизма, благодаря своей антагонистической активности и антигенным свойствам.

Согласно определителю бактерий Берджи данный род входит в группу 19: грамположительные аспорогенные палочки правильной формы. Описано 67 видов, однако классификация их до сих пор далека от совершенства [5,29].

Данный род микроорганизмов относят к так называемым эубиотикам, представителям нормальной микрофлоры кишечника, его пробиотическая активность широко используется для коррекции дисбактериозов различной природы, посредством применения препаратов и продуктов, произведенных на их основе [6,35,45,46,47]. Лактобациллы применяются в пищевой промышленности из-за их выраженной способности к продукции молочной кислоты [45, 50,74,120].

Лактобациллы обладают сахарокластическим метаболизмом бродильного типа. По меньшей мере, половина углерода конечных продуктов брожения лактобацилл приходится на лактат; они не разжижают желатину, каталазоотрицательные, не содержат цитохромов и не восстанавливают нитрат [29]. Бактерии этого рода обладают нитритредуктазной активностью [78]. Наиболее распространенным типом пептидогликана у лактобацилл является тип лизин - D - аспарагиновая кислота [76]. Лактобациллы находятся на границе аэробного и анаэробного типов дыхания и являются факультативными анаэробами, они слабо растут на воздухе, лучше - при пониженном содержании кислорода. Их рост обычно стимулируется добавлением 5% С0₂ [29].

Важным и наиболее известным биологическим свойством лактобацилл является выраженная способность к продукции молочной кислоты [49,145]. Показано, что активное кислотообразование лактобацилл зависит от состава питательной среды, условий культивирования и является одним из важнейших факторов антагонизма бактерий данного рода [45,77,131].

Лактобациллы способны продуцировать пероксид водорода, что обеспечивает их антимикробную и противовирусную активность [101]. Лактобациллы обладают протеолитической активностью, это свойство находит широкое применение в пищевой промышленности [30,37,38]. Ранее считалось, что лактобациллы не требуют присутствия в среде культивирования железа [163], однако, согласно данным (М. ЕШ et al., 2000) эти бактерии способны к его усвоению и, возможно, железо участвует в метаболизме пуринов и пиримидинов [79]. У Lactobacillus plantarum обнаружен ряд железосодержащих ферментов (железозависимая пероксидаза, гемсинтетаза) и железо-транспортных систем [108]. В метаболизме лактобацилл важную роль играют металлозависимые ферменты, кофакторами которых являются ионы кобальта, марганца, меди, цинка и кадмия [91,92,108,112,149].

Биохимические свойства бактерий рода Lactobacillus достаточно подробно исследованы, при этом большое количество работ посвящено изучению метаболических путей и ферментных систем бактерий данного рода [82,88,94,98,112,147].

Клеточная стенка лактобацилл имеет структуру типичную для грамположительных бактерий и состоит из толстого, многослойного пептидогликанового "конверта" со встроенными протеинами, тейхоевыми или липотеихоевыми кислотами и полисахаридами, окруженного у некоторых видов слоем протеинов, под клеточной стенкой расположена цитоплазматическая мембрана. Липотейхоевые кислоты являются основным компонентом, обеспечивающим гидрофобность клеточной оболочки.

36 Пептидогликаны и тейхоевые кислоты обладают свойствами иммуномодуляторов [76].

Толщина клеточной стенки у лактобацилл составляет около 50 нм. [76]. Различные жирные кислоты, входящие в состав биологических мембран, играют важную роль в поддержании гомеостаза микробной клетки, среди них - миристиновая, пальмитиновая, стеариновая и др. [142].

Лактобациллы способны расти в присутствии разнообразных Сахаров, которые используются ими в качестве субстратов клеточного метаболизма для генерации энергии и роста. Конечными продуктами метаболизма Сахаров кроме D- или L- лактата и ацетата могут быть формиат, этанол и 2,3 -бутандиол [6].

Лактобациллы обладают активными протеолитическими ферментными системами, что позволяет им расти на богатых протеинами субстратах, включая молоко. Несмотря на то, что данные микроорганизмы усваивают протеины и продукты их гидролиза извне, они могут синтезировать все аминокислоты, кроме валина, лейцина и изолейцина [107,108].

Лактобациллы, как уже отмечалось, являются факультативными анаэробами или микроаэрофилами, которые лучше растут при пониженном содержании кислорода или в атмосфере, содержащей 5-10% СОг- По отношению к температуре они являются либо мезофилами, либо термофилами, для которых оптимальная температура роста состаляет 15-38 С и 20 - 55 С, соответственно.

На обычных средах лактобациллы не растут, их выращивают на средах с гидролизованным молоком, используя, например, панкреатический гидролизат казеина. При их росте на жидких средах наблюдается помутнение среды и осаждение клеток вскоре после прекращения роста. Осадок однородный, гомогенный, редко зернистый или слизистый. Поверхностная пленка никогда не образуется. На плотных питательных средах (агар с гидролизованным молоком, МРС - агар, лактоагар) лактобациллы

37 формируют округлые, мелкие, размером 2-5 мм, гладкие блестящие колонии серого цвета со сферической поверхностью. Колонии лактобацилл разных видов почти не различаются [38]. Для лактобацилл незаменимыми факторами роста являются аминокислоты, нуклеотиды и витамины. На их рост оказывает положительное влияние добавление к питательным средам различных растительных экстрактов, дрожжевого автолизата и других биосубстратов, содержащих витамины [35,147,164].

Для лактобацилл наиболее широко применяемым и эффективным источником витаминов, эссенциальных аминокислот и нуклеиновых кислот является дрожжевой автолизат, кроме того, необходимо наличие в среде энергетических субстратов, из которых чаще всего используются глюкоза и лактоза [107].

Микроэлементы являются также, необходимыми компонентами среды для роста лактобацилл. В основном, как отмечалось, выше они играют роль кофакторов различных ферментов, поэтому среды для культивирования должны обязательно содержать ионы Mg, Мп, Сг и др. [35]. В производственных условиях культивирование данных микроорганизмов проводят в промышленных ферментерах, где аэрация осуществляется путем подачи стерильного воздуха или азота, а ее равномерность достигается перемешиванием. Для L. plantarum возможен рост в атмосфере 100% СОг при 20-25 С и рН - 6,0 [6].

Для лактобацилл считается оптимальной рН среды, равная 5,5 - 7,0. Этот параметр поддерживается на постоянном уровне нейтрализацией образующегося при культивировании лактата и других кислот растворами щелочей или водного аммиака [74, 75, 145].

Последним этапом технологического процесса является лиофильное или распылительное высушивание полученной биомассы. При необходимости максимального сохранения жизнеспособных клеток в высушенном препарате к клеточной взвеси добавляют защитные среды, наиболее часто содержащие

38 сахарозу и желатин, а также органические спирты (сорбитол и др.), другие сахара, например фруктозу. Эти добавки позволяют сохранить жизнеспособность сухой культуры и продлить срок хранения полученного препарата [35].

2.2.6. Селенсодержащие лактобациллы

Применение лактобацилл в качестве биологических матриц для биотехнологического встраивания микроэлементов, и, в частности, селена началось сравнительно недавно. В доступной нам литературе удалось обнаружить два сообщения о биотехнологическом обогащении бактерий рода Lactobacillus эссенциальными микроэлементами [63,158]. Чтобы достичь сочетания высокой скорости наращивания биомассы с параллельно протекающим процессом ее интенсивного обогащения селеном, в первую очередь требуется оптимизировать состав питательной среды, концентрацию в ней селена, рН среды и атмосферу культивирования. В исследовании [153] дано описание способа выращивания обогащенной селеном Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Обогащение достигается путем добавления в жидкую или полужидкую питательную среду на основе подсырной сыворотки для выращивания данной культуры селенита натрия в интервале концентраций с верхней границей 3 мкг/мл. Содержание селена в лактобациллах, выращенных в таких условиях, варьирует от 100 до 1000 мкг/г сухой биомассы.

В работе [63] в качестве объектов для обогащения селеном были взяты Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus casei ssp. casei и Lactobacillus plantarum. Культивирование лактобацилл также проводили в жидкой или полужидкой среде на основе подсырной сыворотки, селен вносили в среду в интервале концентраций 0,01 - 20 мкг/мл. При концентрации селена в среде 1 мкг/мл содержание его в сухой биомассе лактобацилл составило 400 мкг/г.

39 Большая часть внутриклеточного селена была связана с белками Мм более 3,5 кД. Около 40% селена, связанного с белками и находящегося, по -видимому, в форме селеносульфидов, могло быть удалено при диализе после денатурации, вызванной такими восстанавливающими соединениями как дитиотрейтол, гуанидинхлорид и 2 - меркаптоэтанол. Оставшиеся 60% селена в составе внутриклеточных белков были представлены только селеноцистеином.

Остается открытым и требует дальнейшего изучения вопрос, в состав каких именно белковых фракций и конкретных белков селен встраивается в процессе биотехнологического обогащения.

Известно, что лактобациллы обладают механизмами предотвращения оксидативного стресса, с участием ферментов: каталазы, тиолпероксидазы, глутатионпероксидазы и др. [108]. Кофактором глутатионпероксидазы является селен, в связи с чем обогащение лактобацилл селеном представляет интерес.

Глутатионпероксидаза L. plantarum представляет собой белок, состоящий из 161 аминокислотного остатка с Мм около 18 кД, в состав которого селен входит в виде селеноцистеина [108]. У L. plantarum обнаружена и селеноцистеинсинтетаза, она представляет собой белок с Мм около 40 кД, его полипептидная цепь содержит 366 аминокислотных остатка[108]. Представляет интерес тот факт, что данный фермент, обнаруженный у L. plantarum, не встречается больше ни у одного из близкородственных грамположительных микроорганизмов, хотя инкорпорация селеноцистеина широко распространена среди грамположительных бактерий [108].

Таким образом, анализ представленных в данном обзоре научных
публикаций свидетельствует об использовании в качестве объектов для
биотехнологического встраивания селена пищевых дрожжей, спирулины и
лактобактерий. Дрожжи обладают относительно высокой

сенсибилизирующей активностью, поэтому для сравнительной оценки

40 возможного применения в качестве источника пищевого селена нами выбраны биомасса одного из типичных представителей рода Lactobacillus -хорошо изученного вида L. plantarum и биомасса Spirulina platensis.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1. Материалы и методы исследований

3.1.1. Объекты исследования

3.1.1.1. Штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3

Штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3 был получен из Государственной коллекции нормальной микрофлоры при Федеральном центре по бифидобактериям ГУ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ. Культура первоначально была изолирована из фекалий здоровых людей и в настоящее время используется в нашей стране как производственный штамм при изготовлении препарата "Лактобактерин".

Для культивирования данного штамма использовали жидкую питательную среда следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат казеина (ГНЦПМ, Россия) -30,0; экстракт пекарских дрожжей (ДиаэМ, Россия) - 5,0; глюкоза - 7,5; D-лактоза - 2,5; L-цистеин - 0,5; натрия хлорид - 2,5; магния сульфат - 0,5; кислота аскорбиновая - 0,5; натрия ацетат - 0,3; рН среды = 6,7 - 7,3. Посевной материал культивировали на полужидкой среде, в которую кроме вышеназванных компонентов добавляли микробиологический агар в количестве 0,75 г на 1 литр. Пробы инкубировали в течение 12 ч в термостате при температуре 37 С. Контроль микробиологической чистоты осуществляли при помощи посева штрихом на плотную селективную среду для лактобацилл (ГНЦПМ, Россия) и микроскопии мазков, окрашенных по Граму.

3.1.1.2. Селенсодержащий штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3

Для получения данного штамма готовили посевной материал по следующей схеме: образец культуры (сухая биомасса) Lactobacillus plantarum 8RA-3 массой 50 мг разводили в 1 мл полужидкой питательной среды для посевного материала, далее по 500 мкл разведенной культуры засевали на 9,5

42 мл среды для посевного материала. Пробы инкубировали в термостате при

температуре 37 С в течение 12 ч, затем полученную культуру в том же объеме

вновь засевали на среду для посевного материала и инкубировали при тех же

условиях. Полученная культура являлась посевным материалом.

С целью обогащения биомассы лактобацилл селеном в жидкую питательную среду непосредственно перед началом культивирования вносили различные объемы раствора селенита натрия, квалификации хч с концентрацией 1мг/мл для получения в жидкой культуре его различных концентраций до 20 мкг/мл. Далее в среду добавляли подготовленный посевной материал в количестве 5% от конечного объема культуры. В контрольных образцах микроорганизмы выращивали без добавления селенита натрия.

Биомассу отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин., далее ее промывали физиологическим раствором (0,9 % NaCl) и повторно центрифугировали при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в минимальном количестве дистиллированной воды и лиофильно высушивали, полученную биомассу взвешивали.

3.1.1.3. Spirulina platensis (Arthrospira platensis) Сухая биомасса спирулины, полученная биотехнологическим методом культивирования штамма Spirulina platensis (штамм. Nordst. Geitl. Ippas.(per. № В - 437) в регулируемых условиях теплиц открытого типа была предоставлена ООО "Агро-Виктория" (г. Сочи)

3.1.1.4.Селенсодержащая Spirulina platensis (Arthrospira platensis)

Сухая биомасса селенсодержащей спирулины, полученная методом культивирования вышеназванного штамма в регулируемых условиях теплиц открытого типа, в присутствии в ростовой среде селенита натрия, была также предоставлена ООО "Агро-Виктория" (г. Сочи).

43 3.1.1.5. Фикоцианин

Для получения высокоочищенных препаратов фикоцианина были использованы образцы сухой биомассы спирулины.

Для выделения фикоцианина из спирулины нами был модифицирован метод, впервые примененный для выделения этого пигмента из цианобактерии Schizotrix sp.[157].

На первом этапе выделения для предотвращения разрушения хромофора фикоцианина под действием следовых количеств ионов тяжелых металлов во все растворы в ходе выделения этого белка добавляли 0,1 мМ двунатриевой соли ЭДТА. Все манипуляции по выделению фикоцианина проводили при экранированном дневном свете, а лиофильную сушку образцов - в темноте.

Навеску биомассы спирулины заливали водой в количестве 19:1 по массе и подвергали интенсивному перемешиванию на магнитной мешалке 24 часа в холодильнике. Экстракт осветляли центрифугированием при 10000 g и диализовали 16 ч против воды через целлофановую мембрану.

Затем следовали стадии сульфатноаммонийного осаждения. К экстракту на холоду (+2-4С) добавляли 1/4 по объему насыщенного при 0С водного раствора сульфата аммония. Смесь выдерживали 1 ч, после чего центрифугировали 1 ч при 10000 g. Осадок (желто-зеленого цвета) отбрасывали, а к раствору добавляли на холоду насыщенный раствор сульфата аммония в объеме, составлявшем вместе с ранее добавленным количеством 120% от исходного объема экстракта. Инкубацию и центрифугирование смеси повторяли. Супернатант (желтого цвета) отбрасывали, а осадок (интенсивно синего цвета) растворяли в воде, добавляли на холоду 120% по объему насыщенного раствора сульфата аммония и повторяли осаждение. Супернатант после центрифугирования (бесцветный) отбрасывали, а осадок растворяли в минимальном количестве воды и диализовали сначала 24 ч против воды, а

44 затем - 24 ч против 0,05 М Na-ацетатного буфера рН 5,2 с 0,05 М NaCl и 0,001%

азидом натрия.

Дополнительную очистку пигмента осуществляли методом колоночной хроматографии. Отдиализованный раствор белков в объеме 100 мл наносили на колонку 2,5x40 см с ДЭАЭ-сефацелем, уравновешенную вышеуказанным буфером. Элюцию проводили сначала изократически, объемом 300-400 мл буфера до выхода показателя оптической плотности элюента, регистрируемого проточным УФ-детектором ("РЭППС-1", Россия) на базовую линию. Далее проводили элюцию линейным градиентом 0,05-0,4 М NaCl в 0,05 М Na-ацетатном буфере рН 5,2, общим объемом 400 мл. После начала появления в элюате синего окрашивания фракции собирали на коллектор фракций " FRAC-100" ("Pharmacia", Швеция) и определяли отношение оптических плотностей D₆₂o/D₂58- Фракции, для которых это отношение превышало 4,5, объединяли, измеряли объем, добавляли на холоду 150% по объему насыщенного раствора сульфата аммония и оставляли на 16 ч в холодильнике. Белок далее осаждали центрифугированием, осадок растворяли в минимальном объеме воды, обессоливали диализом против воды и лиофильно высушивали. Навеску 30 мг лиофилизованного белка растворяли в 0,5 мл 0,05 М К-фосфатного буфера рН 6,8 с 0,3 М NaCl и наносили через петлю объемом 0,5 мл на колонку с "Суперозой-12" (1,5x40 см), уравновешенную тем же буфером. Элюирование вели изократически, фракции собирали на коллектор и объединяли те из них, для которых отношение D₆2o/D258 превышало 5,5. Объединенные фракции обессоливали диализом против воды и лиофильно высушивали.

ЗЛЛ.б.Селенсодержащий фикоцианин

Для получения высокоочищенных препаратов селенфикоцианина были использованы образцы сухой биомассы селенсодержащей спирулины. Выделение и очистку проводили по схеме аналогичной описанной в разделе 3.1.1.5.

45 3.1.1.7. Лабораторные животные

В работе использовались мыши самки линии DBA с исходной массой тела 20±2 г, полученные из питомника РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Мыши получали стандартный гранулированный мышиный комбикорм ПК-120 и питьевую воду без ограничений.

При проведении исследований были использованы также крысы самцы линии Wistar, полученные из питомника «Столбовая», с исходной массой тела 180±20 г. Крысы получали сбалансированный стандартный рацион вивария (СРВ), состав которого представлен в табл. 4, и воду без ограничений.

Таблица 4 Стандартный рацион вивария (СРВ)

Всего в работе было использовано 88 крыс и 55 мышей.

46 3.1.2. Методы исследований

3.1.2.1. Биохимические и иммунологические методы

3.1.2.1.1. Метод оценки биодоступности селена в составе

исследуемых препаратов

В опыте по оценке биодоступности были исследованы следующие источники селена:

1) Селенит натрия безводный, квалификации ч.д.а.

2) Сухая биомасса селенсодержащей спирулины (Arthrospira platensis,
штамм. Nordst. Geitl. Ippas., per. № В - 437), полученная биотехнологическим
методом культивирования в среде с высоким содержанием селенита натрия в
регулируемых условиях теплиц открытого типа, предоставлена ООО "Агро-
Виктория" (г. Сочи). Содержание селена в исследуемом образце составило 539
± 15 мкг/г.

3. Белковый препарат с повышенной концентрацией селена, полученный водной экстракцией из биомассы селенсодержащей спирулины, и дополнительно очищенный двухкратным сульфатноамонийным осаждением (см. раздел 3.1.1.5.). В эксперименте на животных использован водный раствор препарата, в котором содержание селенсодержащего фикоцианина составило 5,3 мг/мл, а концентрация селена 3,6 мкг/мл.

4. Сухая биомасса лактобацилл с содержанием селена 1493 ± 7 мкг/г была получена путем культивирования штамма Lactobacillus plantarum 8RA-3

в среде с концентрацией селенита натрия 5 мкг/мл (см. раздел 3.1.1.2.).

В эксперименте животные получали либо СРВ (контрольные группы), либо вышеперечисленные источники селена в виде добавок к СРВ в течение 14 или 21 дня. По окончании периода кормления крыс взвешивали, для определения селена забивали декапитацией под эфирной анестезией, брали кровь для получения сыворотки, печень и семенники. Печень взвешивали, отмывали в физиологическом растворе (0,9 % хлорид натрия),

47 гомогенизировали при помощи блендера. Навески гомогената (200 мг)

помещали в 2 мл смеси 8 : 15 хлорной (концентрированной) и азотной (63%)

кислот и подвергали минерализации (см. раздел 3.1.2.2.1.). Семенники

взвешивали и навески органов по 0,5 - 0,6 г также подвергали минерализации.

Сыворотку крови отделяли центрифугированием при 200 g и аликвоты по 0,25

мл подвергали минерализации. Все образцы исследовали в 2-х повторах. Селен

в минерализованных образцах определяли по методу, описанному ниже в

Селен - эссенциальный микроэлементе питании человека

Селен (Se), 34-й элемент VI группы, главной подгруппы Периодической системы Менделеева, является химическим и электронным аналогом серы. Селен - достаточно редкий элемент, его кларк в земной коре составляет 1-5 х 1(Г6% [26].

Данный микроэлемент (МЭ) поступает в организм человека и животных главным образом в виде селенсодержащих аминокислот- селеноцистеина и селенометионина растительного происхождения. Растения получают его из почвы и грунтовых вод, поэтому селеновый статус организма человека косвенно определяется по содержанию селена в почвах и грунтовых водах. В России выявлено 3 биогеохимических провинции с повышенным содержанием селена в грунтовых водах - Тувинская, Уральская и Алтайская. Глубокий дефицит селена в почве отмечен в Бурятии, Читинской области, Хабаровском крае [39].

Селен входит в состав организма человека и животных, главным образом, в виде двух химических форм - селеноцистеина и селенометионина. Первый образует активные центры различных селенсодержащих ферментов, второй включается на место метионина в различные белки, образуя нерегулируемый запас селена в организме. Все селенопротеины подразделяются на 3 группы [6]: 1. Неспецифические тканевые селенсодержащие белки. Данные белки характеризуются прочной ковалентной связью селен - углерод, степень насыщенности селеном этих белков зависит от обеспеченности организма серой. Селен представлен в них селенометионином [57]. 2. Селенсвязывающие протеины. Эти белки активно связывают селен при поступлении его в организм в неорганической форме. Форма связи в этих белках, равно как и их биологические функции до конца не выяснены, однако они, по - видимому, могут служить депо селена в организме человека. 3. Селенспецифические белки. К ним относятся все известные селенсодержащие ферменты, а также селенопротеин Р и селенопротеин W, не проявляющие ферментативной активности. Селен встраивается в состав полипептидных цепей данных белков в виде остатка селеноцистеина по специфическому котрансляционному механизму. Данный механизм был впервые изучен на примере форматдегидрогеназы Escherichia coli, однако потом оказалось, что он характерен и для селенспецифических протеинов высших эукариот [172]. Включение остатка селеноцистеина в селенспецифические белки кодируется кодоном ТГА, который при синтезе всех других белков означает остановку трансляции. Соответствующий кодон в мРНК должен иметь структуру УГА, а антикодон в тРНК - АЦУ. В ходе биосинтеза обычных белков рибосома, доходя до этого триплета, останавливает синтез полипептидной цепи, диссоциирует на субъединицы и покидает матрицу, однако в данном случае этого не происходит.

Была обнаружена тРНК, несущая антикодон АЦУ, имеющая необычную длину - 95 остатков нуклеотидов (как правило, тРНК содержат 75 - 80 нуклеотидов), а также уникальную структуру D- петли. Данная тРНК ацилируется остатком серина. В момент включения остатка серина в полипептидную цепь (котрансляционно) происходит ферментативное замещение гидроксила серина на SeH при участии селенофосфата. Эта реакция катализируется пиридоксальфосфат-зависимой селеноцистеин-синтетазой (L - серил PHK(Sec) селенотрансферазой). Далее синтез белка продолжается по обычному механизму. При достижении рибосомой кодона УГА трансляция не прекращается благодаря некоторым особенностям структуры мРНК селенопротеинов. Для всех селенопротеинов, структура генов которых секвенирована, установлено наличие на примыкающем к 3 16

концу нетранслируемом участке их мРНК особой консервативной олигонуклеотидной последовательности, обозначаемой как SECYS (selenocysteine insertion sequence - селеноцистеин - встраивающая последовательность). Она обладает уникальной третичной структурой в виде петли, стабилизированной 4-мя нуклеотидными парами, основания которых взаимодействуют не в соответствии с каноническими правилами Уотсона-Крика. В тот момент, когда рибосома достигает кодона УГА, в мРНК происходит конформационный переход, вследствие которого структура SECYS сближается с центром распознавания триплета и производит его "перекодирование", то есть вместо остановки трансляции происходит котрансляционное встраивание селеноцистеина по вышеописанному механизму. Необходимым условием для этого является также взаимодействие рибосомы со специфическим белком - фактором элонгации Sel-B [106, 140,159, 155, 172].

Уникальные биохимические свойства селена определяются именно селеноцистеином, так как он входит в состав активных центров селенсодержащих ферментов, относящихся к рассматриваемой группе белков [87]. В экспериментальных исследованиях на крысах было показано, что при дефиците селена в диете (менее 0,02 мг/кг диеты) синтез этих белков (глутатионпероксидазы, селенопротеина W) значительно подавлен. По мере возрастания содержания селена в рационе их синтез в организме увеличивается и далее поддерживается на постоянном уровне [124]. В настоящее время исследованы и охарактеризованы 12 селенспецифических белков (см. табл. 1) [39,125]. Отдельно следует отметить семейство ферментов глутатионпероксидаз, посредством которых селен осуществляет свою основную функцию в организме - антиоксидантную. Различные формы глутатионпероксидаз, имея разную локализацию (см. табл. 1), катализируют реакции нейтрализации пероксида водорода или перекисей липидов, при этом в реакции всегда участвует восстановленный глутатион [81, 150]:

Селенсодержащие пищевые дрожжи

Бактерии рода Lactobacillus (молочнокислые палочки) давно привлекают к себе внимание исследователей, так как являются важнейшей составной частью нормальной микрофлоры человека, они принимают активное участие в поддержании бактериального баланса и иммунного статуса макроорганизма, благодаря своей антагонистической активности и антигенным свойствам.

Согласно определителю бактерий Берджи данный род входит в группу 19: грамположительные аспорогенные палочки правильной формы. Описано 67 видов, однако классификация их до сих пор далека от совершенства [5,29].

Данный род микроорганизмов относят к так называемым эубиотикам, представителям нормальной микрофлоры кишечника, его пробиотическая активность широко используется для коррекции дисбактериозов различной природы, посредством применения препаратов и продуктов, произведенных на их основе [6,35,45,46,47]. Лактобациллы применяются в пищевой промышленности из-за их выраженной способности к продукции молочной кислоты [45, 50,74,120]. Лактобациллы обладают сахарокластическим метаболизмом бродильного типа. По меньшей мере, половина углерода конечных продуктов брожения лактобацилл приходится на лактат; они не разжижают желатину, каталазоотрицательные, не содержат цитохромов и не восстанавливают нитрат [29]. Бактерии этого рода обладают нитритредуктазной активностью [78]. Наиболее распространенным типом пептидогликана у лактобацилл является тип лизин - D - аспарагиновая кислота [76]. Лактобациллы находятся на границе аэробного и анаэробного типов дыхания и являются факультативными анаэробами, они слабо растут на воздухе, лучше - при пониженном содержании кислорода. Их рост обычно стимулируется добавлением 5% С02 [29]. Важным и наиболее известным биологическим свойством лактобацилл является выраженная способность к продукции молочной кислоты [49,145]. Показано, что активное кислотообразование лактобацилл зависит от состава питательной среды, условий культивирования и является одним из важнейших факторов антагонизма бактерий данного рода [45,77,131]. Лактобациллы способны продуцировать пероксид водорода, что обеспечивает их антимикробную и противовирусную активность [101]. Лактобациллы обладают протеолитической активностью, это свойство находит широкое применение в пищевой промышленности [30,37,38]. Ранее считалось, что лактобациллы не требуют присутствия в среде культивирования железа [163], однако, согласно данным (М. ЕШ et al., 2000) эти бактерии способны к его усвоению и, возможно, железо участвует в метаболизме пуринов и пиримидинов [79]. У Lactobacillus plantarum обнаружен ряд железосодержащих ферментов (железозависимая пероксидаза, гемсинтетаза) и железо-транспортных систем [108]. В метаболизме лактобацилл важную роль играют металлозависимые ферменты, кофакторами которых являются ионы кобальта, марганца, меди, цинка и кадмия [91,92,108,112,149]. Биохимические свойства бактерий рода Lactobacillus достаточно подробно исследованы, при этом большое количество работ посвящено изучению метаболических путей и ферментных систем бактерий данного рода [82,88,94,98,112,147]. Клеточная стенка лактобацилл имеет структуру типичную для грамположительных бактерий и состоит из толстого, многослойного пептидогликанового "конверта" со встроенными протеинами, тейхоевыми или липотеихоевыми кислотами и полисахаридами, окруженного у некоторых видов слоем протеинов, под клеточной стенкой расположена цитоплазматическая мембрана. Липотейхоевые кислоты являются основным компонентом, обеспечивающим гидрофобность клеточной оболочки. Пептидогликаны и тейхоевые кислоты обладают свойствами иммуномодуляторов [76]. Толщина клеточной стенки у лактобацилл составляет около 50 нм. [76]. Различные жирные кислоты, входящие в состав биологических мембран, играют важную роль в поддержании гомеостаза микробной клетки, среди них - миристиновая, пальмитиновая, стеариновая и др. [142]. Лактобациллы способны расти в присутствии разнообразных Сахаров, которые используются ими в качестве субстратов клеточного метаболизма для генерации энергии и роста. Конечными продуктами метаболизма Сахаров кроме D- или L- лактата и ацетата могут быть формиат, этанол и 2,3 -бутандиол [6]. Лактобациллы обладают активными протеолитическими ферментными системами, что позволяет им расти на богатых протеинами субстратах, включая молоко. Несмотря на то, что данные микроорганизмы усваивают протеины и продукты их гидролиза извне, они могут синтезировать все аминокислоты, кроме валина, лейцина и изолейцина [107,108]. Лактобациллы, как уже отмечалось, являются факультативными анаэробами или микроаэрофилами, которые лучше растут при пониженном содержании кислорода или в атмосфере, содержащей 5-10% СОг- По отношению к температуре они являются либо мезофилами, либо термофилами, для которых оптимальная температура роста состаляет 15-38 С и 20 - 55 С, соответственно.

На обычных средах лактобациллы не растут, их выращивают на средах с гидролизованным молоком, используя, например, панкреатический гидролизат казеина. При их росте на жидких средах наблюдается помутнение среды и осаждение клеток вскоре после прекращения роста. Осадок однородный, гомогенный, редко зернистый или слизистый. Поверхностная пленка никогда не образуется. На плотных питательных средах (агар с гидролизованным молоком, МРС - агар, лактоагар) лактобациллы формируют округлые, мелкие, размером 2-5 мм, гладкие блестящие колонии серого цвета со сферической поверхностью. Колонии лактобацилл разных видов почти не различаются [38]. Для лактобацилл незаменимыми факторами роста являются аминокислоты, нуклеотиды и витамины. На их рост оказывает положительное влияние добавление к питательным средам различных растительных экстрактов, дрожжевого автолизата и других биосубстратов, содержащих витамины [35,147,164].

Метод оценки вторичного иммунного ответа к куриному овальбумину у крыс

Оптимальные для иммунизации мышей линии DBA дозы эритроцитов барана (ЭБ) определяли следующим образом.

Мышей разбили на 4 группы равной численности (3 опытных и 1 контрольная). Далее животным опытных групп интраперитонеально вводились различные дозы ЭБ (2 х Ю8; 2 х 107; 1 х 108), разведенные в 500 мкл раствора PBS. Животным контрольной группы вводился только раствор PBS. На 5 -й день опыта мышей забивали цервикальной транслокацией и извлекали селезенку. Селезенку промывали в PBS и гомогенизировали при помощи стеклянного гомогенизатора в среде RPMI - 1640, полученную суспензию клеток фильтровали через хлопковую вату и центрифугировали 15 мин при 200 g и 4С. Супернатант удаляли, осадок клеток тщательно встряхивали и подвергали гипотоническому шоку для удаления эритроцитов и мертвых клеток. Для этого к осадку клеток добавляли 9 мл дистиллированной воды на 10 секунд, затем добавляли 1 мл десятикратного концентрата раствора Хенкса. Объем суспензии доводили средой RPMI-1640 до 15 мл и фильтровали через воронку с хлопковой ватой. Клетки дважды отмывали центрифугированием в среде RPMI-1640 при условиях, указанных выше. Число клеток в 1 мл полученной суспензии подсчитывали в камере Горяева.

Определение количества антителообразующих клеток (АОК) селезенки (реакция Ерне) [100] проводили следующим образом. ЭБ разводили в PBS до концентрации 5%. Навеску агарозы ("Sigma" тип А) равную 500 мг разводили в 100 мл раствора Хенкса с фенолом и инкубировали на водяной бане при 100 С до полного растворения. Далее полученный раствор агарозы разливали по 1 мл в чашки Петри диаметром 3,5 см. В пробирки, помещенные предварительно на водяную баню при температуре 46 ± 0,1 С, разливали по 250 мкл раствора агарозы, 50 мкл суспензии клеток селезенки, 250 мкл суспензии ЭБ и быстро выливали на чашки с агарозой. Чашки помещали в термостат и инкубировали при 37 С в течение 1 ч, затем добавляли по 0,55 мл 10% раствора сухого комплемента морской свинки в PBS и инкубировали 1 ч при 37 С, раствор комплемента сливали, и подсчитывали количество зон лизиса в каждой чашке. Число АОК в 1 млн. клеток селезенки рассчитывали по следующей формуле (1) Х=1 х Ю6хА/ВхО,05 (1) Где X - число АОК в 1 млн. клеток селезенки; А - количество зон лизиса в чашке; В - количество клеток в 1 мл суспензии клеток селезенки, определенное при подсчете в камере Горяева. В результате этого определения была выбрана оптимальная доза ЭБ для о иммунизации мышей (1 х Ю на животное), позволяющая обнаруживать как возможное иммуностимулирующее так и иммуносупрессорное действие исследуемых препаратов (фикоцианина и селенфикоцианина). Далее мышам, предварительно иммунизированным эритроцитами барана в выбранной дозе, вводились внутрибрюшинно растворы высокоочищенных препаратов фикоцианина или селенфикоцианина (см. разделы 3.1.1.5. и в дозах от 0,1 до 5 мкг на г массы мыши. На 5 день иммунизации животных забивали и проводили реакцию Ерне по вышеприведенной схеме Метод оценки вторичного иммунного ответа к куриному овальбумину у крыс В работе применена схема сенсибилизации, используемая при моделировании системной анафилаксии у крыс [151,162]. В начале эксперимента крысы были разделены случайным образом на 2 группы равной численности. Крысы 1-ой (опытной) группы численностью 24 животных получали СРВ с добавкой препарата, обогащенного органической формой селена фикоцианина из спирулины. Белковый препарат селенсодержащего фикоцианина, полученный водной экстракцией из биомассы селенсодержащей спирулины и дополнительно очищенный двухкратным сульфатноамонийным осаждением, был обогащен фикоцианином в 2,5 раза в сравнении с исходным водным экстрактом биомассы микроводоросли (см. разделы 3.1.1.5., 3.1.1.6.). Содержание селена в полученном образце составило 100 мкг/г белка. Крысы получали по 50 мг белка препарата (что соответствует 5 мкг селена) в день в виде водного раствора, добавляемого к СРВ рациону (овсяной каше или зерносмеси). Дополнительная квота белка, поступающая в день с препаратом, составила 1,35 % от содержания белка в суточном рационе (см. раздел 3.1.1.7.) Крысы второй, контрольной группы (24 животных) получали СРВ без добавок. На 1-й, 3-й и 5-й день опыта крыс внутрибрюшинно сенсибилизировали дозой 100 мкг овальбумина куриного яйца (ОВА, 5-кратно перекристаллизованный препарат), адсорбированного на 10 мг гидроксида алюминия. На 21-й день опыта вводили дополнительно еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа. По окончании кормления животных опытными рационами на, 29-й день у крыс отбирали 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения ответа антител, после чего вводили внутривенно разрешающую дозу 30 мг/кг массы тела ОВА в 0,5 мл изотонического апирогенного 0,15 М NaCl. Интенсивность гуморального иммунного ответа оценивали по концентрации циркулирующих специфических IgG антител (суммы фракций IgGi и IgGO с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (стандартного ELISA) на полистироле. В лунки полистирольных планшет вносили по 1,0 мкг ОВА в 0,1 М Na-бикарбонатном буфере рН 9,7± 0,1 и оставляли на 16 ч в холодильнике. По окончании адсорбции антигена буфер удаляли путем промывки 0,01 М Na-фосфатным буфером рН 7,3±0,1 с 0,15 М NaCl и 0,1 % Твин-20 (Твин-PBS). В лунки на 30 мин вносили по 200 мкл 1% раствора желатины в Твин-PBS. Отмывку повторяли, после чего вносили в лунки по 100 мкл стандартов крысиных антител к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии, или исследуемых сывороток крови крыс в разведении 1:2000. Разведения выполняли в PBS с 0,2% бычьего сывороточного альбумина (BSA-PBS). Планшеты инкубировали 120 мин при 20С со встряхиванием, после чего 5 кратно отмывали Твин-PBS и вносили по 100 мкл кроличьих антител к IgGi+4 крысы, конъюгированных с пероксидазой (производства НИИЭМ им Гамалеи РАМН), в разведении 1:4000 в BSA-PBS. Инкубацию и отмывку повторяли, после чего проводили реакцию со 100 мкл субстрата 0,04 % о-фенилендиамина и 0,04 % Н202 в 0,1 М Na-цитрат-фосфатном буфере рН 6,00±0,05 в течение 15 мин при 37С. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1н H2S04. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на фотометре «Униплан» (производства «Пикон», Россия).

Оценка биодоступности селена в составе исследуемых препаратов

Основная цель проведенного исследования состояла в оптимизации методов получения в лабораторных условиях новых пищевых источников органических форм селена (перспективных для дальнейшего промышленного масштабирования) и их экспериментальной оценке in vivo и in vitro. Что касается вопроса о том, в составе какого соединения (органического или неорганического) находится селен, то есть определенные основания отдавать предпочтение органическим формам данного микроэлемента, так как в подавляющем большинстве именно эти формы встречаются в продуктах растительного и животного происхождения. Использование неорганических соединений селена (селенитов и селенатов) представляется оправданным в лекарственных формах при наличии риска развития клинических проявлений дефицита этого микроэлемента и необходимости быстрого купирования состояния дефицита. По сравнению с неорганическими солями или окислами органические соединения селена обладают меньшим неблагоприятным побочным действием при возможных передозировках. Следовательно, разработка методов биотехнологического получения новых пищевых источников органического селена, их детальное исследование и характеристика представляются весьма актуальными.. В связи с этим большой интерес представляют так называемые биологические «матрицы», при «встраивании» в которые происходит биотрансформация селена, и он переходит из неорганической формы в органическую (селенсодержащие аминокислоты -селенометионин и селеноцистеин).

Настоящая работа была посвящена разработке способов получения, а также экспериментальной оценке и сравнительной характеристике биомассы селенсодержащего штамма Lactobacillus plantarum 8RA-3 и препаратов селенсодержащего фикоцианина (с различной степенью очистки) - пигмента, выделенного из обогащенной селеном сине-зеленой микроводоросли спирулины (Arthrospira platensis).

Биомасса селенсодержащих лактобацилл была получена путем культивирования штамма Lactobacillus plantarum 8RA - 3 в жидкой питательной среде с содержанием селена 5 мкг/мл в форме селенита натрия. Эта концентрация была выбрана как наиболее подходящая после проведения серии экспериментов, так как она обеспечивала оптимальное насыщение биомассы лактобацилл данным микроэлементом, его трансформацию в органическую форму и не подавляла роста биомассы. Содержание селена в сухой биомассе лактобацилл было стабильным, воспроизводимым и составило 1493 ± 7 мкг/г, что потенциально более чем достаточно для ее использования в качестве пищевого источника.

Одним из исследованных в данной работе новых пищевых источников селена была биомасса сине - зеленой микроводоросли спирулины платенсис (Arthrospira platensis).

Спирулина относится к царству цианобактерий и имеет современное систематическое родовое наименование Arthrospira sp. [19]. Спирулина способна расти при высоких концентрациях селена, которые, безусловно, летальны для подавляющего числа других прокариотических и эукариотических организмов, и накапливать селен в составе биомассы в высоких концентрациях [33, 34].

Важной особенностью спирулины является также высокая пищевая ценность ее биомассы. Содержание белка в высушенной биомассе спирулины может достигать, в зависимости от вида, штамма и условий культивации, от 50 до 75% [64]. Биомасса спирулины может быть также нутритивно значимым источником каротиноидов, фикоцианинов, витаминов группы В [103 - 105]. Усвояемость перечисленных нутриентов из спирулины достаточно высока ввиду того, что этот микроорганизм, в отличие от эукариотических микроводорослей (в частности, хлореллы), пищевых дрожжей и лактобацилл, лишен плотных неперевариваемых клеточных оболочек [19, 58]. Использованная в данной работе сухая биомасса селенсодержащей спирулины, получена биотехнологическим методом культивирования штамма Spirulina platensis (штамм. Nordst. Geitl. Ippas.(per. № В - 437) в присутствии в ростовой среде селенита натрия в регулируемых условиях теплиц открытого типа. Содержание селена в сухой биомассе составило 512±9мкг/г. Согласно [66,67] биодоступность селена в составе селенсодержащей спирулины может быть существенно увеличена путем водной экстракции. Поэтому представлялось целесообразным разработать метод получения водорастворимого селенсодержащего препарата из биомассы обогащенной селеном спирулины платенсис, содержащего, помимо селена, фикоцианин -пигмент, обладающий по данным литературы выраженным иммуномодулирующим действием.

Для этих целей вначале был модифицирован метод получения фикоцианина из спирулины, впервые примененный для выделения этого фотосинтетического пигмента из цианобактерии Schizotrix sp.[157].

Выделение включало стадии водной экстракции, сульфатноаммонийных фракционирований, хроматографии на колонках с ДЭАЭ-сефацелем и суперозой-12. В результате был выделен фикоцианин необогащенной селеном спирулины со степенью очистки в 31 раз с выходом 19,6%. При этом содержание селена в нем составило 1,20±0,02мкг/г.

Этот метод выделения был сравнительно успешно использован для получения из биомассы селенсодержащей спирулины двух препаратов селенсодержащего фикоцианина: его водного раствора со степенью очистки в 2,1 раз и выходом 28 % и высокоочищенного препарата (степень очистки в 27 раз с выходом 4 %. Содержание селена составило в первом случае 4 мкг/мл, во втором - 92±2 мкг/г.

Похожие диссертации на Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм селена

Получение и экспериментальная оценка новых пищевых источников органических форм цинкаМунхуу Баяржаргал

Изучение биодоступности и влияния органических форм селена и цинка на состояние слизистой оболочки тонкой кишки растущих крысПенева, Вера Витальевна

Разработка новой кормовой добавки для крупного рогатого скота, содержащей связанную форму селенаНимацыренова Любовь Георгиевна

Морфобиохимические показатели крови и интенсивность роста гусей под влиянием пробиотика ветом 1.1 и органической формы селенаСмоловская Оксана Владимировна

Физиологическое обоснование использования разных форм соединений селена, йода и цинка в кормлении цыплят-бройлеровШацких Елена Викторовна

Модификация способа получения и оценка эффективности иммуномодулирующего средства из тимуса телят и молодняка крупного рогатого скотаТармакова Ольга Станиславовна

Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёзаБолдырев Александр Николаевич

Получение и оценка биологических свойств колицина E2Тихонов Георгий Игоревич

Физиологическая оценка эффективности процесса получения пчелиной пыльцы на пасеках с использованием СВЧ облучения природной интенсивностиЕгорашин, Валерий Геннадьевич

Разработка технологии получения препарата авермонмек и оценка его эффективности против паразитозов животных МонголииЦагаан залаа Бямбаагийн Бурэнбаатар