Особенности нуклеиново-белкового обмена созревающего эндосперма кукурузы ОПАК-2 Плотников Владимир Константинович

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Значение кукурузы опак-2 для практики и теорий . 12

1.2. Особенности синтеза и накопления.белков в созревающем зерне опак-2 кукурузы 15

1.3. Матричные4РНК, процессинг и гены, проламинов 24

1.4. Влияние гена опак-2 на содержание нуклеинотвых кислот в эндосперме кукурузы 29

1.5. Активность рибонуклеази в эндосперме.кукурузы опак-2 31

1.6. Некоторые гипотезы о молекулярном механизме действия гена опак-2 34

1.7. Заключение по аналитическому обзору 38

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ ИСОЩОВАНИЯ 40

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССПОЛЬЗОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 58

3.1. Содержание суммарных нуклеиновых кислот . 58

3.2. Содержание рибосомной и транспортной РНК 60

3.3. Содержание полиаденилированной мРНК . 63

3.4. Температурные фракции поли-содержащей мРНК 69

3.5. Содержание прочно связанной с МАК фракции РНК. Соотношение полиаденилированной и неполиаденилированной субфракций псРНК 71

3.6. Рибонуклеазная активность и соотношение синтеза, белковых фракций в. созревающем эндосперме кукурузы 74

3.7. Некоторые биохимические, особенности мучнистой .дроговидной, тканей эндосперма нормальной кукурузы 81

3.8. Влияние актиномициновой-блокады синтеза мРНЕ на соотношение синтеза, белковых фракций в созревающем эндосперме нормальной,и. опак-2 кукурузы 84

3.9. Влияние актиномицина Д на компонентный состав альбуминов и глобулинов 91

З.10.Влияние актиномицина Д. на аминокислотный. -

состав эндосперма 92

3.11.Гипотеза .о молекулярном механизме действиягена опак-2 S7

5. ШВДЮЖЕНИЯ 108

СПИСОК ЛИТЕРАГОЫ 109

• Значение кукурузы опак-2 для практики и теорий
• МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ ИСОЩОВАНИЯ
• Содержание суммарных нуклеиновых кислот

Введение к работе

Решениями ХХУІ съезда КПСС и майского (1982 г.) Пленума ЦК КПСС поставлена задача дальнейшего повышения благосостояния советского народа, составной частью которой является бесперебойное снабжение населения высококачественными продуктами питания. В питании человека наиболее актуальной яеляєтся проблема полноценной белковой пищи (Постановления ХХУІ съезда КПСС, 1981; Постановления Пленума ЦК КПСС, 1982).

Медицинские исследования, проводимые в развивающихся странах, а также данные ФАО по пищевым ресурсам с особой остротой поставили вопрос обогащения белка злаков незаменимыми аминокислотами, учитывая, что именно зерновые являются основным поставщиком белков, потребляемых человечеством. При детальном анализе было установлено, что наиболее лимитирующей незаменимой аминокислотой в питании является лизин.

Среднесуточное потребление белка по данным ФАО составляет в настоящее Еремя примерно 60 г на человека. Это намного ниже научно обоснованной нормы, составляющей 100 г ( РАО , IS73).

В нашей стране потребление белка на душу населения превосходит рекомендуемые нормы, но необходимо его качественное улучшение за счет увеличения доли белков животного происхождения.

ХХУІ съезд КПСС назвал животноводство ударным фронтом на селе. Уто обязывает ученых усилить действенность своего влияния на указанную область сельскохозяйственного производства. На сегодняшний день самое узкое место в производстве животноводческой продукций - корма.

Кукуруза - одна из важнейших кормовых сельскохозяйственных культур в раде регионов нашей страны. При всех достоинствах зерна кукурузы как высокоэнергетического корма, оно содержит отно- сительно мало белка (9-11$) и лизина (2,25-2,80 г на 100 г белка). Кормление животных этим зерном вызывает необходимость в дополнительных высокобелковых добавках, имеющих повышенное содержание лизина и ряда других аминокислот. Однако обеспеченность таковыми весьма ограничена. Поэтому важнейшей задачей в селекции этой культуры является повышение количества и улучшение качества белка.

Для селекции на качество белка большое значение имеет открытие биохимического действия эндоспермовой мутации опак-2 (Hertz е.т. et ai., 1964). Исследования показали, что повышение содержания лизина в эндосперме мутантной кукурузы обусловлено большими изменениями в соотношении синтеза различных белковых фракций.

Ген опак-2 наследуется как простой менделевский рецессив, но отличается очень сложным фенотипическим проявлением. В эндосперме мутанта изменены активность и изоэнзимный спектр ряда ферментов белкового, нуклеинового и углеводного обменов, нарушена клеточная и субклеточная организация эндосперма.

На основе генотипа опак-2 создан ряд гибридов и сортов кукурузы с высококачественным зерном. Однако эта кукуруза не получила должного распространения из-за некоторого снижения урожая (на 10-15$) и повышенной поражаемости гнилью и долгоносиком при хранении.

Главное, что сдерживает сейчас селекцию на качество белка, - слабая изученность природы сложных признаков качества. Генетическое манипулирование осуществляется селекционерами без знания природы компонентов, составляющих модифицируемый признак. Значительного прогресса в усовершенствовании методов селекции можно было бы достичь в том случае, если бы удалось установить надежные способы выявления узловых моментов в ряду элементарных про- цессов, формирующих качество белка эндосперма. Одной из важных проблем в этом отношении является создание связи между молеку-лярно-генетическим уровнем исследований и генетикой признаков и свойств.

Б постановлении ЦК КПСС и Совета Министров СССР (1981) подчеркивается, что важнейшей задачей советской науки на современном этапе является дальнейшее расширение и углубление фундаментальных исследований и разработки на этой основе новых эффективных методов селекции растений и животных.

Открытие биохимического действия гена опак-2 стимулировало молекулярно-биологические исследования синтеза запасного белка. Во многих лабораториях мира были предприняты работы по изучению мембраносвязанных полирибосом и их матричных РНК из эндосперма кукурузы, что прояснило многие детали синтеза и процессинга зеи-на. Применение методов генетической инженерии позволило вплотную подойти к выяснению тонкой организации генов этого белка.

Однако несомненные успехи в познании молекулярных основ синтеза запасного белка не дают ответа на вопрос, что является причиной широкого плейотропного эффекта в действии гена опак-2.

Решение этого вопроса в значительной степени способствовало бы определению целей и методов в селекции на качество белка с использованием мутанта опак-2, помогло бы реально оценить перспективы этого направления в селекции высоколизиновой кукурузы.

Прямая характеристика генной активности возможна лишь путем определения непосредственных ее продуктов - молекул рибонуклеиновой кислоты (РНК). Связь нуклеиновых кислот с морфогенезом растения и формированием урожая осуществляется в процессе синтеза белка. При этом основным компонентом белоксинтезирующей системы являются молекулы матричной РНК (мРНК).

Известно, что для растений, как и для других эукариот, характерно наличие мРНК, имеющих на 3-конце молекулы протяженную последовательность полиадениловой кислоты (поли-А-содержащая мРНК). Но не вся популяция мРНК в растениях полиаденилирована.

Молекулы мРНК различной структурной организации и субклеточной локализации определяют синтез белков, различающихся физико-химическими свойствами и биологической ролью. Поэтому изучение содержания и особенностей распределения различных видов мРНК в эндосперме опак-2 кукурузы представляет значительный интерес для установления причины перераспределения белковых фракций в мутантном эндосперме.

Однако информация по этому вопросу крайне ограничена. Цель и задачи исследования: - изучить динамику содержания суммарных нуклеиновых кислот и различных фракций РНК в процессе развития эндосперма нормаль ной и опак-2 кукурузы, при этом особое внимание уделить выясне нию действия гена опак-2 на содержание мРНК эндосперма различной структурной организации и субклеточной локализации (полиаденяди- рованные и неполиаденилированные; мРНК полирибосом белковых тел и микросом, а также свободных полирибосом); - изучить динамику РНК-азной активности в процессе развития эндосперма нормальной и опак-2 кукурузы; выяснить особенности распределения РНК-азной активности в созревающем нормальном эндо сперме; - установить характер взаимосвязи между экспериментально вызванными изменениями в популяции мРНК и соотношением синтеза белковых фракций в эндосперме нормальной и опак-2 кукурузы; - создать на основе экспериментальных и литературных данных гипотетическую модель молекулярного механизма действия гена опак-2 по изменению белкового и аминокислотного состава эндосперма кукурузы.

В настоящей диссертации выносятся на обсуждение следующие результаты и предложения:

Значительная часть мРНК эндосперма кукурузы не полиадени-лирована. Ген опак-2 снижает как абсолютное, так и относительное содержание неполиаденилированной фракции и относительное содержание полиаденилированной фракции мРНК. При этом снижается степень полиаденилирования последней. В то же время поли-А-содержащая мРНК мембраносвязанных полирибосом распределена между субклеточными фракциями белковых тел и микросом примерно поровну, но по характеру распределения и по абсолютному содержанию ее не найдено достоверных различий между нормальным и опак-2 эндоспермом.

В процессе развития зерновки в эндосперме повышается активность РНК-азы. Распределение ее в нормальном эндосперме неравномерно: обнаружен градиент активности от верхушки эндосперма к его основанию и от центра к периферии. Под действием гена опак-2 активность РНК-азы на протяжении всего развития увеличивается в

2 раза.

Увеличение РНК-азной активности в ходе развития эндосперма сопровождается относительным усилением синтеза зеина на фоне снижения общей активности синтеза белка. Эта закономерность резче выражена для опак-2 эндосперма. Однако абсолютная интенсивность синтеза зеина значительно ниже в эндосперме опак-2 и в мучнистой части нормального эндосперма, имеющей, подобно мутанту, высокую активность РНК-азы и высокое содержание лизина в белке.

Распад мРНК в эндосперме обычной кукурузы в условиях ак-тиномиоднового блока транскрипции приводит к перераспределению синтеза осборновских белковых фракций и белковых компонентов в _ Q _ составе альбуминов и глобулинов, подобно контрольному мутантному эндосперму. Характер изменений в соотношении синтеза белковых фракций в опак-2 эндосперме в аналогичных условиях иной и соответствует более глубокой степени деградации популяции мРНК по сравнению с нормальным эндоспермом.

5. Предложена гипотеза о молекулярном механизме действия гена опак-2 на посттранскрипционном уровне регуляции синтеза белка. Центральный ее момент - усиление дифференциального распада мРНК в мутанте вследствие высокой активности РНК-азы. Предполагается, что распад короткоживущих мРНК приводит к относительной стабилизации умеренно- и долгоживущих мРНК эндосперма в результате уничтожения белков-репрессоров, снижающих время жизни этих мРНК. Существование подобных белков было постулировано ранее (Tomkins G.M. et al., 1969).

Вследствие этого повышается синтез альбуминов и глобулинов и репрессируется синтез зеина, что может быть связано с уничтожением короткоживущих мРНК белков, создающих условия для интенсивного синтеза зеина. При этом происходят изменения в активности многих ферментов (повышение или понижение - в зависимости от времени жизни соответствующих мРНК), приводящие к развитию плейотропного эффекта в действии гена опак-2.

Научная новизна результатов исследования. Изучена динамика содержания различных фракций РНК в процессе развития эндосперма нормальной и опак-2 кукурузы, при этом установлено: значительное увеличение содержания РНК в мутанте обусловлено, в основном, заторможенностью развития опак-2 эндосперма и сохранением вследствие этого картин содержания РНК ранних этапов созревания; относительное содержание полиаденилированной мРНК и степень ее полиаденилирования в опак-2 эндосперме снижены; показано, что поля-А-содержащая мРНК мембраносвязанных полирибосом распределена между субклеточными фракциями белковых тел и щкросом примерно поровну, но по характеру распределения я абсолютному содержанию этих мРНК достоверных различий между сравниваемыми формами эндосперма не найдено; популяция мРНК эндосперма кукурузы лишь частично полиадени-лярована: в нормальном эндосперме на долю поли-А-содержащей мЕНК приходится только 35$. Ген опак-2 снижает содержание неполиадени-лированной фракции мЕНК;

РНК-азная активность распределена по нормальному эндосперму неравномерно. Мучнистая ткань его имеет сходную с опак-2 высокую РНК-азную активность и содержит значительно больше лизина, чем роговидная ткань, уто связано с перераспределением белковых фракций; распад мШК эндосперма нормальной кукурузы в условиях ак-тиномйцянобой блокады транскрипции показал, что усиление деградаций мРНК может быть причиной перераспределения осборновскйх фракций белков и белковых компонентов альбуминов и глобулинов. И как следствие этого - увеличение в эндосперме содержания лизина; экспериментальные данные позволили выдвинуть гипотезу о молекулярном механизме действия гена опак-2 по изменению белкового и аминокислотного состава эндосперма.

Практическая значимость. Выяснение причяны перераспределения белковых фракций и развития в целом "высоколизинового синдрома" в эндосперме опак-2 является необходимой предпосылкой разработки теоретических основ селекции на качество белка, знание которых поможет более осмысленно подойти к решению этой проблемы и оградит селекционеров от нерациональных поисков. На основании получен- - II - ных данных и сформулдрованной гдпотезы на сегодняшнем этапе представляется целесообразным вести селекцию, ориентируясь на экономически обоснованный компромисс сочетания в эндосперме мучнистой (высокая FHK-азная активность, высокое содержание лизина) и роговидной (низкая ЕНК-азная активность, низкое содержание лизина) тканей.

ГЛШ І. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ І.І. Значение кукурузы опак-2 для практики и теории

Одиночный рецессивный ген опак-2, локализованный в седьмой хромосоме генома кукурузы, вызывает изменения в соотношении белковых фракций эндосперма: снижает количество малоценного по лизину и триптофану зеина и увеличивает долго альбуминов, глобулинов и глютелинов. В результате содержание лизина повышается на 50-100$ и триптофана на 40-60$.

Многочисленные опыты на животных и людях показали исключительно высокую питательность зерна кукурузы опак-2, белок которой по биологическому действию оказался близким к белкам молока (Мертц Е.Т., 1969; Valve de v. et ai. , 1981). Эффективность вы-соколизйновой кукурузы в кормлении свиней и птицы выражалась увеличением продуктивности на 18-25$, возможностью снижения расхода белка на 20$, уменьшением затрат кормов на единицу продукции на 12-15$ по сравнению с теми же показателями на обычной кукурузе (Рядчиков В.Г., 1977).

Однако в ходе создания высоколизиновых аналогов линий и гибридов были обнаружены отрицательные свойства, присущие зерновкам типа опак-2: I) мутантные зерновки легче, чем зерновка нормального генотипа, что является следствием меньшей плотности эндосперма; 2) к моменту уборки влажность зерна опак-2 на 1,5-4$ выше в сравнении с обычными аналогами, что, возможно, связано с увеличением свободных аминокислот, зольных элементов и белков типа альбуминов, значительно повышающих гидрофильность зерновки; 3) початки опак-2 более восприимчивы к болезням, особенно фузарйозу,и вредителям (Ключко ЇЇ.Ф., Максак Н.Н., 1969; Александер Д.Е. и др., 1971; Га-леев Г.С. и др., 1971; Каджинов М.ЇЇ., Зима К.И., 1972; Гурьев Б.Л., - ІЗ -

Козубенко А.В., 1976; Писанский А.П. и др., 1976; Таова JUL, 1976; Цыганок И.С., 1978).

Зерно высоколизиновой кукурузы отличается мучнистым эндоспермом, для которого характерно множество воздушных полостей (Попова Е.П., 1979). Снижение веса зерна, а следовательно, и урожая было связано первооткрывателями мутации опак-2 E.T.Mertz, O.E.Nelson (1966) с меньшим содержанием крахмала в мутантном эндосперме (пит. по Bates L.s. , 1982). Кроме того, белковые тела - особые органеллы, образующиеся в результате отложения зеина в просветы гранулярного эндоплазматического ретикулума, - в опак-2 намного мельче, чем в эндосперме нормальной кукурузы (Wolf M.G., 1967; Перуанский Ю.Б., Портной В.Х., IS79; Филичкин С.А., 1982).

Наличие вышеперечисленных отрицательных свойств существенно сдерживает внедрение кукурузы опак-2 в сельскохозяйственную практику. Поэтому в настоящее Бремя основное внимание уделяется селекции на устранение этих недостатков.

Открытие E.T.Mertz и его соавторов (1964) вызвало определенный энтузиазм среди ученых и селекционеров, работающих в области улучшения качества белка. Сходстео основных закономерностей биосинтеза и накопления запасных белков злаков на основе закона гомологических рядов Н.И.Вавилова позволило надеяться на обнаружение аналогичных мутаций и в других родах и видах злаков. Вскоре были найдены или созданы искусственным мутагенезом подобные мутации У ячменя (Ingversen G. , 1973; MunckX. et al. , 1979) И у сорго (Singh R., Axtell G.D. , 1973).

Было установлено, что гены, ответственные за высокое содержание лизина, наследуются просто, но отличаются очень сложным фено-типическим проявлением. E.T.Mertz определил эту ситуацию как "вы-соколизиновый синдром", уподобив его наследственной болезни обмена веществ, выражающейся в дефиците пролащна или в хронической гипераминокислотности ( Mertz Е,т. , 1976).

В таблице I.I приведены признаки высоколизинового синдрома, характерного для линий кукурузы, ячменя и сорго. Очевидно, что перераспределение белковых фракций эндосперма является общим признаком этих мутантов.

Таблица I.I "Высоколизиновый синдром" у мутантов кукурузы опак-2,.ячменя 1508 и сорго нь (Мунк Л., 1981)

Признак, изменение j опак-2 | 1508 } HL

Увеличение содержания аминокислот

Непрозрачный эндосперм .

Увеличение размера зародыша

Уменьшение проламинов .

Увеличение альбуминов и глобулинов

Увеличение глютелинов

Небольшое увеличение неэкстрагируе- мого белкового остатка

Существенные изменения в аминокислот ном.составе белковых фракций

Измененные белковые тела- .

Увеличение содержания свободных аминокислот

Увеличение образования амилазы во время прорастания

Увеличение рибонуклеазной активности

Увеличение содержания растворимых

Сахаров -

Уменьшение содержания крахмала Увеличение содержания калия

Кроме того, важное значение мутанта опак-2 для теории состоит в том, что он впервые показал возможность нарушения взаимосвязи: увеличение азотного питания - увеличение содержания пролами-нов - снижение питательной ценности эндосперма, которая до открытия этого мутанта считалась почти догмой ( Tsai c.Y. et аі.Д978; Bates L.S., 1982).

1.2. Особенности синтеза и накопления белков в созревающем зерне опак-2 кукурузы

По функциональной значимости белки зерна могут быть подразделены на 2 большие группы - белки протоплазмы и запасные. К первым относятся структурные и энзиматические белки цитоплазмы и ядра, то есть белки рибосом, митохондрий, хромосом, разного рода, мембранных и плазматических систем. Они свойственны клеткам всех частей зерновки, особенно много их в зародыше. Запасные белки зерновки кукурузы представлены в основном зеином, преимущественно локализованным в белковых телах эндосперма.

При последовательном извлечении из муки водой, растворами соли, спирта и щелочи белки разделяются соответственно на альбумины, глобулины, зеины (проламины) и глютелины С Osbom т.в. , 1897). Границы классификации осборновских фракций в известной степени условны, но они наиболее изучены и широко используются в исследовательской практике при выяснении физиолого-биохимических процессов в период формирования и прорастания семян.

По абсолютному количеству альбумины и глобулины составляют менее 10$ общего азота эндосперма. Но функционально эти белки играют очень важную роль, так как в их состав входят ферменты. Основной функцией остальных двух групп белков, очевидно, является отложение азота для последующего его использования зародышем в период прорастания (Павлов А.Н., 1967; Конарев В.Г., 1980).

У кукурузы в процессе созревания соотношение белковых фракций изменяется. В период формирования и налива зерна большая часть белков представлена альбуминами и глобулинами. В первый период созревания (с фазы молочной до восковой спелости) накапливаются проламины и особенно глютелины (Буракаева Б.Х., 1964; Павлов А.Н., 1967).

Многочисленные исследования показывают, что под действием гена опак-2 все группы белков претерпевают изменения. Уже на ранних этапах формирования зерновки у опак-2 наблюдается замедленный синтез белка ( Murpny G.G., Dalby A. , I97I;Misra P.S.et al., 1972, 1975). Так, например, его содержание на 20-ый день от опыления в сухом веществе эндосперма нормальной кукурузы линии Висконсин 64А (W64A +/+) составляет 13,5$; а у ее аналога опак-2 -только 6,7$. Постепенно это различие между сравниваемыми формами уменьшается, однако к моменту полной спелости оно остается весьма значительным: 13,6$ W64A+/+ я 10,3 W64A02/02 (Рядчиков В.Г. и др., 1977).

Включение in vivo ¹⁴С-лизяна и s -метионина в белки созревающего эндосперма (молочно-восковая стадия) менее интенсивно у опак-2 аналога, чем у нормального. Однако подавление синтеза альбуминов и глобулинов оказывается во много раз слабее, чем про-, ламинов (Калинников. Д.Д. и др., 1976).

По мере созревания зерна содержание суммы альбуминов и глобулинов в обоих генотипах заметно снижается (Плешков Б.П. и др., IS75; Dalby А., 1966; Dalby A., Tsai c.Y. , 1975). Для эндосперма опак-2 характерно более медленное снижение легкорастворимых белков, что в конечном итоге приводит к преобладанию этих белков в мутантном эндосперме ( Dalby А., 1966; Гурьев Б.П. и ДР., 1979).

Однако особый интерес представляет динамика содержания отдельно фракций альбуминов я глобулинов. На мутантной линия ^w 64А изучено накопление отдельных белков в процессе созревания зерновки. При этом были установлены 2 главные фазы формирования белковых спектров: первая - 30 дней после опыления; и вторая - остальное время до созревания. Альбумины накапливались быстрее в обоих формах в течение первой половины развития, в это время их количество превышало содержание альбуминов в зрелом эндосперме. В течение второй половины наблюдалось снижение содержания альбуминов, которое в мутантной линии было менее заметным, чем в нормальной.

Накопление глобулинов в сравниваемых формах эндосперма до 35-го дня происходило сходным образом. После 35-го дня синтез глобулинов в мутанте был выше, чем в нормальном аналоге. Автор исследования предполагает, что усиление синтеза глобулинов в эндосперме мутанта является ответом на ограничение синтеза зеина ( Dierks-Ventling с. , 1981). Большее накопление глобулинов в мутантном эндосперме отмечено и другими авторами ( Landry G., Moureaux Т. , 1982).

Исследование качественной картины альбуминов и глобулинов методом электрофореза в ПААГ на разных стадиях созревания показало, что под действием гена опак-2 исчезают одни белковые фракции, но появляются другие, и к моменту полной спелости у нормальной кукурузы спектр сильно обедняется, в то время как у мутантной в этот период в спектре альбуминов и глобулинов в целом сохраняется картина ранних стадий развития ( ьоШіа м.ъ. et ai. , 1974; Рядчиков В.Г. и др., IS77).

В альбуминах зрелого зерна мутантов опак-2, полученных на основе линий В37, W64A, R802A, Oh43, электрофорезом в ПААГ обнаружено возрастание количества полипептида с молекулярной мае- cot 70 000 у всех четырех мутантних линий, в трех из четырех линий это сопровождалось исчезновением или снижением количества компонента с молекулярной массой 32 000. В составе глобулинов возрастало количество полипептидов с молекулярной массой 47 000, 58 000, 52 000 ( Dierks-Ventling С, 1981).

В то же время группой итальянских исследователей показано, что между синтезом зеина и синтезом глобулина с молекулярной массой 32 000 существует тесная взаимосвязь: количество зеина в эндосперме прямо пропорционально количеству этого глобулина. И именно этого белка не обнаружили в спектре глобулинов семи линий с аллелями опак-2, используя метод иммуно-электрофореза с применением антител к глобулину 32 000. Авторы считают, что белок 32 000 находится под контролем локуса опак-2 и играет важную роль в накоплений зеиновых белков в эндосперме кукурузы ( soave С. et al., 1981).

Количественные изменения в составе альбуминов и глобулинов подтверждаются результатами исследований активности отдельных ферментов. В созревающем опак-2 эндосперме повышена активность рибонуклеази ( Dalby A.,Davies G. ,1967; Wilson СМ., Alexander D.E. , 1967; Лукьяненко Л.М., Дмитриева A.H., 1976), АТФ-азы (Лукьяненко Л.М., Дмитриева A.H., 1974, 1976), глютаматсинтетазы, глютаматдегидрогеназы, аспарагиназы, аспарагин- и глютаминсинте-тазы; уровень эндопептидазы у нормального генотипа в начале развития возрастал, а затем снижался, у мутанта снижение активности эндопептидазы выражено в меньшей степени, в результате чего на поздних стадиях созревания активность протеазы оставалась на более высоком уровне ( Misra s., Oaks А., 1981). В то же время в опак-2 эндосперме повышено содержание ингибиторов трипсина (Левицкий А.П и jip._t 1981).

Имеются изменения в изоэнзимном спектре глутамат-дегидроге-назы и пероксидазы ( bodha м.ъ. et al., 1974), Обнаружены различия в свойствах НЖ-полимеразы: оптимум концентрации ионов марганца для полимеразы опак-2 в 10 раз ниже, чем для нормальной ( Mehta S.L. et al., 1975).

Снижен уровень активности глюкозо-6-фосфаткетоизомеразы и АДФГ-крахмал-глюкозилтрансферазы (синтетазы крахмала), что, вероятно, является причиной меньшего накопления крахмала в опак-2 эндосперме на поздних стадиях развития ( Д-oshi S. et al. , 1980).

Известно, что в мутанте ослаблено превращение лизина в глу-таминовую кислоту по сравнению с нормальным эндоспермом ( Sodek L., Wilson СМ. , 1970; Чигвинадзе Т.Д., 1981, 1982). Возможно, это связано и с изменением активности соответствующего фермента или системы ферментов.

Имеются изменения в электрофоретической подвижности и аминокислотном составе некоторых гистоновых белков, а также в содержании Hj гистона ( Konstantinov К. et al., 1981).

Есть основания считать, что глютелины не являются индивидуальными белками, а представляют ассоциацию неопределенного количества молекул альбуминов, глобулинов и зеина (Калинников Д.Д., 1971). Максимальное накопление глютелинов у обычной кукурузы наблюдается между 20-ым и 40-ым днями, а у опак-2 он нарастает в течение всего периода созревания (Лебедев А.В. и др., 1977).

Репрессия синтеза зеина под действием гена опак-2 проявляется и на ВСЄМ протяжении развития зерновки (Murphy G.G., Dalby А;., 1971; Misra P.S. et al. , 1972; Лебедев А.В. и др., 1977). При этом наблюдается изменение компонентного состава этой белковой фракции. Так, при фракционировании методом изоэлектрического фокусирования в зеине нормальной линии w 64А+/+ идентифицировано

46 компонентов, а в зеине линии-аналога - 29 компонентов. Кроме того, некоторые компоненты слабее выражены (Неудачин В.П., 1979). Линия кукурузы отличаются друг от друга по гетерогенности зеина ( Gianazza Е. et al. , 1076; Nucca R., Soave С, 1978; Неудачин В.П., 1979).

Электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии доде-цилсульфата зеиновые белки делятся по молекулярной массе на два больших (22 000 и 19 000) и два минорных (15 000 и 10 000) компонента. Мутант опак-2 снижает содержание зеина в основном за счет репрессии синтеза высокомолекулярного компонента - 22 000 (Jones Е.А. et al. , 1977; Larkins В.А. , 1980; Larkins В.А. et al., 1982).

Проламины являются белками,наиболее специфически обеспечивающими потребности растений в пластических веществах. Поэтому им придается большое значение в эволюционном развитии злаков (Семихов В.Ф., 1981; Перуанский Ю.В., 1981). Снижение содержания зеина в зерне или изменение его аминокислотного состава, к чему направлены работы ряда исследователей, угнетают жизнеспособность семени (Перуанский Ю.В., 1981).

Однако найдены мутанты с повышенным содержанием триптофана в зеине (Шевцова В.В., Калинников Д.Д., 1982) и в 100 раз более высоким содержанием треонина в зерне.

Молекулярные аспекты биосинтеза зеина. Вторая половина семидесятых годов нашего столетия была ознаменована тем, что в это время произошел значительный прогресс в знаниях о синтезе запасных белков в семенах. Это связано, в основном, с установлением места локализации синтеза этих белков, которым являются мембрано-связанные полирибосомы эндосперма злаков и семядолей бобовых растений ( Larkins В.А. et al. , 1975; Burr В., Burr F.A. , 1976; Jones R.A.et al_#,I976, 1977 a,b ; Beachy R. , 1982).

Исследование седиментавдонных характеристик и нуклеотидного состава полисомной РНК суммарных полисом созревающего эндосперма нормальной и опак-2 кукурузы не выявило каких-либо существенных Изменений под действием гена опак-2. Но использование этих полисом для синтеза белка в бесклеточной системе показало, что на начальных стадиях развития эндосперма полисомы мутанта включали в белок меньше лейцина и больше лизина в сравнении с таковыми из обычной кукурузы. По мере созревания эндосперма активность включения лейцина полисомами опак-2 увеличивается, что, по-видимому, связано с более интенсивным синтезом зеина в этот период ( Mehta S.L. et al. , 1973).

Использование мембраносвязанных полисом для синтеза белка в системе in vitro показало, что на 22-ой день от опыления полисомы мутанта включали в этанолрастворимый белок в 2 раза меньше ' ¹⁴С-лейодна по сравнению с таковыми из нормального зерна (Jones R.A. et al. , 1977).

В то же время изучение седиментагщонных профилей мембраносвязанных полисом выявило отсутствие у мутанта крупного класса мембраносвязанных полисом (9 и более рибосом на одну молекулу мРНК). Исследование было проведено в ходе развития зерна на 12-ый, 16-ый, 22-ой и 28-ой дни от опыления (линия кукурузы W22). Наиболее выраженные изменения найдены после 20-го дня. Авторы связали отсутствие большого класса мембраносвязанных полисом с отсутствием части компонентов зеина в зерне мутанта, выдвинув предположение, что ген опак-2 сникает содержание мРНК зеина ( Jones R.A. et al. , ЮТ ).

Аналогичное исследование на эндосперме линии кукурузы ^w 64А показало, что на 21-ый день после опыления профили седи- ментации мембраносвязанных полисом обычной и мутантной кукурузы были сходны, в то время как синтез зеина на этой стадии в мутанте значительно редуцирован: около 60$ от нормы. Исчезновение крупного класса мембраносвязанных полисом было найдено в этом исследовании на 35-ый день от опыления. Авторы предполагают, что ген опак-2 вызывает количественные и/или качественные изменения в популяции мРНК эндосперма ( Viotti A. et ai. , 1975).

Аминокислотный состав зерна и белковых фракций. Сумма свободных аминокислот у мутантной кукурузы сохраняется на высоком уровне в течение всего периода развития зерновки. По мере созревания количество свободных аминокислот снижается. Однако убывание аминокислот у опак-2 кукурузы идет медленнее, чем у обычной кукурузы. Например, от 20-го к 50-му дню в эндосперме нормальной кукурузы сумма свободных аминокислот снижается с 0,93$ до 0,08$, т.е. более, чем в 10 раз, а у опак-2 с 1,49$ до 0,78$ - всего лишь в два раза. По отдельным аминокислотам особенно высокое содержание у опак-2 аспарагиновой кислоты, аспарагина, глютаминовой кислоты, аланина, лейцина, лизина, тирозина, пролина ( nelson о.е. et al. , 1965; Пашкарь СИ. и др., 1978).

По мере созревания зерна в альбуминах уменьшается содержание лизина, аргинина, тирозина, гистидина, но увеличивается количество глютащноЕОй кислоты. Б глобулинах увеличивается содержание глютаминовой и аспарагиновой кислот, и уменьшается содержание лизина, гистидина и аргинина. Глютелины обогащаются триптофаном, лизином, цистином, лейцином, фенилаланином (Конарег В.Г. и др., 1963).

Альбумины опак-2 эндосперма содержат больше триптофана, но меньше валина ( Сопсоп м. _f 1966; Плешков Б.П. и др., 1975), глобулины больше содержат лизина, гистидина, аргинина и глипина ( Misra P.S. et ai., 1976; Рядчиков В.Г., 1978), а глютелинн богаче лизином, аргинином, аспарагиновой кислотой, но содержат меньше пролина, глютавдновой кислоты и лейцина (Плешков Б.П. и др., 1975; Лебедев А.В. и др., 1976).

Белки нерастворимого остатка, или склеропротеиды, в основном, сосредоточены в периферических слоях зерна и весьма прочно связаны с лигнино-полисахаридными комплексами. Кроме того, сюда входят нуклеопротеиды, не извлекаемые теми растворителями, которые используются для экстрагирования осборновских классов белков.

Опак-2 эндосперм;, содержит больше склеропротеидов; они обогащены лизином, гистидином, тирозином, но меньше содержат глюта-миновой кислоты, лейцина и фенилаланина (Рядчиков В.Г., 1978; Мунк Л., 1981).

Аминокислотный состав зародыша не протерпевает сколько-нибудь существенных изменений, однако масса зародыша выше в опак-2 зерновке, а следовательно, выше доля белков зародыша, которые являются биологически наиболее полноценными: имеют высокий процент лизина и триптофана. Таким образом, за счет зародыша происходит накопление дополнительного количества лизина в зерне мутанта (Букреева Г.И., 1983).

В результате вышеописанных изменений в соотношении синтеза и накопления белков различных фракций и некоторого изменения их состава по аминокислотам количество лизина в суммарном белке зерна мутантной кукурузы возрастает в 1,5-1,8 раза, значительно повышается содержание триптофана, аргинина, аспарагиновой кислоты и глицина. В то же время снижается количество глютаминовой кислоты, пролина, лейцина, тирозина и серина в сравнении с их содержанием в белке обычной кукурузы. - 24 -I.3, Матричные РНК, процессинг и гены проламинов

Установление места локализации синтеза и депонирования зеина в эндосперме кукурузы позволило в конечном итоге выделить в чистом виде зеиновую мРНК ( barkins В.A. et al. , 1976; Burr В. et al., 1978; Melcher U. , 1979).

Исследования мїїїК показали, что ее молекулярная масса близка к 365 000 (I3s ) и она кодирует обе молекули зеина, молекулярная масса которых равна 21 800 и 19 000. Это значит, что мРНК зеина состоит из двух мРНК ( barkins В.А. et al. , 1976; Burr В. et al. , 1978).

Установлено, что синтез зеина in vitro чувствителен к присутствию 7-метилгуанозин-5-монофосфату, который является специфи-ческим ингибитором мНЖ, имеющих ^икеп" на 5-конце. Исходя из этого, предполагают, что зеиновые мШК, подобно другим эукариотичес-ким мРНК, имеют "кеп"-структуру на 5-конце ( Burr В. et al. ,1978)..

В бесклеточной системе синтеза белка мРНК зеина кодирует синтез полипептидов, молекулярная масса которых на 1100 я 2000 дальтон больше, чем молекулярная масса субъединяц натлвного зеина (Burr В. et al. , IS78; Larkins В.А., Hurkman W.G. , 1978). Добавление нативного шероховатого эндоплазматического ретикулума к белоксинтезирующей системе приводит к образованию белков, соответствующих по молекулярным массам субъединицам нативного зеина (barkins В.А., Hurkman w.G. , 1978). Аналогичные данные были получены при исследовании мЭДК гордеина ячменя ( Brandt A., ingver-sen G,,I978) и запасных белков бобовых ( Beachy R. , 1982).

Эти факты свидетельствуют о том, что запасные белки растений синтезируются в виде предшественников, имеющих на N-конце дополнительную последовательность аминокислот. Следовательно, они тран- спортируготся в белковые тела по той же схеме, что и секреторные белки животных, т.е. согласно ^мсигнальной" гипотезе ( Biobel G., Dobberstein в. , IS75), объясняющей топографическую специфичность синтеза секреторных белков и механизм их векториального трансмембранного переноса в ходе синтеза.

Гипотеза постулирует сигнальные функции короткоживущего її -концевого фрагмента синтезируемого продукта во взаимодействии рибосом с мембранами цитоплазматической сети. При этом трансляция мИЖ секреторных белков начинается на свободных рибосомах, но н -конец растущей цепи по мере роста приобретает гидрофобные свойства и связывается с белками-рецепторами в составе мембран. В результате такого рода взаимодействия в мембране формируется канал, через который сигнальный пептид и ковалентно связанная с ним растущая цепь проникает через мембрану в пространство цистерн цитоплазматической сети. После этого происходит реакция ограниченного протеоляза, в результате которой сигнальный пептид отщепляется от растущей цепи. Эта реакция катализируется пептида-зой (сигналазой) - компонентом микросомной мембраны, прячем во времени она предшествует окончанию трансляции и полному высвобождению продукта во внутримембранное пространство (рис.1.1).

Введение мИЖ зеина в яйца Xenopus laevis приводило к формированию в них образований типа белковых тел кукурзгзы, наполненных зеином. Электронная микроскопия показала, что эти образования морфологически сходны с белковыми телами, а двумерный электрофорез (изоэлектрическое фокусирование/ДЦС полиакриламидный гель) зеина из белковых тел эндосперма кукурузы и яиц лягушки показал идентичность их полипептидного состава. Этот эксперимент показал, что мНЖ зеина содержит информацию о компартментализации зеиновых белков в клетке.

ЯДРО КЛЕТКИ ^{лнк клеточного здра} тпрстсісрцпщц* ш-РНК ом-РНК р-Ьнк

ЦИТОПЛАЗМА _{риБошмньи 5еяки} оБраьоКаиие рибосом, актибиройачие лиембраносВзаанные тюлисшчы анинокислат

ЭНДОПЛАЗМ. СИГНАЛЬНІ

РЕТИКУЛУМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

ЗАПАСНОЙ Ъг-'БЕЛОК

ОСНОВНОЙ БЕЛОК

Рис. І.І. Гипотетическая схема биосинтеза и процессинга запасного белка по Muntz К. , 1978, Freedman R., 1979.

Зеин синтезируется в эндосперме ориентировочно с 20~го по 50-ый день от опыления, при этом очень интенсивно: 320 мкг в день, что эквивалентно 100 нг на клетку в час, или 5 х 10' молекул на клетку в минуту. Эксперименты показали, что в этом процессе значительную роль играет то, что мЕНК зеина является очень эффективной матрицей и преимущественно инициирует рибосомы в присутствии мРНК других белков. Это, вероятно, может играть большую роль в регуляции синтеза белка ( Larkins В.А. et ai., 1982).

Кроме того, зеин в некоторой степени синтезируется и свободными полирибосомами, что доказывает возможность существования мЕНК зеина в составе свободных полисом или свободных рябонуклео-протеидных частиц. В таком случае связывание свободных полирибосом зеина с мембранами эндоплазматического ретикулума посредством сигнальной последовательности пептидов может также играть значительную роль в регуляции синтеза запасного белка ( Jrones Е.А. et al., 1977 а, Ъ ).

Большой интерес представляет информация о содержании мЕНК запасного белка в эндосперме нормальных и высоколизяновых форм злаков. A.Brandt, G.ingversen (1978) показали, что содержание гордеиновой мЕНК в высоколизиновом мутанте ячменя Рязо 1508 оказалось таким же, как и у исходной линии ячменя Боми, в то время как сянтез гордеина в мутанте значительно снижен. Однако матричная активность мРНК из мутанта в системе in vitro значительно ниже, и трансляция происходит только в один полипептид предшественника гордеина. K.Pedersen с соавторами (1980) также нашли, что мЕНК зеина в системе in vitro транслируется только в один полипептид с молекулярной массой 19 000, если эта мРНК из эндосперма мутанта.

Однако на оснований данных по использованию в качестве матрицы в бесклеточной белоксннтезирующей системе гибрида ЗЄЙН0В0Й мРНК нормального эндосперма и комплементарной ей ДНК (кДНК), полученной обратной транскрипцией зєйновой мРНК мутанта, предполагают, что в эндосперме опак-2 содержатся меньше мРНК для презеина с молекулярной массой 22 000. P.bangridge и др. (1982 а,Ъ ) показали с помощью методов гибридизации РНК/ДНК, что существует строгая корреляция между количеством зеиновых мРНК и количеством зеиновых белков в эндосперме нормальной и опак-2 кукурузы. В то же время нашли, что в мутантном эндосперме уменьшено количество зеиновой мЗДК для белка 22 000.

Возможность выделения проламиновых мРНК позволила в последние годы вплотную подойти к изучению организации генов этих полипептидов. К настоящему времени выявлена структура лишь немногих генов эукариот. В основном, это те гены, последовательности которых или продукты транскрипции (РНК) легко могут быть выделены. В этом отношений гены проламинов представляют несомненный интерес. Для исследования генов проламинов используется кДНК, полученная посредством обратной транскрипции мРНК соответствующих генов. Меченые кДНК далее применяются для определения числа копий гена методом гибридизации и выявления их локализации на хромосомах ( Viotti A. et al. , 1979, 1980; Pedersen К.etal,, 1980,1981).

Для этих же целей ведутся работы по получению больших количеств индивидуальных ДНК проламинов методами генетической инжене-* рии - присоединяя их к бактериальным плазмидам и клонируя культуру бактерий ( Burr В., Burr F.A., 1978, 1982; Brandt А. , 1979; Porde B.G. et al. , 1981 а, Ь ; Levis E. et al., I98I;Wienand U., et al. , 1978, 1279, 1981; Pinter T. Langridge P. et al. Д982; Pintor-Шого. G.A. et al. , 1982).

В результате на сегодняшний день эти методы позволили показать, что в геноме кукурузы существует обширное семейство зеино-ВЫХ генов ( Burr В. , 1979; Viotti A. et al. , 1979; Hagen G., Rubenstein I. , 1981). В то же время не найдено различий по организации генов зеина в эндосперме нормальной и опак-2 кукурузы ( Langridge P. et al. , 1982 а,Ъ ).

Кроме того, возможность получения комплементарной ДНК зеина и определения последовательности ее нуклеотидов позволили определить первичную структуру зеина ( Geraghty D. et al. , 1981).

1.4. Влияние гена опак-2 на содержание нуклеиновых кислот в эндосперме кукурузы

Для познания механизма действия гена опак-2 несомненный интерес представляет информация о содержании нуклеиновых кислот в эндосперме нормальной и мутантной форм кукурузы, так как биосинтез белка связан с нуклеиновым обменом, и действие гена опак-2 осуществляется прежде всего через нуклеиновый обмен.

Однако по этому вопросу в литературе существуют довольно противоречивые мнения. По данным A.Viotti с сотрудниками (1975) в процессе развития эндосперма не было найдено различий в содержании РНК и ДНК в сравниваемых формах. В то же время ряд авторов сообщают о более высоком уровне содержания РНК в эндосперме мутанта (Лукьяненко Л.М., Дмитриева А.Н., 1974, 1976; Домашнев П.П. и др., 1978, 1981; Пыльнева П.Н., 1978).

Кроме того, по данным одних авторов (Mehta s.L. et al.,I972) нуклеиновые кислоты исчезают из эндосперма на 31-й день от опыления, по данным других (Домашнев П.П., 1981) они обнаруживаются вплоть до 50-го дня. - зо -

По-видимому, эти различия могут быть следствием особенностей методов определения или специфики климатических условий.

Известно, что основную массу РНК клетки представляют рибо-сомная (рРНК) и транспортная РНК (тРНК). По вопросу содержания pFHK в эндосперме нормальной и опак-2 кукурузы в литературе имеются также противоречивые данные. е.а.Jones с сотрудниками (1976, 1977) нашли, что рРНК содержится в нормальном эндосперме почти на 25$ больше, чем в мутантном. Особенно сильные различия были обнаружены в содержании мембраносвязанной рРНК. Это исследование проведено на эндосперме линии w 22 на 22-ой день от опыления. A.viotti и др. (1275) на том же этапе созревания у линии w 64А не нашли существенных различий в содержании рРНК. Однако подобные различия отмечены на 35-ый день.

Разница в найденных фактах, вероятно, объясняется свойствами генотипов линий кукурузы, взятых в этих исследованиях, и особенностями климатических условий ее произрастания. A.Brandt, G.lngversen (1978), изучая гомологичную опак-2 мутацию ячменя Ризо 1508, нашли, что содержание суммарной РНК в эндосперме мутанта выше в 2 раза по сравнению с ее уровнем в линии ячменя Боми на 20-й день от опыления. В то же время они показали, что в сравниваемых формах ячменя содержится равное количество рРНК, а количество рРНК мембраносвязанных полирибосом в мутанте снижено.

По А.Долби с сотрудниками (1977) у опак-2 в сравнении с нормальной кукурузой содержалось на 34$ больше тРНК на один эндосперм (15-ый день от опыления). A.viotti и др. (1975) также отметили более высокий процент тРНК в эндосперме опак-2 кукурузы. Обе работы были выполнены на эндосперме кукурузы линии W 64А. - ЗІ -

1.5. Активность рибонуклеази в эндосперме кукурузы опак-2

Характерной чертой обмена веществ эндосперма кукурузы опак-2 является повышенная активность фермента рибонуклеази (Daiby А., Davies G. , 1967; Wilson СМ., Alexander D.E., 1967; Henta S.L. et al. , 1972; Misra S., Oaks A. ,1981; Дыльнева П.Н„ 1972, 1978; Лукьяненко Л.М., Дмитриева A.H., IS74, 1976).

Рибонуклеаза играет регулярную роль в синтезе белка благодаря своему участию в обмене рибонуклеиновых кислот. Изменение физиологических функций у растений тесным образом связано с изменением ультраструктуры протоплазмы, состояние которой зависит от синтеза белка, регулируемого при участии нуклеиновых кислот. Поскольку гидролизующее действие РНК-азы направлено на разрушение РНК, то становится понятным, насколько важен для всей белоксинте-зирующей системы уровень активности всего фермента в растений.

РНК-аза является фосфоэотеразой, гидролизующей все известные РНК. Расщепление межнуклеотидных связей в РНК под влиянием фермента включает в себя два этапа: внутримолекулярное перефосфориляро-вание и последующий гидролиз.

К нуклеазам относится большое число довольно разнообразных по структуре и характеру действия ферментов. Еще недавно нуклеа-зы делили на два неравновеликих класса: РНК-азы-фосфотрансферазы К.Ф.2.7.7.Х. и нуклеазы-гидролазы К.Ф.З.І.4.Х. Согласно современной международной классификации все нуклеазы объединены в одну группу К.Ф.З.І.4.Х., в пределах которой различным нуклеазам присвоены различные значения X (Татарская Р.И., 1976).

По субстратной специфичности РЖ-азы могут быть разделены на специфические, к которым относятся пиримидил-РНКазы и гуанил-РНК-азы, и неспецифические РНК-азы.

Растительные РНК-азы, относящиеся к неспецифическим РНК-азам, обнаружены во всех исследовавшихся растительных объектах. Они являются неотъемлемыми компонентами растительных клеток. Растительные РНК-азы осуществляют разрушение всех межнуклеотид-ных связей в РНК через внутримолекулярное трансфорилирование с образованием 2,3-циклофосфатов, однако на следующем этапе, в начальной стадии, они гидролизуют предпочтительно связи, образованные гуанозйном. РНК-азы различаются по способности гядролизовать пиримидин 2,3-циклофосфаты, и на основании этого различия они делятся на две группы, соответственно РНК-азу I и РНК-азу П. На стадии гидролиза нуклеотид-2,3-циклофосфатов РНК-аза I действует с образованием адениловой и гуаниловой кислот, но не гидролязует связи в пиримидин-2,3-циклофосфатах. РНК-аза П освобождает все четыре монофосфата (Творус Е.К., 1976).

У РНК-азы высших растений обнаружено наличие четвертичной структуры (Блехман Г.И., 1983).

Активность рибонуклеази возрастает в процессе созревания эндосперма злаков, в том числе и кукурузы ( Wilson см. , 1973,1975, 1982). Одновременно в эндосперме возрастает содержание белка, крахмала и РНК.

Признак РНК-азной активности с биохимической и генетической стороны наиболее подробно исследован на созревающем эндосперме кукурузы американским исследователем C.M.Wilson . Он показал, что рибонуклеаза в эндосперме кукурузы представлена РНК-азой I /К.Ф.З.І.27.ІЛК.Ф.З.І.4.23.)/. Активность РНК-азы в нормальном эндосперме (линия w 64А) возрастает по экспоненциальной кривой между 16-ым и 28-ым днями от опыления и достигает максимума на 40-ой день, в то же время в эндосперме опак-2 активность этого фермента возрастает в абсолютном количестве гораздо быстрее на всех стадиях развития. Однако по данным гель-электрофореза РЖ-аза из нормального и мутантного эндосперма не имеет различий (Wilson СМ. ,1968,1571).

С.M.Wilson(1980) показал начилие широкой вариабельности в активности РНК-азы эндоспермов различных линий кукурузы. Так, линия и 28 имеет только 285 ед/г, а линия Oh 43 - 1305 ед/г. Отношение между уровнями активности опак-2 и нормального эндосперма от 1,9 до 5,2. При этом не наблюдается строгой прямой зависимости РНК-азной активностя между обычными линиями и их высоколи-зиновыми аналогами.

Гибриды, полученные от скрещивания обычных и мутантних линий, в ?2 Давали расщепление 3:1 (низкий уровень РНК-азы : высокий уровень РНК-азы). Таким образом, ген низкой РНК-азной активности является доминантным по отношению к гену высокой активности, как это и имеет место в проявлении гена опак-2.

Гибриды, полученные от скрещивания инбредных линий кукурузы с высоким и низким уровнями РНК-азы, в большинстве случаев имели в ?j промежуточный уровень активности РНК-азы по сравнению с родительскими линиями. В ?2'происходило расщепление.

Исследование динамики рибонуклеазной активности в ходе развития эндосперма разных линий кукурузы и дх гибридов на протяжении нескольких лет показывает, что существует генетический контроль не только за уровнем РНК-азы, но также за временем синтеза фермента и за его стабильностью в созревающем эндосперме ( Wilson см., 1980).

Процесс развития и созревания эндосперма кукурузы сопровождается изменением активности РНК-азы в различных его частях. Так, на ранних этапах развития эндосперма (18-ый день от опыления) РНК-азная активность в 4-15 раз выше в верхушечной части, чем в основании эндосперма. Срединная часть занимает по активности РНК-азы промежуточное положение.

К 35-му дню происходит заметное перераспределение активности: максимум присущ срединной части, а к 50-эду дню максимальная активность смещается к основанию эндосперма. По мнению СМ..Wilson (1980) это перераспределение РНК-азной активности в частях эндосперма, вероятно, связано с тем, что Hffi-аза осуществляет контроль дифференциации клеток эндосперма и таким образом контролирует начало синтеза крахмала и зеина. Эндосперм кукурузы опак-2 имеет более ровное распределение РНК-азной активности по частям эндосперма. Так, нормальная линия Oh43 имеет в верхушечной части эндосперма на 18-ый день от опыления 700 ед/г активности, а в основании - 44 ед/г. Высоколизиновый аналог - 834 и 132 соответственно. На 50-ый день первая имеет 383 и 239, а вторая -3837 и 3754.

Высоколизиновый мутант ячменя Ризо 1508 имеет также повышенную рибонуклеазную активность ( Miflin B.J., Shewry P.R. ,1978).

Высоколизиновый мутант сорго имеет повышенную активность РНК-азы при пересчете на одно зерно ( Johari е.p. et al. , 1981).

1.6. Некоторые гипотезы о молекулярном механизме действия гена опак-2

По выражению Ф.Энгельса, гипотеза - форма развития естествознания (Ф.Энгельс, 1948). Общепризнано, что наличие даже неверной рабочей гипотезы лучше отсутствия таковой, так как на основе гипотезы можно строить количественные выводы и сопоставлять их с данными опыта. Тогда неверная рабочая гипотеза будет скоро .отвергнута, не принеся существенного вреда, польза же ее - опровержение неверного предположения и стимулирование дальнейших исследований (Любищев А.А., 1982).

По вопросу действия гена опак-2 не существует пока общепризнанных гипотез. Однако попытки создания таковых имели место. Приведем некоторые из них.

1. K.Konstantinov и др. (1978, 1979, 1981) на оснований результатов экспериментов по использованию хроматина из эндоспер ма обычной кукурузы и из эндосперма ее высоколизинового аналога в качестве матрицы для синтеза РНК в системе in vitro считают, что мРНК мутантного эндосперма по нуклеотидному составу отличается большим содержанием АМФ, в то время как мРНК нормального включает в свой состав больше УМФ. Эти различия по включению пуринових и пиримидиновых оснований в синтезирующуюся РНК согласуются со спецификой аминокислотного состава белков соответствующих эндоспермов. Авторы предполагают, что действие гена опак-2 проявляется на уровне транскрипции. Но результаты этих экспериментов не могут быть истолкованы однозначно.

2. А.А.Кутовой и Н.С.Агафонов (1975) также на основании того, что ген опак-2 вызывает увеличение содержания в эндосперме тех аминокислот, которые в составе своих кодонов имеют нуклеотиды с пуриновыми основаниями, и снижение - с пиримидиновыми основания ми, предположили, что действие гипотетических репрессоров, выра батываемых геном-регулятором опак-2, направлено на мИЗК-связываю- шую активность. Последняя зависит от нуклеотидного состава мРНК и под действием репрессоров стимулирует синтез белка на "пуринових" матрицах и ингибирует на "пиримидиновых". Однако эта гипотеза не имеет никаких прямых экспериментальных доказательств.

3. При обнаружении повышенного уровня рибонуклеази в эндо сперме опак-2 А.Dalby д J.Davies (1967) И C.M.Y/ilscm д D.E. Alexander (1967) предположили, что РНК-аза могла бы быть ключе вым ферментом, деполимеризуя матричные РНК в мутантном эндоспер- ме быстрее, чем в обычном. Они считали, что наиболее простым объяснением действия гена опак-2 может быть то, что опак-2 ло-кус является регулятором синтеза рибонуклеазы. Заманчивость такой рола РНК-азы заключается в том, что последняя воздействует на такие вещества, которые непосредственно связаны с биосинтезом белка. Однако любая такая система не обладает избирательным действием и поэтому изменяет синтез всех белков. В этом авторы видели несоответствие истине (Долби А. и др., 1977).

Другой вариант гипотетической роли РНК-азы - избирательная деполимеризация специфических видов транспортной РНК. Wilson с.п. (1963, 1968) показал, что РНК-аза I эндосперма кукурузы обладает более выраженной специфичностью в отношении пуринов, чем пирими-динов. Таким образом, возможно предпочтительное разрушение участков антикодона тРНК, богатых пуринами, по сравнению с участками, обогащенными пиримидинами, что может привести к состоянию торможения, при котором происходит нарушение относительной скорости синтеза различных белков. Однако исследования в этом направлении не были доведены до конца, и вопрос остался открытым (Долби А. И др., 1977).

В то же время исследование динамики роста активности РНК-азы у девяти инбредных линий кукурузы с нормальным эндоспермом и геном опак-2 показало, что семь из них обнаружили раннее и быстрое повышение активности этого фермента в вариантах опак-2, но в двух остальных эта закономерность нарушалась. У линий А545 Я В37 различия в активности РНК-азы между нормальным и мутантним вариантами появлялись только на более поздней фазе развития и сохранялись затем до полного созревания. Это могло быть свидетельством того, что РНК-аза теряет свое положение потенциального ключевого фермента в действии гена опак-2, если бы линии А545 и

Б37 не оказались аномальными: они не имели однородный мучнистый эндосперм, что обычно связано с проявлением гена опак-2, а содержали в эндосперме роговидные участки. Изменение фенотипов этих линий объясняется присутствием генов-модификаторов. Поэтому вполне логично предположить, что те же гены-модификаторы ответственны и за изменения типа активности РНК-азы в период созревания ( Cagampang J.B., Dalby А. , 1972; Долби А., 1977).

Таким образом, нельзя отказаться от роли РНК-азы в изменении белкового и аминокислотного состава эндосперма. В 1978 году интересные данные о взаимосвязи синтеза зеина и активности РНК-азы были получены C.Y.Tsai с соавторами (1978) при скрещивании мутантов опак-2 и бриттл-2 линии кукурузы Од43. Мутация опак-2 снижает на 50% содержание зеина. Бриттл-2 также снижает синтез зеина. Гибрид опак-2 х бриттл-2 содержит только 5% зеина от уровня нормального аналога, РНК-азная активность в гибриде в 3 раза выше, чем в опак-2 и бриттл-2 мутантах, и в 7 раз выше, чем в нормальном эндосперме. При этом редукция синтеза зеина коррелирует с редукцией мембраносвязанннх полирибосом. Содержание же лизина возрастает с 1,5% в нормальном эндосперме до 3,5 в опак-2 и 5,3 в двойном мутанте опак-2 х бриттл-2.

Кроме того, R.A.Jones с сотрудниками (1977) показали, что в профиле седиментации мембраносвязанннх полирибосом из нормального эндосперма при его хранении в условиях минусовой температуры возникают изменения, аналогичные таковым в свежем эндосперме опак-2. Авторы предположили, что это может быть результатом возрастания активности РНК-азы в обычном эндосперме вследствие его дегидратации при хранении. R.p.Joharx с соавторами (1977), исследуя закономерности синтеза белка и нуклеиновых кислот в созревающем эндосперме куку- рузы и сорго, пришли к выводу, что изменение в соотношении синтеза и деградации мЕНК является важным фактором, определяющим качество белка эндосперма.

1.7. Заключение по аналитическому обзору

Исходя из анализа отечественной и зарубежной литературы, можно сделать следующие выводы:

Зерно кукурузы опак-2 является высокоценным источником растительного протеина в кормлении сельскохозяйственных животных.

Под действием гена опак-2 в эндосперме кукурузы происходит перераспределение белковых фракций: снижение содержания зеи-на и увеличение - альбуминов, глобулинов и глютелинов. Это изменение, наряду с более крупным зародышем в эндосперме опак-2 и более высоким содержанием свободного лизина, определяет повышенное содержание лизина и триптофана в мутантном эндосперме по сравнению с обычным.

Эндосперм кукурузы опак-2 имеет более высокий уровень содержания суммарной FHK по сравнению с обычным эндоспермом, но при этом равное или даже сниженное содержание рРНК и повышенное содержание транспортной РНК. Однако работ по изучению влияния гена опак-2 на содержание РНК разных фракций крайне мало, и потому нет полной ясности в причинах высокого уровня суммарной РНК в мутантном эндосперме. Изучение этого вопроса важно для познания природы действия гена опак-2.

Исследования изолированных полирибосом и матричных РНК, проводимые in vitro , проясняют некоторые детали синтеза запасных белков и природу высоколизиновых мутантов. Изучение молеку-лярно-биологических аспектов формирования запасных белков пред- полагает направленное получение мутантов, синтезирующих белки с сильно измененным аминокислотным составом, и является одним яз путей изучения генной регуляции у эукариот.

Однако действие гена опак-2 затрагивает не только синтез запасных белков. Он снижает урожай и ухудшает физические свойства эндосперма, что осложняет распространение и использование высоколизиновых сортов в будущем. В связи с этим представляется целесообразным более общий, комплексный подход к изучению молекулярного механизма действия гена опак-2 с целью определения реальных перспектив и целей в селекции кукурузы на качество белка с применением этого мутанта.

5. Ген опак-2 вызывает увеличение уровня РНК-азной активно сти в эндосперме кукурузы. РНК-аза является важным фактором ре гуляции биосинтеза белка в растительной клетке, однако ее роль в формировании "высоколизинового синдрома" в эндосперме кукурузы противоречива и не ясна. В этом отношении представляется важным дзучение особенности распределения ИЖ-азной активности по частям и тканям нормального эндосперма.

6. Существующие гипотезы о молекулярном механизме действия гена опак-2 или не имеют достаточного экспериментального обосно вания, или находятся в некотором противоречии, возможно кажущем ся, с общепринятыми теоретическими представлениями о регуляции синтеза белка. Представляется необходимой разработка с позипий современной молекулярной биологии гипотезы, непротиворечиво объясняющей плейотропное действие гена опак-2, и ее эксперимен тальное обоснование.

ЭКСПЕРЖШТАЛШЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТО.ВД ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования был эндосперм созревающего зерна кукурузы нормальной линии Висконсин 64А ( W64A+/+) и ее спонтанного мутанта опак-2 ( ^64Ао2/оз).

Эндосперм составляет до 80-90$ массы зерновки и определяет в основном питательную ценность зерна кукурузы. Эндосперм весьма удобен для биохимического анализа, так как он легко отделяется от зародыша и является относительно однородной тканью, к которой примешивается лишь тонкий наружный слой перикарпа.

Растения для исследований выращивали в поле яли в фитотроне. Сравниваемые формы находились в одинаковых условиях. В период появления метелок на початки надевали изоляторы. Опыляли смесью пыльцы, собранной с метелок данной формы. Початки снимали с растения в определенные сроки - на 10-ый, 15-ый, 20-ый, 30-ый или 40-ой день от опыления, немедленно замораживали в жидком азоте. В замороженном состоянии зерна снимали со стержня початка, и эндосперм отделяли от зародыша. Хранили эндосперм при температуре -20С и использовали в течение 4-5 месяцев.

Методики выделения и количественного определения нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты выделяли из эндосперма по методу Шаймоши в модификации Детчона и Поссингема (цит. по Селиванкина СЮ. и др., 1976). Содержание РНК и ДНК в выделенном препарате, а также в сахарозных экстрактах из эндосперма определяли по методу Блобеля и Поттера ( В1оЪе1 G., Potter V.R., 1967). Кроме того, содержание нуклеиновых кислот в эндоспермальной ткани определяли после отмывки кислоторастворимых веществ и фракционирования РНК и ДНК по методу ІШщдта и Тангаузера в модификации Флека

Я Монро (цат. по Збарский И.Б., Дебов С.С., 1968): РНК - после щелочного гидролиза - а) спектрофотометрически, б) орциновой реакцией по Мейбаум (цат. по Конарев В.Г., Тютерев С.Л., 1970); ДНК - после кислотного гидролиза определяли реакцией по Дише в модификации Бартона (цит. по Збарский И.Б., Дебов С.С, 1968).

Определение содержания рРНК в препаратах полирибосом и тРНК в постполирибосомальной жидкости проводили по рекомендации М.Г.Трудолюбовой (1977). Очищение ГНК полирибосом, полученных методом дифференциального центрифугирования, осуществляли фе-нольно-детергентным способом, как описано Е.В.Любимовой и О.В. Подобед (1977).

Методики выделения рибонуклеопротеидов (РНП). I. Ультрацен-трифугирование. Как показали E.Daviesn др. (1972), высокие концентрации солей и высокое значение рй экстрагирующего буферного раствора ингибируют деятельность внутриклеточных растительных РНК-аз. Помимо этого, T.C.Hsiao (1970) отмечает, что высокое значение рН предотвращает агрегацию эндогенных РНК-аз с рибосомами. С учетом этих моментов разработана методика выделения полирибосом ИЗ семядолей бобовых И ЭНДОСПерма злаков ( Larkins в.А., DaviesE. , 1975; Larkias В*А. et аі., 1976), которую применяли в следующей модификации (рис.2.1): эндосперм, замороженный в жидком азоте, разрушали на лабораторной мельнице и экстрагировали буфером А (0,2 М трис-HCl , рН 8,5; 0,25 М сахароза; 0,05 М MgC^; 0,06 М КС1 ; 0,005 М дитиотрейтол). Гомогенат фильтровали и центрифугировали при 500 s 5 минут для осаждения ядер и крахмала. Надосадочную жидкость (I) центрифугировали пря 40 000 є 10 минут. Осадок, содержащий в основном белковые тела (рис.2.2), суспендировали в буфере А, имеющем в своем составе 1% Тритона X-IQQ, и центрифугировали при тех же условиях.: Полученную над- ^{ЭКСТРАКТ ИЗ ЭНДОСПЕРМА}

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ 500^ 5"Ші

otft^ofe Коса дал u оинаїнка оо»рии«ннм. ІЩНТРИФУГИМВАНИЕ AOOOO^Ojuttc центрифугирование 8ОООО3 ^Ojuuh центрифугироьаниб 4050004-,2^ осадок tuuiKgu^an I p.tuu^Mt^u^ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ «с-to центрифугирование ЮБООО^гсА кааоса^оінааґ^миаАосіїїь

ЪТ v?P3P taaoc: noAupvxSowHw., OCAqo<'. MHO^O^KOUhkV

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ 4050004,2

Ряс.2.1. Схема выделеняя рябонуклеопротеядов яз эвдосперма кукурузы методом дяфференцяального центряфугярованяя осадочную жидкость (2) центрифугировали 2 часа при 105 000 є для осаждения полирибосом, отделенных от мембран белковых тел и сопутствующей им фракции эндоплазматического ретикулума. Надоса-дочную жидкость (I) после осаждения белковых тел центрифугировали при 80 000 g 40 минут для осаждения микросом (рис.2.3) и затем при 105 000 g 2 часа для осаждения свободных полисом. Пост-полисомальную надосадочную жидкость центрифугировали 4 часа'при 105 000 g для осаждения информосом (Филимонов Н.Г., 1978).

Аналитическое фракционирование полисом в градиенте плотности сахарозы показало, что условия выделения методом ультрацентрифугирования позволяют выделить большее количество тяжелых полисом по сравнению с методом Мg "^преципитации (рис.2.6). Однако последний позволяет быстро и-при относительно низких скоростях центрифугирования получить всю сумму РНП цитоплазмы клетки.

Выделение РНП методом Мб ⁺-дреципитации. В основе этого метода лежит открытое Таканами (цит. по Питерман М., І9Б7) свойство рибосом препипитировать из раствора под воздействием высоких концентраций ионов магния. Механизм этого явления неизвестен.

Метод позволяет в сравнительно короткий срок переработать большое количество исходного материала, исключая высокие скорости центрифугирования. В этом случае полирибосомы загрязняются белковыми примесями и подвергаются частичной деградации рибону-клеазой, но по своим физико-химическим свойствам и биологической активности практически не отличаются от полирибосом, полученных при помощи ультрацентрифугировании в угловом роторе (Лейтин В.Л., ЛерманМ.И., 1969; Grancharova T.V., Getova Т.А., 1976). Кроме того, метод позволяет получить в осадке не только полирибосомы, но и монорибосомы, рибосомные субъединицы и янформосомы ( LiCh-tenstein A.v. et ai. , 1975; Лихтенштейн A.B., 1976).

Рис.2.2. Электронная микрофотография: осадок белковых тел, полученный центрифугированием сахарозного экстракта из эндосперма кукурузы при 40 000 g 10 минут (фото Филичкина С.А.)

Рдс.2.3. Электронная микрофотография: осадок микросом, полученный центрифугированием сахарозного экстракта из эндосперма кукурузы после осааде ния белковых тел при 80 000g 40 минут. ЖС - шкросомы, Ш - фрагменты мембран (фото Фйличкина С.А.) сі^пернатакт tvocjie 40000 з І ОИМЛІд^-іш 350005 осадок,:

С$0$. OMOOCOMbL v- тритон СЫ00

1часЬ5000|

Ряс. 2.4. Схема выделения рабонуклеошротеидов из эндосперма кукурузы методам М_в+±црецяпи-тации _{ол о r}M_sct,(M)

Рис.2.5. Влияние концентрации ионов M_g⁺⁺ на осаждение рибонуклеопротеидов эндосперма кукурузы при рй 8,5 верх дно

Рис.2.6. Седиментаїщонннй анализ полирибосом эндосперма кукурузы в градиенте концентрации сахарозы (20-ый день от опыления) А - экстрагирующий буфер А (+/+ и о₂/о₂ ямеют одинаковые спектры), Б - экстрагирующий буфер Б (+/+). Условия фракционирования: 0,2 мл надосадочной жидкости после 500 g центрифугирования наслаивали на градиент сахарозы (0,5-1,5 М), приготовленного на буфере, содержащем 0,01 М трис-ЇЇСІ, рй 7,5; 0,25 М КС1, 0,05 Mg&₂ и центрифугировали 3 часа при 280 OOQg . Анализ градиента проводили при помощи прибора "Увикорд" при 254 нм.

В работе использовали следующую модификацию метода: разрушенный эндосперм экстрагировали буфером Б (0,025 М трис-НСі , рН 8,5; 0,25 М сахароза; 0,005 М MgCl₂; 0,06 М КС1 ; 0,005 М дитиотрейтол). После фильтрования и центрифугирования при 500 s, как описано выше, в экстракт добавляли Mg&2 до конечной концентрации 0,1 М и выдерживали I час при 0С. Центрифугировали I час при 35 000 g для осаждения свободных ИЇЇІ. К надосадочной жидкости добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% и выдерживали I час при ОС. Центрифугировали I час при 35 000 g для осаждения ИЇЇІ, отделенных от мембран микросом. Полирибосомы с белковых тел получали, как описано выше, но в буфере Б.

Таким образом, поскольку осаждение ЕНП проводили при относительно низкой скорости центрифугирования, было возможно осадить сначала свободные ИШ, а затем и Hffl, связанные с мембранами щкросом, чем достигалось более четкое отделение микросом от свободных ИЇЇІ (рис.2.4).

Поскольку концентрация ионов магния, необходимая для полного осаждения рибосом, зависит от значения рН и ионной силы раствора, было проведено исследование по выявлению оптимальной концентрации ионов магния для значения рН 8,5; при котором минимальна активность рибонуклеаз эндосперма и предотвращается их агрегация с полирибосомами. Результаты исследования представлены на рис.2.6.

Концентрация ионов магния вплоть до 0,5 М эффективно осаждает рибосомы. По спектрофотометрическим характеристикам рибосом оптимальной является концентрация ОД М, при которой рибосомы имели: -Ц = 1»63; |щ = 1»50; что ниже, чем аналогичный показатель для чистых рибосом. Однако это близко к показателям, полученным T.V.Grancharova, T.A.Getova (1976) ДЛЯ рибосом ИЗ корней проростков пшеницы, полученных методом М є -преципитации, что соответствует 40$ РНК и 60$ белка. Это характерно для препаратов растительных рибосом.

Сходное осаждение наблюдалось и при концентрации выше 0,3

М , но спектрофотометрические характеристики рибосом были хуже:

260 _ т р. 260 _ т о 235 ~ ^х»^». 2Ш ~ ^L***

Закономерность, выраженная кривой, описывающей влияние ионов магния на преципитацию рибосом (рис.2.5), имеет место и при осаждении рибосом из других объектов. Так, очень сходная кривая получена R.D.Palmiter(ig74) при Mg^-преципитации рибосом из яйцевода цыпленка. Характерно снижение преципитации при концентрациях ионов магния выше 0,1 М и восстановление ее после 0,3 М. T.V.Grancharova, T.A.Getova (1976) также отмечают снижение преципитации рибосом, но при достижении 0,1 М концентрации, при рН 7,5.

Фракционирование РНК на поли-У-сефарозе. Известно, что часть мРНК клеток эукариот, в том числе и кукурузы ( van ае wai- le C.et al.,1974), отличаются от других РНК тем, что содержат относительно длинные участки остатков адениловой кислоты (от 50

,--'.-. до 200 нуклеотидов), ковалентно связанные с 3-концами молекул. Методы извлечения поли-А-содержащей РНК основаны на избирательной сорбции их с комплементарными нуклеотидами ( политимидином и полиуриданом), прочно связанными ковалентними связями с инертным носителем ( bindberg V., Persson Т. ,1972).

Выделение поли-А-содержащей РБК из РНП с использованием по-ли-У-сефарозы 4В ( Farmacia Fine Chemicals Швеция) проводили в термостатированной колонке. Поли-У-сефарозу промывали раствором Б (0,05 М трис-НСі , рН 7,5; 0,7Е ITaCl ; 0,01 М ЭДТА-Иа_а). РНП растворяли в буфере В, содержащем 0,5$ ДЦС-жа, так, чтобы конеч- ная концентрация РНП была 1-2 мг/мл, и наносили на колонку со скоростью 60 мл/час. Колонку отмывали от несвязавшегося материала буфером В, разбавленным вдвое. Поли-А-содержащуто мРНК элюи-ровали с колонки бидистиллированной водой при 50С. Ступенчатую температурную элюцию осуществляли при 20 и 50С раствором Г (0,01 М трис-НСі , рН7,5; 0,2$ ДЦС-Na). Для перевода величины оптической плотности при 260 нм в милиграммы РНК использовали значение Е^м 260^¹² (Трудолюбова М.Г., 1977). Эта процедура позволяет получить функционально активную мРНК и в то же время освобождает от многих проблем, связанных с фенольной экстракпи-ей ( Larkins В.А. et al. , 1276).

Контрольные эксперименты показали, что предварительная фе-нольно-детергентная депротеинизагщя полирибосом не изменяла количественного выхода поли-А-содержащей РНК, что согласуется с литературными данными (Подобед О.В., 1974).

После первого цикла хроматографии на поли-У-сефарозе сорбировалось около 6% полйсомальной РНК. Кроме того, от всего материала, элюируемого с колонки, препарат содержал 10$ примесей не нуклеиновой природы (не поддающихся перевариванию панкреатической РНК-азой). Второй цикл хроматографии позволял эффективно освободиться от примесей. Выход поли-А-содержащей мРНК составлял 1,5% от полйсомальной РНК. Полученный препарат давал характерное для мРНК гетеродисперсное равномерное распределение при электрофорезе в 1,5$ агарозном геле (рис.2.7) и в 2% полиакриламидном геле (рис.2.8) в денатурирующих условиях. При хроматографии на колонке МАК (метилированный альбумин-кизельгур) в солевом градиенте поли-А-содержащая РНК выходила в области высокомолекулярной РНК (рис.2.9), что согласуется в литературными данными ( Nitta т., et al. , 1276, 1277). _{ктж: ш>ш%}

_?*ты

Рис.2.7. Схема результатов электрофореза различных видов РНК в 1,5^-ном агарозном геле

Электрофорез проводили в денатурирующих условиях (6 М мочевина) пря комнатной температуре в течение ночи, 120 в. Гель отмывали от мочевины IМ ацетатом аммония и погружали на 5 минут в 1#-ный раствор этя-диум бромида. Затем гель помещали на хемиекоп и регистрировали флуоресценцию РНК в ультрафиолете. а - поли-А^РШС эндосперма кукурузы, б - поли-А-РБК (проскок колонки поли-У-свфарозы) эндосперма кукурузы, в .- рябосомная РНК E.coli , г - поли-А-РНК печени крысы. A 265 '^St~

Рис.2.8. Денсдтограмма электрофоретичеекого фракционирования поли-А-содержащей мШК из созревающего эндосперма кукурузы в 2% полиакриламидном геле (0,6$ агарозн). Электрофорез проводила в денатурирующих условиях (6 Ш мочевина) в трубочках (длина геля II см), 6 млА/гёль; 3,5 часа при комнатной температуре. Подробные условия электрофореза изложены С.Манделес.(1275). Денситомет-рирование проводили на Скан-400 ^wJoyee-Loebl UV" Нормальная и опак-2 кукуруза имели одинаковые спектры. _{А 260 ~}5І_{~ \г ИоХЄ.М}

Рис.2.9, Результаты фракционирования поля-А-содержащей мШС ионообменной хроматографией на метилированном альбумине-кизельгуре (МАК). Условия элюирования: линейный градиент 0,2 - 1,2 М HaCl на 0,01 М Трис-НСІ буфере рН7,2; температура колонки 37С, скорость потока 60 мл/час (Жарова 1.Г., Кордам В.А., 1977).

Получение прочно связанной с МАК фракция РНК (псРНК). A.O.Ellem, J.W.Sheridan (1964) показали, что фракция РНК, которая прочно связывается с МАК и элщруется с колонки только при повышенной температуре, является матричной РНК (так называемая "температурная" фракция). До сообщения A.O.Ellem д tf.W.Sheridan эта фракция ускользала от внимания исследователей.

Известно, что фракционирование нуклеиновых кислот на МАК происходит по молекулярному весу и нуклеотидному составу ( по мере увеличения молекулярного веса РНК или содержания в ней аде-нина и урадила прочность сорбции увеличивается). Сорбция происходит за счет ионных связей между фосфатными группами полинук-леотида и аминогруппами альбумина. Естественно, что прочность связывания определяется количеством ионных связей, приходящихся на одну молекулу РНК. Эта величина (количество связей) находится в прямой зависимости от числа фосфатных групп в молекуле, т.е. от ее молекулярного веса.

Вместе с тем важное значение имеет конформация РНК. При конформации в виде компактного клубка большое число фосфатных групп "спрятано" внутри него, и лишь ограниченное количество их способно связываться с колонкой. В этом и заключается влияние нуклеотидного состава на прочность сорбции. РНК АУ-типа более подвержена влиянию различных денатурирующих агентов д образует при прочих равных условиях менее компактные клубки, чем РНК Щ-типа. На основании этих соображений был разработан метод фракционирования РНК на колонке МАК с использованием денатурирующих агентов (Лихтенштейн А.В., 1970; Mchtenstein А.V., ShapotV.S., 1971).

Этот метод обеспечивает накопление в препаративных количествах фракции псРНК, которая по ряду показателей идентифицируется как мРНК: невысокое содержание в цитоплазме (около 2%), гете- рогенность, вуклеотидный состав приближается к ДНК-подобному. По методике, предложенной Лихтенштейном и Шапотом ( Mch- tenstein A.V., Shapot V.S. , ЮТ) , ПОЛИрИбОСОМЫ, ПОЛуЧЄНННЄ методом дифференциального центрифугирования, депротеинизирова-ли фенолом, а затем свободные от белка нуклеиновые кислоты растворяли в буфере Д (0,01 М трис-НСі , рН 7,4; З М мочевина, 20 мМ ЭДТА- Ша2', 0,45 М %Cl ) и наносили на колонку МАК, которую готовили по методике, описанной Кулаевой и др. (IS7I). Б работе использовали метилированный альбумин фирмы " Sigma "(США).

Чтобы исключить работы с фенолом, ввели следующую модификацию метода: полирибосомы растворяли без предварительной депро-теинизации в буфере Д и наносили на колонку МАК. Последнюю промывали раствором 1,5 М хлористого натрия до отсутствия в про -мывных водах поглощения при 260 нм. Прочно связанную с МАК фракцию РНК смывали с колонки 2^-ным раствором додецилсульфата натрия при 70С. Эта фракция РНК составляла 3-4$ от РНК рибонуклео-протеидов., полученных методом М_є ⁺⁺-преципитадии из созревающего эндосперма кукурузы. Определение количества РНК проводили после ее щелочного гидролиза (0,3 М КОН, 18 часов, 37С) и отделения нуклеотидов на смоле Дауэкс А⁶ , I х 4 С1 ~.

В отличие от рибосомной РНК "температурная" фракция оказалась обогащенной АМФ и УМФ, что является характерной особенностью мРНК. Коэффициенты специфичности j-qry были равны соответственно 0,9 (мРНК) и 1,4 (рИЖ). Нуклеотидный состав определяли методом ионообменной хроматографии на жидкостном хроматографе "Hitachi" 034 (Япония); смола Дауэкс AG I х 4 сі".

Кроме того, псРНК получали непосредственно из экстракта созревающего зерна буфером Е (0,05 М трис-НСі ; рН 7,5; З М мочевина; 0,04 М ЭДТА- Nag; 0,5 М NaCi ; 1% парааминосалицилата натрия; 0,04 мл/мл диэтилпирокарбоната (ДЕПК). Последний добавляли непосредственно перед экстракцией. Гомогенат встряхивали на холоде 10 минут и затем центрифугировали 30 минут при 40 000 S . Надосадочную жидкость разбавляли в 8 раз буфером Е без ДЕПК и немедленно наносили на колонку МАК со скоростью 120 мл/час. Колонку промывали раствором Е без ДЕПК, затем последовательно 0,5 и 1,5 М %С1 (в 0,01 М трис-НСі -буфере, рН 7,5).

ПсРНК элюировали с колонки 1,5 М NaCl при 98С со скоростью 60 мл/час и пропускали непосредственно через колонку поли-У-сефарозы для отделения поли-А-содержащей фракции РНК.

Поскольку селективная сорбция РНК на МАК происходит не только согласно особенностям ее нуклеотидного состава, но и по особенностям вторичной структуры мРНК, этот метод позволяет получать как аденилированную, так и неаденилированную субфракции мРНК.

Модельный эксперимент показал, что вся синтетическая поли-адениловая кислота ("Reanai ", Венгрия), сорбированная на МАК в условиях буфера Е, при температурной элюции и пропускании через поли-У-сефарозу полностью сорбируется последней. Б то же время из равных объемов одного и того же экстракта зерна кукурузы получали сходное количество поли-А-содержащей РНК как из псРНК, так и при прямом пропускании экстракта через поли-У-сефарозу.

Из литературы известно, что печень крыс и мышей содержит только 20-25% полиаденилированной мРНК от всей суммы мРНК (Подо-бед О.В. и др., 1974; Любимова Е.В. и др., 1976). Чтобы принципиально оценить способность метода селективной сорбции давать представительный препарат мРНК, включающий обе субфракции, были проведены эксперименты по определению их соотношения в печени крыс.

Таблица 2.1 Соотношение прочно связанной с ЇМК (псРНК) и поли-А-содержащей РНК в полисомах печени крысы (мкг/г)

В экспер. ! псРНК і поли-А-РНК ! % поли-А-РНК ! от псРНК

Как видно из таблицы 2.1, полученные данные хорошо согласуются с литературными; псРНК в среднем на 27$ представлена поли-А-содержащей РНК.

ПсРНК составляет 7-8$ от суммарной РНК зерна кукурузы по поглощению в ультрафиолете и около 1% по включению радиоактивной метки ( Р,4 часа инкубации).

В большинстве случаев необходимой предпосылкой исследования внутриклеточной функции,я метаболических превращений клеточных РНК является введение в них метки радиоактивного предшественника. Оборотной стороной такого подхода является, однако, то обстоятельство, что при этом из поля зрения выпадают целые классы слабо включающих радиоактивную метку стабильных РНК. Так, из литературы известно, что ядро печени крысы содержит быстрометящихся ДНК-подобных РНК в 2,5-3 раза меньше, чем метаболически инертных молекул (Лихтенштейн А.В., 1981). Таким образом, относительно низкий процент включения радиоактивного предшественника в псРНК кукурузы, по-видимому, отражает то, что значительная часть популяции мРНК здесь представлена относительно стабильными матрицами.

Определение активности рибонуклеази. Активность определяли при рН 5,2, как описано Р.И.Татарской и др. (1964). Использовали коммерческий препарат дрожжевой РНК. Расчет активности производи- -бели по формуле, предложенной O.M.Wilson (1975): Ap_fin x (мл исследуемого p-pa + мл осаж-

Единица активности « — дающего агента) х фактор разбавл. (мл фермента) х минуты (30)

Методика эксперимента по актиномяциновой блокаде синтеза мРНК в созревающем эндосперме кукурузы. На 16-ый и 19-ый день от опыления в ножку и основание початков вводили актиномицин Д в количестве 400 мкг/початок. Б контрольные початки - равный объем дистиллированной воды. За 18 часов до снятия во все початки вводили меченые аминокислоты (¹⁴С-лизян, ¹⁴С-лейцин или s -метионин) общей радиоактивностью 80 мккюри. Все початки снимали на 20-ый день от опыления.

В экспериментах с половинками эндосперма аминокислоты вводились так же; эндосперм снимали с початка на 20-ый и 32-ой день и рассекали на верхнюю и нижнюю сбазальную) половины.

Эндосперм высушивали лиофильно, растирали в ступке и обезжиривали петролейным эфиром в течение ночи. Из полученного материала белки выделяли последовательной экстракцией ( ОэЪогп т.в., 1897). Альбумины и глобулины - 3^-ным раствором ^аС1 с последующим диализом против дистиллированной воды в течение 20-и часов. Выпавшие в осадок глобулины отделяли центрифугированием. Проламины выделяли 10% этанолом, глютелины - 0,02 М NaOH. Соотношение пробы и растворителя I г : 10 мл. Операции по выделению альбуминов и глобулинов осуществляли при 2-4С. Экстракция каждым растворителем повторялась 5-6 раз. Для счета радиоактивности брали первые две экстракции. Чтобы определить удельную радиоактивность, точно отмеренный объем раствора белка (в случае глобулинов - суспензии) наносили на мишень и высушивали под инфракрасной лампой. Радиоактивность определяли на радиометрическом прибо- ре 2І54-І-Ш "Протока".

Фракционирование белков методом изоэлектрического фокусирования в слое полиакриламидного геля на аппарате "Мультяфор" ЛКБ 2117 проводили совместно с В.П.Неудачиным по его методике (1279) в зоне рН 3-Ю. Радиоавтограмму получали путем контакта сухого геля с рентгенографической пленкой HSII orwo в течение 10-и дней. Денситометрировали на денситометре JW-33 ("Toyо ", Япония) при 440 нм.

Аминокислотный состав эндосперма изучали после кислотного гидролиза на аминокислотном анализаторе Кь А-ЗВ (" Hitachi ^п, Япония), цистин и метионин с предварительной оксидацией надму-равьиновой кислотой.

Содержание белка определяли полумакрометодом Кьельдаля ( N х 6,25). Полученные результаты представлены средней величиной из 3-4-х параллельных определений. Статистическую обработку проводили по П.Ф.Рокипдому (1967).

Значение кукурузы опак-2 для практики и теорий

Одиночный рецессивный ген опак-2, локализованный в седьмой хромосоме генома кукурузы, вызывает изменения в соотношении белковых фракций эндосперма: снижает количество малоценного по лизину и триптофану зеина и увеличивает долго альбуминов, глобулинов и глютелинов. В результате содержание лизина повышается на 50-100$ и триптофана на 40-60$.

Многочисленные опыты на животных и людях показали исключительно высокую питательность зерна кукурузы опак-2, белок которой по биологическому действию оказался близким к белкам молока (Мертц Е.Т., 1969; Valve de v. et ai. , 1981). Эффективность вы-СОКОЛИЗЙНОВОЙ кукурузы в кормлении свиней и птицы выражалась увеличением продуктивности на 18-25$, возможностью снижения расхода белка на 20$, уменьшением затрат кормов на единицу продукции на 12-15$ по сравнению с теми же показателями на обычной кукурузе (Рядчиков В.Г., 1977).

Однако в ходе создания высоколизиновых аналогов линий и гибридов были обнаружены отрицательные свойства, присущие зерновкам типа опак-2: I) мутантные зерновки легче, чем зерновка нормального генотипа, что является следствием меньшей плотности эндосперма; 2) к моменту уборки влажность зерна опак-2 на 1,5-4$ выше в сравнении с обычными аналогами, что, возможно, связано с увеличением свободных аминокислот, зольных элементов и белков типа альбуминов, значительно повышающих гидрофильность зерновки; 3) початки опак-2 более восприимчивы к болезням, особенно фузарйозу,и вредителям (Ключко ЇЇ.Ф., Максак Н.Н., 1969; Александер Д.Е. и др., 1971; Га-леев Г.С. и др., 1971; Каджинов М.ЇЇ., Зима К.И., 1972; Гурьев Б.Л., Козубенко А.В., 1976; Писанский А.П. и др., 1976; Таова JUL, 1976; Цыганок И.С., 1978).

Зерно высоколизиновой кукурузы отличается мучнистым эндоспермом, для которого характерно множество воздушных полостей (Попова Е.П., 1979). Снижение веса зерна, а следовательно, и урожая было связано первооткрывателями мутации опак-2 E.T.Mertz, O.E.Nelson (1966) с меньшим содержанием крахмала в мутантном эндосперме (пит. по Bates L.s. , 1982). Кроме того, белковые тела - особые органеллы, образующиеся в результате отложения зеина в просветы гранулярного эндоплазматического ретикулума, - в опак-2 намного мельче, чем в эндосперме нормальной кукурузы (Wolf M.G., 1967; Перуанский Ю.Б., Портной В.Х., IS79; Филичкин С.А., 1982).

Наличие вышеперечисленных отрицательных свойств существенно сдерживает внедрение кукурузы опак-2 в сельскохозяйственную практику. Поэтому в настоящее Бремя основное внимание уделяется селекции на устранение этих недостатков.

Материалы и метолу исощования

Объектом исследования был эндосперм созревающего зерна кукурузы нормальной линии Висконсин 64А ( W64A+/+) и ее спонтанного мутанта опак-2 ( 64Ао2/оз).

Эндосперм составляет до 80-90$ массы зерновки и определяет в основном питательную ценность зерна кукурузы. Эндосперм весьма удобен для биохимического анализа, так как он легко отделяется от зародыша и является относительно однородной тканью, к которой примешивается лишь тонкий наружный слой перикарпа.

Растения для исследований выращивали в поле яли в фитотроне. Сравниваемые формы находились в одинаковых условиях. В период появления метелок на початки надевали изоляторы. Опыляли смесью пыльцы, собранной с метелок данной формы. Початки снимали с растения в определенные сроки - на 10-ый, 15-ый, 20-ый, 30-ый или 40-ой день от опыления, немедленно замораживали в жидком азоте. В замороженном состоянии зерна снимали со стержня початка, и эндосперм отделяли от зародыша. Хранили эндосперм при температуре -20С и использовали в течение 4-5 месяцев.

Методики выделения и количественного определения нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты выделяли из эндосперма по методу Шаймоши в модификации Детчона и Поссингема (цит. по Селиванкина СЮ. и др., 1976). Содержание РНК и ДНК в выделенном препарате, а также в сахарозных экстрактах из эндосперма определяли по методу Блобеля и Поттера ( В1оЪе1 G., Potter V.R., 1967). Кроме того, содержание нуклеиновых кислот в эндоспермальной ткани определяли после отмывки кислоторастворимых веществ и фракционирования РНК и ДНК по методу ІШщдта и Тангаузера в модификации Флека

Я Монро (цат. по Збарский И.Б., Дебов С.С., 1968): РНК - после щелочного гидролиза - а) спектрофотометрически, б) орциновой реакцией по Мейбаум (цат. по Конарев В.Г., Тютерев С.Л., 1970); ДНК - после кислотного гидролиза определяли реакцией по Дише в модификации Бартона (цит. по Збарский И.Б., Дебов С.С, 1968).

Определение содержания рРНК в препаратах полирибосом и тРНК в постполирибосомальной жидкости проводили по рекомендации М.Г.Трудолюбовой (1977). Очищение ГНК полирибосом, полученных методом дифференциального центрифугирования, осуществляли фе-нольно-детергентным способом, как описано Е.В.Любимовой и О.В. Подобед (1977).

Содержание суммарных нуклеиновых кислот

По вопросу содержания суммарной РНК в мутантном эндосперме в литературе имеются некоторые разногласия. A.Viotti с соавторами (1975) нашли, что по содержанию РНК опак-2 эндосперм не отличается от нормального. Это было показано на линии W64A, которая является объектом нашего исследования. Поскольку другле авторы говорят о большем содержании РНК в мутанте (Лукьяненко Л.М., Дмитриева А.Н., 1974, 1976; Домашнев П.П. и др., 1978, 1981; Пыльнева П.Н., 1978), представлялось необходимым получить собственную информацию по этому вопросу.

Различия в данных могли быть как следствием разных климатических условий произрастания кукурузы, так и следствием применяемых методов. Выбор метода определения РНК и ДНК, как правило, завясит от объекта исследования, так как в разных объектах могут преобладать те или иные примеси. Поскольку A.Viotti л др. (1975) получали нуклеиновые кислоты в чистом недеградированном виде, а потом определяли их количество, в то время как другле авторы применяли метод Шмидта и Тангаузера, исключающий получение нуклелновых кислот в недеградированном состоянии, то в настоящей работе были применены оба подхода, использованы 3 варианта методики определения: I) метод Шмидта и Тангаузера в модификации Флека и Монро, 2) метод выделения нуклеиновых кислот по Шаймошй с последующим фракционированием РНК и ДНК и их количественное определение по методу Блобеля л Поттера, 3) определение содержания РНК и ДНК в сахарозном экстракте эндосперма по Блобелю я Поттеру.

Результаты исследования представлены в таблице 3.1. Разли-чля в абсолютных значениях при лспользованяи разных методов, по-видимому, является следствием неодинаковой степени извлечения нуклеиновых кислот и искажения результатов сопутствующими примесями. Однако закономерность соотношения количества РНК в эндосперме сравниваемых форм кукурузы сохранялась одна и та же: во всех случаях содержание РЖ было выше в мутантном эндосперме. Уто преимущество, незначительное в начале развития эндосперма (10-ый, 15-ый дни;, от опыления), возрастает и наиболее выражено на 30-ый день, когда РНК в мутантном эндосперме в 2 раза больше, чем в обычном (табл.3.I, рис.3.I).

Похожие диссертации на Особенности нуклеиново-белкового обмена созревающего эндосперма кукурузы ОПАК-2

Особенности метаболических изменений в крови пациенток с сахарным диабетом 2 типа в зависимости от возраста и степени компенсации углеводного обменаИшонина Оксана Георгиевна

Особенности взаимодействия эстераз насекомых и млекопитающих с производными 1,3,2-дигетерафосфоринана и тио- и дитиокислот фосфора, содержащими фрагменты N-ацилированных аминокислотХрунин Андрей Владимирович

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ И КРОВИ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА И САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2 ТИПАЛитвинова, Марина Георгиевна

Особенности изменений фосфолипидов головного мозга и печени мышей при действии 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина и парентеральной фосфолипидной нагрузкиПодгорный, Геннадий Николаевич

Особенности обмена веществ у животных при использовании в рационах различных сортов и вариантов обработки соевых семянВолченко Дмитрий Сергеевич

Особенности обмена гликозаминогликанов в коже и печени крыс с различной устойчивостью к стрессуПротасова, Светлана Владимировна

Особенности обмена биогенных аминов и свободнорадикального окисления при алкогольном делирии с сопутствующим вирусным гепатитом СБабин Константин Александрович

Особенности обмена сиалогликопротеинов желудка и тонкой кишки у крыс с различной устойчивостью к стрессу (экспериментальное исследование)Оксузян, Артур Валериевич

Особенности обмена веществ ягнят, полученных от овец мясного направления продуктивностиМарутянц Надежда Георгиевна

Особенности обмена холестерина и высших жирных кислот у детей раннего возраста Зацепина Светлана Николаевна