Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Ангиогенез и его роль в опухолевом росте
1.2. Эндогенные ингибиторы ангиогенеза матриксного происхождения
1.2.1. Эндостатин
1.2.2 Эндостатиноподобный фрагмент коллагена XV (EFC-XV)
1.2.3. Аррестен
1.2.4. Тумстатин
1.2.5. Эндорепеллин
1.2.6. Другие ингибиторы ангиогенеза матриксного происхождения
1.3. Эндогенные ингибиторы ангиогенеза нематриксного
происхождения
1.3.1. Система плазминогена человека и её роль в прогрессии опухолей
1.3.2. Ангиостатин
1.3.3. Фактор пигментного эпителия (PEDF)
1.3.4. Другие ингибиторы ангиогенеза нематриксного происхождения
1.4. Терапевтический потенциал ингибиторов ангиогенеза
1.5. Направленный транспорт химиопрепаратов в раковые клетки
1.6 Липосомы как системы направленной доставки и
контролируемого высвобождения противоопухолевых препаратов
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Получение нативного ангиостатина человека
2.2. Получение рекомбинатного эндостатина человека
2.2.1. Конструирование экспрессионного вектора эндостатина человека
2.2.2. Выбор штамма-продуцента Escherichia coli
2.2.3. Получение эндостатина путем экспрессии его гена в штамме Е. coli
2.2.4. Выделение эндостатина человека из клеток штамма-продуцента Е. coli
2.3. Получение липосомных форм ангиостатина и эндостатина
2.4. Получение рекомбинаитиого 3-го домена а-фетопротеина человека
2.5. Выделение эпидермального фактора роста мыши 58
2.6. Культивирование клеточных линий 58
2.7. Получение и анализ биологических свойств пептидов -модифицированных аналогов рецепторсвязывающих участков
ЭФР и ТФРа человека 59
2.7.1. Синтез пептидов 59
2.7.2. Исследование интернализации пептидов 60
2.7.3. Изучение динамики интернализации ФИТЦ-меченых пептидов в опухолевые клетки 61
2.8. Получение конъюгатов доксорубицина (ДР) с векторными
ПеПТИДаМИ | .;;;... 61
2.9. Определение цитотоксическои активности (ЦТА) препаратов in
vitro 62
2.9.1. Определение ЦТА ангиостатина и эндостатина в отношении эндотелиальных клеток линий АВАЕ и HUVEC 62
2.9.2. Определение ЦТА ангиостатина, эндостатина и конъюгатов ДР с векторными пептидами в отношении клеток линий DU145, А431,
MCF-7, НТ1080, SVEC4-10 и фибробластов человека 62
2.9.3. Определение выживаемости клеток 63
2.10. Оценка противоопухолевой активности препаратов in vivo 63
2.10.1. Животные и опухоли 63
2.10.2. Дозы препаратов и схемы их введения 63
2.10.3. Объём опухолей 64
2.10.4. Продолжительность жизни животных 64
2.11. Статистическая обработка результатов 64
Глава 3. Результаты и их обсуждение ,;. : 65
3.1. Выделение и очистка ангиостатина 65
3.1.1. Выделение плазминогена из плазмы крови человека 65
3.1.2. Выделение ангиостатина путём ограниченного протеолиза плазминогена . 65
3.2. Получение рекомбинантного эндостатина человека 68
3.2.1. Конструирование экспрессионного вектора и биосинтез
рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента
Е. coli BL21(DE3) 68
3.2.2. Выделение эидостатина человека из клеток штамма-продуцента Е. coli 71
3.3. Получение липосомных форм ангиостатина и эидостатина 75
3.4. Получение рекомбинантного 3-го домена а-фетопротеипа человека 76
3.5. Выделение и очистка эпидермального фактора роста мыши 78
3.6. Исследование возможности доставки модифицированных рсцспторсвязывающих фрагментов ЭФР и ТФРа человека в опухолевые клетки путём рецепторопосредованного эндоцитоза 79
3.7. Получение конъюгатов ДР с векторными пептидами 84
3.8. Определение ЦТА препаратов in vitro 84
3.8.1. Определение ЦТА ангиостатина и эидостатина в отношении эндотелиальных клеток линий HUVEC, АВАЕ и SVEC4-10 84
3.8.2. Определение ЦТА ангиостатина и эидостатина в отношении гладкомышечных, соединительнотканных и раковых клеточных линий 86
3.8.3. Определение ЦТА конъюгат9в,ДР с АФПзд, ЭФР, ЭФРМф и ТФРМф 89
3.8.4. Микроскопическое исследование динамики интернализации и внутриклеточного распределения конъюгата ТФРмф-ДР в раковых
клетках 93
3.9. Исследование противоопухолевой активности полученных
препаратов in vivo . . • 95
3.9.1. Сравнительное исследование противоопухолевой активности
свободных и липосомных форм ангиостатина и эидостатина на мышах
с привитыми солидными опухолями 95
3.9.2. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов ДР с
векторными пептидами на мышах с привитыми солидными опухолями 97
3.9.3 Изучение противоопухолевой активности антиангиогенных
препаратов и конъюгатов ДР с векторными пептидами при их
совместном применении in vivo 100
Выводы 106
Список литературы 107
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач, стоящих перед медициной, является разработка новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований. В последние десятилетия значительным достижением в этой области является доказательство необходимости процесса ангиогенеза для роста злокачественных солидных опухолей и создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза [3, 71, 73].
Ангиогенез - процесс роста капилляров из кровеносных сосудов, в результате которого образуются новые сосудистые сети. При этом патологический рост новых сосудов обуславливает прогрессию ряда заболеваний, прежде всего рост и метастазирование злокачественных опухолей [60].., Подавление ангиогенеза ведёт к торможению опухолевого роста и развития метастазов. Среди 27 известных в настоящее время эндогенных ингибиторов ангиогенеза наиболее перспективными являются белки ангиостатин и эндостатин. Однако эти полипептидные ингибиторы ангиогенеза проявляют высокую терапевтическую эффективность преимущественно в больших дозах (25-100 мг/кг массы тела) и требуют продолжительного курса лечения [36]. В связи с этим
особенно актуальной задачей представляется разработка пилотных высокотехнологичных методов получения ангиостатина и эндостатина, а также поиск возможностей изменения существующих схем терапии этими полипептидами, в частности, путём применения их липосомных форм.
Следует отметить, что несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы при становлении и развитии антиангиогенной терапии, для полной ремиссии применение только антиангиогенных препаратов часто является недостаточным. Более эффективным подходом представляется комбинированная противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными механизмами действия. В основе этого подхода лежит представление о том, что нарушение различных биохимических процессов в опухолевой клетке уменьшает шансы на то, что уцелеют
резистентные клоны опухолевых клеток [12]. Терапия антиангиогенными полипептидами, разрушающая инфильтрирующие опухоль кровеносные сосуды и уничтожающая раковую клетку опосредованно, могла бы успешно сочетаться с применением высокоэффективных противоопухолевых антибиотиков, проявляющих в малигнизированных тканях прямое цитотоксическое действие. Однако традиционные препараты этого класса, например, доксорубицин (ДР), обладают токсическими дозозависимыми побочными эффектами, обусловленными отсутствием избирательности действия. Одним из наиболее
перспективных путей решения данной проблемы, а также повышения эффективности действия цитотоксических противоопухолевых химиопрепаратов, является разработка способов их направленной доставки в раковую клетку с помощью конъюгироваиия с векторными полипептидами, имеющими специфические рецепторы на мембранах клеток-мишеней [41, 165]. Очевидно, что комбинированная терапия антиангиогенными агентами и препаратами направленного действия является наиболее перспективным избирательным и эффективным путём воздействия на злокачественные опухоли.
Исходя из этого, актуальной целью данного исследования являлось изучение терапевтического потенциала комбинированной противоопухолевой терапии антиангиогенными полипептидами и препаратами адресного воздействия на клетки злокачественных новообразований.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
- разработать технологичный метод получения рекомбинантного эндостатина человека; получить липосомные формы эндостатина и ангиостатина человека и изучить их противоопухолевую терапевтическую эффективность in vivo в сравнении с нелипосомными формами;
- получить векторные пептиды, способные к избирательному проникновению в клетки злокачественных опухолей путём рецепторопосредованного эндоцитоза;
- синтезировать цитотоксические конъюгаты выбранных векторов с химиопрепаратами, обладающие адресным воздействием на раковые клетки in vitro и in vivo; исследовать терапевтическую эффективность сочетанного применения антиангиогенных полипептидов и цитотоксических препаратов направленного действия при лечении мышей с привитыми солидными опухолями меланомы В16.
Научная новизна работы. Сконструированы плазмидные векторы Escherichia coli, позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез рекомбинантного эндостатина человека в клетках штамма-продуцента.
Впервые получены липосомные формы ангиостатина и эндостатина человека и
обнаружено, что противоопухолевая эффективность данных форм in vivo выше, чем соответствующих нелипосомных форм.
Впервые получены синтетические пептиды ЭФРмф и ТФРмф, представляющие собой модифицированные рецепторсвязывающие фрагменты соответственно эпидермального фактора роста (ЭФР) и трансформирующего фактора роста-а (ТФРа) человека. Показана способность этих пептидов проникать в раковые клетки линии DU145 путём рецепторопосредованного эндоцитоза.
Впервые получены ковалентные конъюгаты пептидов ЭФРМф, ТФРМф и
рекомбинантного белка - 3-го домена а-фетопротеина человека (АФПзд) с ДР и
продемонстрирована их высокоспецифичная цитотоксическая активность (ЦТА) in vitro
по отношению к клеткам злокачественных опухолей. Впервые in vivo продемонстрирована
более высокая терапевтическая эффективность комбинированного применения антиангиогенных полипептидов и цитотоксических химиопрепаратов направленного действия по сравнению с монотерапией каждым из этих терапевтических агентов.
Практическая значимость исследования. Обнаружение более высокого терапевтического потенциала in vivo липосомных форм ангиостатина и эидостатипа по сравнению с их свободными формами делает возможным развитие этого направления в области создания новых противоопухолевых средств.
Полученные химиопрепараты направленного действия на основе ДР (ЭФРМф-ДР, ТФРмф-ДР и АФПзд-ДР), оказывающие выраженное противоопухолевое действие при терапии мышей с опухолями меланомы В16, могут подвергаться дальнейшему изучению на различных модельных объектах in vivo с перспективой перехода в разряд препаратов, проходящих доклинические испытания.-; .:-.---. • :
Продемонстрированное преимущество комбинированной терапии опухолей,
включающей применение антиангиогенных полипептидов и цитотоксических препаратов
на основе ДР, то есть двух классов препаратов с различными механизмами
противоопухолевого действия, представляет большой интерес в поиске эффективных схем
противоопухолевой терапии. Полученные результаты расширяют понимание вопроса сочетания разных типов антинеопластйческих средств при выборе схем лечения онкологических заболеваний и показывают важность продолжения исследований антиангиогенных полипептидов и цитотоксических химиопрепаратов на основе пептидных векторов, специфические рецепторы которых гиперэкспонированы на мембранах злокачественно перерождённых клеток.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2004 г., Москва), па 18-м конгрессе EACR (июль 2004 г., Инсбрук, Австрия), на I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (октябрь 2004 г., Москва), на I Международной научно-практической конференции «Медбиотек» (март 2005 г., Москва),
на III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (март 2005 г., Москва), на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (июнь 2005 г., Пущино), а также на научных семинарах кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова.
Апробация работы состоялась на совместном заседании научно-методической конференции кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова и отдела биохимии Московского НИИ медицинской экологии 28 сентября 2005 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, оформлена 1 заявка на выдачу патента РФ на изобретение.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы, список цитированной литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 9 таблицами.
