Окислительный стресс и защита головного мозга от ишемического повреждения Федорова Татьяна Николаевна

Содержание к диссертации

Стр.

Условные обозначения 6

Введение 7 - 15

Раздел I. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС И ИШЕМИЧЕСКИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА (Обзор литературы)

1.1. Роль активных форм кислорода в нормальных и патологических
процессах

1. Кислородные радикалы и их действие на клеточный метаболизм.. 16-24

2. Антиоксидантная система клеток 24-35

3. Окислительный стресс и мозг.. 35-41

1.2. Каскад патофизиологических событий при нарушениях мозгового
кровообращения 42-64

3. Апоптоз и некроз как возможные пути гибели нервных клеток при ишемии головного мозга 65-68

4. Свободнорадикальное окисление липидов и антиоксидантная терапия при заболеваниях ЦНС

1. Свободнорадикальное окисление липидов при различных заболеваниях ЦНС. 69-74

2. Состояние свободнорадикальных процесов при ишемических острых нарушениях мозгового кровообращения у больных 74-76

1.4.3. Применение антиоксидантов при ишемии головного мозга 76-84

1.5. Экспериментальные подходы к характеристике окислительной
устойчивости клеточных структур

3. Экспериментальные модели ишемии головного мозга 84-89

4. Методы регистрации уровня перекисного окисления липидов 89-97

5. Интерпретация хемилюминесцентных кривых 97-102

Раздел И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И

КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

II. 1. Характеристика объектов исследования

Н:Ш. Экспериментальные модели нарушения кровообращения головного

мозга 103-108

II. 1.2. Характеристика групп пациентов в клинико-биохимических

исследованиях 109-115

II. 1.3. Отбор крови у пациентов для биохимических исследований.. .115

II. 2. Биохимические методы исследования

II.2.L Флуориметрическое определение продуктов, реагирующих с

тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) в крови 115-118

Н.2.2. Хемилюминесценция липопротеинов сыворотки крови,

индуцированная ионами двухвалентного железа 118-119

II. 2.3. Регистрация *Fe^2Jr-индуцированной хемилюминесценции гомогенатов-

тканимозга; 120

II. 2.4. Определение ТБК-РП в ткани мозга и крови экспериментальных

животных. 120-122

II.2.5. Определение активности суперрксиддисмутазы 122-124

Раздел IIL ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА МОДЕЛИ Fe²⁺-ИНДУЦИРОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЛИПОПРОТЕИНОВ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ОПЫТАХ in vitro 125-131

Раздел IV. РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ПАТОГЕНЕЗЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ВОЗМОЖНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ in vivo IV. її Перекисное окисление липидов как проявление окислительного стресса в условиях экспериментальной ишемии головного мозга

ІУЛЛ.Интенсивность перекисного окисления липидов при

экспериментальной ишемии головного мозга у монгольских

песчанок. 132-136

IV. 1.2. Влияние синтетического антиоксиданти ионола на клинические и биохимические проявления экспериментальной ишемии головного мозга у

монгольских песчанок 136-142

IV. 2. Оценка защитного действия карнозина и кавинтона на модели острой гипобарической гипоксии

IV.2.1. Влияние карнозина и кавинтона на адаптацию крыс линии Вистар к острой гипобарической гипоксии, оцениваемой по физиологическим

показателям 142-144

IV.2.2. Влияние карнозина и кавинтона на показатели перекисного окисления липидов в тканевых гомогенатах различных отделов мозга крыс

линии Вистар, подвергнутых острой гипобарической гипоксии 144-150

TV.2.3. Влияние карнозина и кавинтона на, показатели перекисного окисления липидов в плазме крови крыс линии Вистар, подвергнутых острой

гипобарической гипоксии. 150-155

IV.3. Применение природного антиоксиданта карнозина в качестве лечебного средства при экспериментальной ишемии головного мозга IV.3.1. Терапевтическое действие карнозина при экспериментальной

ишемии головного мозга у крыс линии Вистар 155-160

IV.3.2. Терапевтическое действие карнозина при экспериментальной

ишемии головного мозга у монгольских песчанок 160-165

Раздел V. РАЗВИТИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У ПАЦИЕНТОВ С
СОСУДИСТЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ГОЛОВНОГО МОЗГА 166-171

Раздел VI. ПЕРСПЕКТИВЫ АНТИОКСИДАНТНОЇ! ТЕРАПИИ

ПАЦИЕНТОВ С СОСУДИСТЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ГОЛОВНОГО

МОЗГА

VI.1. Динамика переписного окисления липидов при лечении больных с

острыми нарушениями мозгового кровообращения ишемического

характера 172-178

VI.2. Применение антноксиданта эмоксипина при лечении больных с

сосудистыми заболеваниями головного мозга

VI.2.1. Терапевтическая эффективность эмоксипина при лечении больных с

хронической дисциркуляторной энцефалопатией 178-184

VI.2.2. Терапевтическая эффективность эмоксипина при лечении больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения ишемического

характера 184-188

VI.3. Антиоксидантное действие милдроната и L-карнитина при лечении
больных с сосудистыми заболеваниями головного мозга 188-193

VII. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО
СТРЕССА ПРИ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА (Обсуждение
полученных результатов) 194-231

VIII. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 232-243

IX. ВЫВОДЫ. 244-245

X. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 246-298

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АО - антиоксиданти

АК - арахидоновая кислота

АОА - антиокислительная активность

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

АГ-артериальная гипертония

AT - атеросклероз

ВЖ - время жизни на высоте

ВПП - время потери позы

ВР - время реституции

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДЭ - дисциркуляторная энцефалопатия

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

МДА - малоновый диальдегид

3-НП - 3-нитропропионовая кислота

ОНМК - острые нарушения мозгового кровообращения

ОС - окислительный стресс

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

СОД - супероксиддисмутаза

НПНКМ - начальные проявления неполноценности кровоснабжения мозга

НМК - нарушения мозгового кровообращения

ТБК-РП - продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой

ХЛ - хемилюминесценция

Введение к работе

Проблема ишемических поражений головного мозга является одной из наиболее актуальных в современной неврологии. Ее медико-социальная значимость определяется большим весом сосудистых заболеваний головного мозга в структуре заболеваемости и смертности населения, а также высокими показателями временной нетрудоспособности¹ и первичной инвалидности. В экономически развитых странах смертность от таких заболеваний занимает 2-3 место в ряду общей смертности. В России ежегодно происходит более 400000 инсультов, причем смертельный исход достигает 35%, что в 2-4 раза выше, чем в индустриально развитых странах (Верещагин Н.В. и соавт., 1996, 1997; Суслина З.А., 1999,2000; Гусев Е.И. и соавт, 2001).

На формирование и течение сосудистой патологии головного мозга оказывают влияние многочисленные факторы риска, основными из которых являются атеросклероз и артериальная гипертония (АГ). По данным регистра инсульта НИИ неврологии РАМН, АГ и АГ в сочетании с атеросклерозом сосудов головного мозга диагностированы у 78% больных, перенесших инсульт (Варакин Ю.Я., 1996; Суслина З.А., 2000). Ишемические поражения головного мозга, возникающие на основе артериальной гипертонии и/или атеросклероза, в течение последних десятилетий по частоте значительно превысили распространенность геморрагических инсультов, достигая соотношения 4:1 (Верещагин Н.В., 1988. 2001). Этим определяется необходимость дальнейшего изучения патофизиолопіческих и нейрохимических механизмов формирования церебральной ишемии, а также создания новых перспективных методов лечения этого заболевания.

Сосудистые поражения мозга не ограничиваются только острыми нарушениями мозгового кровообращения, но одновременно являются причиной постепенного нарастания неврологических и психических расстройств, вплоть

до сосудистой деменции (Гусев Е.И и соавт., 1982; Калашникова Л.А., 1988; Верещагин Н.В. и соавт., 1997). Хроническая сосудистая мозговоая недостаточность (ХСМН) представляет, собой прогредиентный патологический процесс, в основе которого лежит нарастающее несоответствие между кровоснабжением головного мозга и потребностями обмена веществ. ХСМН обычно дебютирует . начальными проявлениями недостаточности кровообращения мозга (НПНКМ); при прогрессировании сосудистого мозгового процесса у больных развивается дисциркуляторная энцефалопатия (ДЭ) (Шпрах В.В.исоавт., 1994).

НПНКМ составляют 60-70% всех случаев сосудистой патологии головного мозга и в 2-3 раза увеличивают риск инсульта * и преходящих нарушений; мозгового кровообращения (транзиторные ишемические атаки и церебральные гипертонические кризы) (Манвелов Л.С., 2000). Поэтому проведение лечебных мероприятий, направленных на предупреждение возникновения мозгового инсульта является назревшей медико-социальной проблемой,.

Изучение патохимических механизмов, индуцированных

гипоксией/ишемией головного мозга и лежащих в основе повреждения вещества головного мозга и развития; неврологического дефицита, имеет как теоретический: интерес, так и практическую значимость, определяя новые направления профилактики и патогенетической терапии ишемических поражений головного мозга.

Нарушения кровоснабжения головного мозга инициируют каскад биохимических реакций, лежащих в основе тканевого повреждения. Основные механизмы неирональных повреждений включают истощение энергетических ресурсов в условиях ацидоза ткани мозга, нарушение ионного гомеостаза, избыточное накопление возбуждающих аминокислот,, обладающих нейротоксическим действием, и возрастание свободнорадикальных форм

кислорода, индуцирующих развитие окислительного стресса (Watson B;D., 1984; Floyd R.A., 1990;. Pellegrini-Giampetro D.E., etal., 1990).

Одновременно развивается атака активными формами кислорода белков, нуклеиновых кислот и липидов, протекающая по механизму свободнорадикального окисления. Некомпенсируемая активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), истощение фонда эндогенных антиоксидантов рассматриваются как ключевые звенья повреждения нейронов (Siesjo В.К., 1988;BiggeCh.F. and Boxer Р.А., 1994).

Нервная ткань наиболее чувствительна к повреждающему воздействию свободных радикалов,, в избытке генерируемых в условиях реоксигенации головного мозга., Это можно объяснить высокой интенсивностью обменных процессов в ткани мозга, отсутствием в ней избыточных запасов энергии, высоким содержанием субстратов перекисного окисления (полиненасыщенных жирных кислот) и катализаторов реакций липидного переокисления (в основном, ионов железа и меди) в сочетании со сравнительно низкой активностью ферментов антирадикальной защиты (Yochida S. et al., 1982; Aruoma О., 1989)..

В научной литературе, посвященной этой проблеме, выдвинута гипотеза о патогенетической роли окислительного стресса в повреждении клеток мозга, обусловленных его ише.мизацией. В тоже время многие вопросы, связанные с механизмами защиты головного мозга в условиях ишемии и рециркуляции от окислительного стресса, остаются дискутабельными. Является очевидной необходимость как систематических исследований биологического действия природных и синтетических антиоксидантов, так и поиск новых соединений, обладающих протекторной способностью к, нарушениям кислородного обмена. Важной проблемой остается отсутствие адекватной, количественной оценки окислительного стресса как в условиях экспериментальных исследований ишемии мозга, так и при проведении клинико-биохимических сопоставлений у

больных с сосудистыми заболеваниями головного мозга. В соответствии с этим, определение адекватных критериев оценки собственных эндогенных резервов антиоксидантной защиты организма человека и эффективности корригирующей антиоксидантной терапии является весьма актуальной задачей. Решение этих проблем имеет чрезвычайно важное значение как для углубленного понимания механизмов повреждения нервной ткани при ишемии мозга, так и для разработки на этой основе новых подходов к лечению сосудистых заболеваний головного мозга.

Целью работы является нейрохимическая характеристика окислительного стресса и оценка его роли в патогенезе ишемических повреждений головного мозга, а также разработка принципов их медикаментозной коррекции с использованием препаратов антиоксидантного действия.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать количественную модель окислительного стресса при ишемических повреждениях головного мозга, и дать количественную характеристику защитного действия перспективных антиоксидантов в качестве протекторов биологических структур в опытах in vitro на модели Ре²⁺-индуцированной хемилюминесценции. Оценить возможность использования этого метода в качестве теста при экспериментальных и клинико-биохимических исследованиях.

2. На экспериментальной модели ишемии мозга у монгольских песчанок сопоставить интенсивность ПОЛ в мозге животных в условиях полной ишемии с последующей рециркуляцией (левое полушарие) или без нее (правое полушарие), для определения характера окислительных повреждений головного мозга в различных условиях окислительного стресса. Исследовать

протекторное и профилактическое действие синтетического антиоксиданта ионола в условиях окислительного стресса.

3. Сопоставить эффективность природного антиоксиданта карнозина с препаратом сравнения кавинтоном в условиях окислительного стресса, индуцированного острой гипоксией у крыс линии Вистар. На различных экспериментальных моделях ишемии головного мозга у грызунов дать оценку воздействия карнозина на биохимические и физиологические проявления окислительного стресса в постишемическом периоде длительной рециркуляции.

4. Провести сравнительный анализ степени выраженности окислительного стресса и тяжести сосудистого поражения мозга у пациентов с различными формами цереброваскулярной патологии.

5. Оценить влияние традиционной лекарственной терапии (не включающей препараты антиоксидантного действия) на состояние перекисного окисления липидов у больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения ишемического характера.

6. Оценить действие препаратов антиоксидантного ряда (эмоксипин, мшдронат и карнитин) на количественные характеристики окислительного стресса и клинические проявления заболевания при хронических и острых ишемических поражениях головного мозга. На этой основе обосновать целесообразность антиоксидантний терапии больных с острыми и хроническими ишемическими цереброваскулярными заболеваниями.

Положения, выносимые на защиту 1. Метод Ре²⁺-индуцированной хемилюминесценции является' адекватной моделью количественной оценки окислительного стресса и антиоксидантного действия биологически активных соединений при ишемии головного мозга. Благодаря высокой специфичности, хемилюминесцентный метод

обеспечивает возможность выявить in vitro различия в механизме действия этих соединений на молекулярном уровне. Использование нового методического подхода к изучению ПОЛ позволяет не только дать количественную оценку активности свободнорадикальных процессов, но и осуществить качественный контроль этих процессов на фоне проводимой лекарственной терапии как в экспериментальных, так и клинико-биохимических исследованиях.

2. Развернутая характеристика процессов ПОЛ как одного из маркеров окислительного стресса позволила определить его существенное значение в патогенезе ишемии головного мозга и дать количественную оценку роли свободных радикалов в клеточном повреждении при ишемии мозга. Окислительные повреждения ткани мозга возникают уже на ранней стадии процесса в условиях полной ишемии и достигают своего максимума в период рециркуляции.

3. Природный дипептид карнозин является эффективным профилактическим и лечебным средством в отношении окислительного стресса, индуцированного острой гипоксией или ишемией головного мозга у экспериментальных животных. Это подтверждается не только положительной динамикой соответствующих биохимических показателей ПОЛ и снижением степени тяжести неврологических симптомов у животных, но и активацией ключевого фермента антирадикальной защиты - супероксиддисмутазы.

4. У пациентов с различными сосудистыми заболеваниями головного мозга
имеет место постепенное (пропорционально тяжести сосудистого поражения)
нарастание окислительных повреждений липопротеинов крови. Традиционная
терапия ишемического инсульта не препятствует прогрессированию
окислительных повреждений липопротеинов, что является основанием для

рекомендации к применению антиоксидантнои терапии у данного контингента больных.

5. Использование антиоксидантов при лечении пациентов с хроническими и острыми сосудистыми; заболеваниями головного мозга препятствует окислительным повреждениям липопротеинов крови и уменьшает степень неврологических симптомов, что подтверждает участие окислительного стресса в патогенезе ишемии головного мозга и открывает перспективу применения препаратов антиоксидантного действия в качестве нейропротекторов нового поколения.

Научная новизна исследования. Разработана модель количественной оценки окислительного стресса в условиях нарушения кровоснабжения головного мозга. Впервые с помощью Ре²⁺-индуцированной хемилюминесцентной системы проведена сравнительная количественная характеристика механизма действия ряда перспективных препаратов в качестве протекторов мозга. Впервые благодаря высокой специфичности и разрешающей способности Ре²⁺-индуцированной хемилюминесцентной. модели показано, что развитие окислительного стресса возникает уже на ранних стадиях экспериментальной ишемии мозга и может предотвращаться введением антиоксидантов. Впервые представлена развернутая характеристика природного нейропептида карнозина в его действии на физиологические и биохимические проявления окислительного стресса: в условиях in vivo в качестве препарата терапевтического действия. В работе реализовано сочетание нескольких экспериментальных подходов: с одной стороны - исследование биологического материала лабораторных животных при моделировании у них экспериментальной ишемии головного мозга, а с другой стороны -использование структурных элементов крови больных с острыми и хроническими сосудистыми заболеваниями головного мозга. В результате

экспериментальных исследований сформулированы представления о патогенетической значимости окислительного стресса и обосновано применение антиоксидантов в качестве нейропротекторов при ишемическом повреждении мозга.

Теоретическая значимость работы. Полученные в работе результаты доказывают участие окислительного стресса в развитии ответа ткани на нарушения мозгового кровообращения, что является существенным вкладом в понимании патогенеза ишемических повреждений головного мозга. Проведенные клинико-биохимические исследования указывают на то, что окислительные повреждения биологических структур крови начинаются уже на ранних этапах сосудистого заболевания и постепенно усиливаются по мере развития тяжести заболевания,, достигая: значительных нарушений при хронических и острых нарушениях мозгового кровообращения ишемического характера. Результаты проведенного исследования доказывают эффективность использования препаратов антиоксидантного действия (эмоксипина, милдроната и L-карнитина) в комплексной терапии острых и хронических нарушений мозгового кровообращения. В работе обоснована необходимость включения в терапию сосудистых заболеваний головного мозга новых препаратов антиоксидантного действия.

Практическая значимость работы. Модель железо-индуцированной хемилюминесценции может служить способом тестирования антиоксидантного действия биологически активных соединений, перспективных для дальнейшего использования в качестве лекарственных препаратов в комплексной терапии сосудистых заболеваний головного мозга, а также для создания новых лекарственных средств. Проведенное изучение окислительных повреждений липопротеинов крови пациентов с различными сосудистыми заболеваниями головного мозга указывает на важность этого параметра для дифференциальной

*

диагностики, контроля за динамикой заболевания и эффективностью проводимого лечения, а также поиска новых препаратов антиоксидантного действия.

I. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС И ИШЕМИЧЕСКИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА (Обзор литературы) 1.1. Роль активных форм кислорода в нормальных и патологических

условиях /./ 1. Кислородные радикалы и их повреждающее действие на клетку

Молекулярный кислород является широко распространенным окислителем в живых системах. Особенностью строения его молекулы является наличие двух неспаренных электронов с параллельным состоянием их спинов, в то время как электроны в молекулах стабильных органических соединений организованы в пары с антипараллельными спинами. По этой причине в ходе взаимодействия кислорода с окисляемыми им соединениями возможно образование короткоживущих комплексов.

Для полного исчерпания окислительной способности молекулярного кислорода и образования двух молекул воды необходимо присоединить к нему 4 электрона (Рис.1).

є" є", 2ІҐ е" е,2Н⁺

о₂ -* 0₂ -> Н₂0₂ — ОН' + ОВГ -> 2Н₂0

Рис. 1. Генерация кислородных радикалов при последовательном восстановлении кислорода

При постадийном присоединении электронов к молекулярному кислороду образуются супероксид-анион радикал, гидропероксид и гидроксид-радикал. Изменение спинового состояния электронов в молекуле кислорода может происходить и без присоединения электронов, например, при поглощении

кванта света. При этом образуется синглетный кислород, также обладающий свойствами окислителя (Болдырев А.А., 2001).

Супероксид-анион может выступать и как восстановитель, и как окислитель. Окислительный потенциал его весьма мал, тем не менее, в клетке он обычно выступает как окислитель. Среди его мишеней небольшие органические молекулы - катехоламины, низкомолекулярные тиолы, аскорбат. тетрагидроптерины. Однако сам по себе супероксидный радикал обладает малой реакционной способностью. В кислой среде он способен образовывать гидропероксильный радикал (НО2''), являющийся гораздо более выраженным окислителем. В противоположность этому, гидропероксид Н₂0₂, образующийся при восстановлении супероксид-аниона кислорода, является практически инертной молекулой, достоинством которой является ее гидрофобность. По этой причине гидропероксид относительно легко покидает клетки.

Однако при его перепроизводстве он может являться предшественником гидроксид-радикала, сильнейшего окислителя, разрушающего разнообразные структуры живой клетки, включая ДНК и белки. Гидроксид-радикал генерируется в реакции Хабера-Вайса (Haber-Weiss):

Fe²⁺

Н₂0₂ + Of -* ОН* + ОН' + Fe³⁺

Fe³⁺ + 0"₂ -» Fe²⁺ + 0₂

и в реакции Фентона (Fenton):

Н₂0₂ + Fe²⁺ -* ОН* + ОН" + Fe³⁺

Эта реакция катализируется ионами металлов с переменной валентностью, преимущественно Fe²⁺ и Си²⁺, которые высвобождаются из белковых структур и становятся доступными только в условиях ацидоза.

Гидроксид-радикалы реагируют с большой скоростью и высоким сродством почти со всеми молекулами, находящимися в живой клетке, в частности, вызывая химическое повреждение дезоксирибозы, пуриновых и пиримидиновых оснований, мембранных углеводов, что приводит к каскаду реакций, вызывающих повреждение митохондриальной электронтранспортной системы, нарушению внутриклеточного гомеостаза ионов кальция, индукции протеаз и других опасных для клетки явлений. Гидроксид-радикал способен также атаковать ненасыщенные мембранные липиды, что приводит к развитию свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ). Финалом этой цепи превращений может стать клеточная смерть.

Таблица 1. Активные формы кислорода и родственных соединений

В табл. 1 и 2 приведены данные о наиболее важных видах активных форм кислорода (Болдырев А.А., 2001). Производные молекулярного кислорода, образующиеся в различных реакциях клеточного метаболизма, а также некоторые радикальные продукты их взаимодействия с клеточными элементами (например, пероксильные и алкоксильные радикалы, возникающие в результате окислительной атаки ненасыщеных жирнокислотных радикалов) относят к

свободнорадикальным соединениям. Они имеют разную реакционную способность, и, соответственно, характеризуются различным временем жизни (Табл.1).

Еще одним важным радикальным соединением является оксид азота N0', образующийся ферментом NO-синтазой и обладающий целым рядом биологических свойств, из-за которых ему приписывают роль медиатора, вторичного мессенджера или нейромодулятора. NO-радикал имеет два важных свойства - способность обеспечивать вазодилатацию (расслабление гладкомышечных клеток сосудистой стенки) и тем самым улучшать кровоснабжение тканей, и высокое сродство к супероксид-аниону кислорода, с которым он образует пероксинитрит. Константа скорости этой реакции составляет 10^ш М"¹'^¹. По этой причине паре «супероксид - N0» приписывают роль регулятора тонуса кровеносных сосудов: N0 вызывает сосудорасширяющий эффект, а супероксид нейтрализует N0, обеспечивая тем самым сосудосуживающее действие. В таблице .2 дана характеристика некоторых активных форм кислорода.При нарушении баланса между образованием N0 и супероксид-анион-радикала образуется ряд токсических агентов (Darley-Usmar V. et al., 1995). N0 активно взаимодействует с молекулярным кислородом и супероксид-анионом с образованием пероксинитрита (ONOOH) высокореакционной молекулы, обладающей оксидантными свойствами:

N0* + 0"₂ + Н⁺ -> ONOOH -> ОН* +NO*₂ Существенной особенностью пероксинитрита является его мощная окислительная способность, которую он проявляет как сам по себе, так и при образовании гидроксид-радикала в кислой среде и в присутствии ионов железа. По этой причине N0 в клетке обычно рассматривают вместе с типичными АФК и гипохлорит-анионом, также являющимся сильным окислителем,

образующимся в клетках из перекиси водорода в результате миелопероксидазной реакции.

Таблица 2. Некоторые характеристики активных форм кислорода

Окисление и продукция свободных радикалов является неотъемлемой частью метаболизма живых организмов (Papas A.M., 1996). АФК генерируются в различных биологических системах в ходе нормального аэробного дыхания митохондрий (Boveris А., 1977), в процессе дыхательного взрыва фагоцитирующих клеток, липидного переокисления, в процессе метаболизма арахидоновой кислоты (по цикло- и липооксигеназному пути), во время аутоокисления катехоламинов, а также реакций; катализируемых железом. (Sies Н., 1991; Halliwell В: et al., 1995; Thomas M.J, 1995).

Эндогенными источниками АФК в организме являются митохондрии, а также различные водорастворимые мембранносвязанные ферменты клеточных органелл: пероксисомы, в которых генерируется перекись водорода как побочный продукт деградации жирных кислот; эндоплазматический ретикулум,. где АФК генерируются ферментами цитохрома Р-450 как побочные продукты; лизосомы, в которых происходит дыхательный взрыв; цитоплазма, в которой свободные радикалы генерируются ксантиноксидазой, гемоглобином, рибофлавином, катехоламинами (Lander Н.М., 1997). АФК генерируют также недавно обнаруженные гомологи КАХ)(Р)Н-оксидазы при их стимуляции (Dupuy С et al., 1999). При этом одним из главных источников свободных радикалов является электронно-транспортная система митохондриий.

Экзогенными источниками АФК являются УФ-радиация, хемотерапевтические агенты, окислительный стресс, провоспалительные цитокины, факторы роста, а также инфекционные агенты (вирусы, бактерии и паразиты). (Lo, Y.Y. and Cruz T.F., 1995),

В норме свободные радикалы участвуют в выполнении важнейших физиологических процессов в организме (Болдырев А. А., КуклейМ.Л., 1996; Болдырев А.А., 2001). Супероксид-анион, гидроксид-радикал и перекись водорода могут участвовать в поддержании вазоконстрикторного-

вазодилятаторного баланса, обусловливающего гетерогенность (и изменяемость) органного кровотока. NO-радикал выполняет чрезвычайно разнообразные физиологические функции, принимая участие в модуляции сосудистого тонуса, в механизмах памяти и в реакциях воспаления. В норме NO-радикал является антиоксидантом, поскольку он реагирует с липофильными пероксильными радикалами, важнейшими и широко распространенными соединениями в биологической цепи реакций пероксидации липидов, приводя к генерации значительно более стабильных алкил-пероксинитратов (LOONO), что позволяет N0 остановить пероксидацию липидов. Выступая в роли мессенжера, N0 подавляет активность Са-каналов и тем самым препятствует аккумуляции нейронами ионов Zn, которые проходят в клетку через Са-каналы. В свою очередь цинк препятствует активации NO-синтазы кальцием и снимает положительный эффект N0 на клетки. В норме физиологическое повышение уровня N0 клетками эндотелия способно улучшать микроциркуляцию (Yue T-L. et al., 1992). Следовательно, оксид азота выполняет одну из важнейших функций во взаимодействии эндотелия и эпителия с гладкомышечными клетками сосудов и воздухоносных путей. Реализуется это взаимодействие в виде миогенных реакций гладких мышц в большинстве физиологических и патологических процессов (Марков Х.М.', 1996),

Чрезвычайно велика роль активных форм кислорода в воспалительных реакциях, которые имеют место практически при всех типах повреждений тканей, в том числе и при ишемии. Продуцируемые свободные радикалы и АФК выполняют важные биологические функции в процесса фагоцитоза, когда активированные фагоциты продуцируют АФК и используют их затем для уничтожения таких патогенных факторов, как бактерии и вирусы (Bogdan С, et al., 2000).

Свободнорадикальное окисление является одним из естественных механизмов модификации липидного состава клеточных мембран, обусловливающим изменения их функциональных характеристик.

Вместе с тем, в последние годы в научной литературе появились новые сведения об особой физиологической значимости АФК в функционировании возбудимых клеток (Пескин А.В., 1997). Одним из весомых доказательств того, что АФК вовлекаются в нормальный метаболизм нейронов, является внутриклеточная генерация свободных: радикалов (главным образом, супероксид-аниона, гидроксид- и NO-радикалов) в ответ на активацию глутаматных рецепторов, осуществляющуюся в нормальных условиях (Оуата H.,et al., 1996; Boldyrev A., et al., 1999). Функциональное значение этого сигнала в настоящее время .неизвестно, однако он пропорционален, активации нейрона и-: не имеет отношения к сигналу клеточной смерти (Болдырев А.А., 1999; Boldyrev A., et al., 2000). Таким образом, АФК регулируют клеточный рост и участвуют во внеклеточной сигнальной системе, где они являются внутриклеточными сигнальными молекулами (Finkel Т., 1998). Низкий уровень АФК необходим для поддержания клеточной пролиферации. Высокое значение отводится АФК в нормальном функционировании имуннои системы. Продукция простациклина эндотелиальными клетками в метаболических реакциях арахидоновой кислоты* обусловливает важную сосудистую функцию, включающую агрегацию тромбоцитов, регуляцию сосудистого тонуса и регуляцию слипания нейтрофилов.

С другой стороны, известно, что N0 ингибирует некоторые ферменты, включая НАДН-убихинонредуктазу и сукцинат-убихинонредуктазу митохондриальной дыхательной цепи, фермент цикла Кребса аконитазу и скорость-лимитируюший фермент в репликации ДНК-рибонуклеотидредуктазу. Кроме того, N0 также как и супероксид-радикал, пероксид водорода и

гидроксид-радикал способны мобилизовать железо из ферритина, что может привести к нарушению внутриклеточного гомеостаза железа и стимулировать

продукцию активных форм кислорода.

л,

Таким образм, складывается новое представление о двойственной роли

кислорода в живых клетках. С одной стороны, кислород является основным участником метаболизма аэробных организмов, источником метаболической энергии. С другой стороны, кислород является источником реактивных кислородных радикалов (Winrow V.R.et al., 1993). Поэтому "высокая окислительная способность кислорода, необходимая для его функционирования в дыхательной системе, из добра превращается в зло, если принять во внимание возможность "паразитных" химических реакций окисления кислородом различных веществ живой клетки" (Скулачев В.П., 1996).

1.1. 2. Антиоксидантная система клеток

В живых организмах имеется антиоксидантная система, необходимая для контроля за продукцией активных форм кислорода и предотвращения свободнорадикальных реакций. В ее состав входят как ферменты, так и многочисленные низкомолекулярные антиоксиданты или соединения, препятствующие образованию свободных радикалов (Табл. 3). Их согласованная работа держит под постоянным контролем как образование, таки превращение АФК в клетках. Эффективность антиоксидантной системы в норме во многом определяется (1) диетой, содержащей витамины А, Е, С, каротиноиды и минералы; (2) рациональным питанием (3); курением и алкоголем.

Различные антиоксиданты играют в тканях разную роль. Супероксиддисмутаза контролирует клеточный уровень супероксид-аниона, дисмутируя его избыток в перекись водорода. Гидропероксид, если он не

покидает внутриклеточное пространство, служит объектом действия каталазы и глутатионовых ферментов, превращающих его в воду. Белки - хелаторы металлов переменной валентности (трансферрин, лактоферрин и др.) предотвращают их участие в реакциях, в которых они могут служить источником электронов для молекулярного кислорода. Низкомолекулярные антиоксиданты (как гидрофильные, так и гидрофобные) "подбирают" остатки АФК, не прореагировавшие с указанными ферментами.

Из всех ферментов антиоксидантной системы наибольшее распространение имеет супероксиддисмутаза (СОД), которая, по-видимому, представляет наиболее важный уровень клеточной защиты. У эукариот известно несколько изоформ фермента, в числе которых митохондриальная Mn-СОД, цитозольная Cu/Zn-СОД и отличная от нее Cu/Zn-СОД,,определяемая во внеклеточной среде: Растительные объекты содержат в дополнение к ним еще и Fe-зависимую форму СОД. Прокариоты (Streptomices) содержат разнообразные сочетания указанных форм, а также недавно описанную Ni-СОД.

Многие патологии человека, сопровождающиеся и, возможно, вызываемые ростом АФК, протекают на фоне генетически обусловленного дефицита СОД. Таковы боковой, амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера и другие нейродегенеративные заболевания (Olanov C.W., 1993). Восстановление активности мозга после перенесенного инсульта, вероятно, также протекает на фоне пониженного уровня СОД, хотя попытки лечения пациентов введением этого фермента не привели к положительному результату.

Особенностью функционирования СОД является то обстоятельство, что в присутствии избыточного количества Н2О2 она может образовывать гидроксид-радикал (Fridovich I., 1979). При этом свободнорадикальная атака самой белковой молекулы СОД приводит к ее фрагментации и потере активности.

Таблица 3. Антиоксиданты в живых системах

Таким образом, для эффективной работы этот фермент нуждается в присутствии низкомолекулярных антиоксидантов. Этот пример указывает на

необходимость взаимодействия ферментативных и неферментативных компонентов клеточной антиоксидантной системы.

СОД локализована преимущественно в нейронах (Delacourte A et al., 1988). а глутатионпероксидаза и глутатион - в астроцитах (Benzi G. and Moretti A.. 1995).

Глутатион-зависимые антиоксидантные ферменты глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы принимают участие в нейтрализации перекисей, субстратом для которых являются как гидроперекиси липидов, так и Н₂0₂.

В мозге антиоксидантная ферментная система представлена в основном суперокисддисмутазой и глутатион-зависимыми ферментами (Болдырев и соавт., 2001).

Для мозга характерно низкое содержание основных компонентов антиоксидантной защиты [Halliwell, Getteridge, 1999; Зенков Н.К и соавт., 2001] (Табл. 4). В целом, дефицит антиоксидантной системы в мозговой ткани объясняет ее особую чувствительность к продукции свободнорадикальных соединений.

Таблица 4. Активность ферментов антиоксидантной защиты в мозге

Одним из главных природных низкомолекулярных антиоксидантов согласно литературным данным (Ingold K.U. et all, 1987) является витамин Е (а-токоферол, ТФ), который представляет собой липофильное соединение фенольного ряда, способное прерывать цепи свободнорадикальных реакций за счет нейтрализации пероксильных радикалов. Он способен взаимодействовать с липидным пероксилом L0₂* быстрее, чем эти радикалы взаимодействуют с; боковыми цепями жирных кислот или белками:

а-ТосН + LO^# а-Тос* + L0₂

а-ТосН + LO' а-Тос* + LOH.

Повышенное содержание продуктов ПОЛ при дефиците витамина Е в организме может индуцировать гемолиз эритроцитов (Bunyan J. et al., 1960) и агрегацию тромбоцитов (Steiner М., 1987). Важным аспектом молекулярной биологии витамина Е является тот факт, что он необходим как животным, так и человеку для поддержания нормальной структуры и функции ЦНС. Широкому использованию ТФ в экспериментальной и клинической невропатологии способствовали эксперименты, показавшие, что содержание животных на витамин Е - дефицитной диете вызывает увеличение уровня продуктов ПОЛ в головном мозге приблизительно в 2 раза (Yoshida S. et al., 1985).

У животных, находившихся на диете, лишенной витамина Е в течение 9 месяцев, регистрировались изменения структуры аксонов (Schmidt R.E., et al., 1991). Увеличение в организме крыс уровня ТФ приводило к нормализации в ткани мозга продуктов ПОЛ, а также к улучшению психомоторных реакций и снижению утомляемости (Constantinides P. et al., 1986).

У человека дефицит витамина Е приводил к развитию прогрессирующего неврол отческого комплекса, характеризующегося снижением скорости психомоторных реакций, развитием синдрома спинномозжечковой дегенерации со слабостью, атаксией, выпадением рефлексов, офтальмоплегией и миопатией

(Goss-Sampson M.A. et al., 1988). Следует отметить, что действие витамина Е у человека не компенсируется присутствием других антиоксидантов (Ingold K.U., et al., 1987). До настоящего времени остается неясным вопрос о том, почему именно нервная ткань проявляет особую чувствительность к дефициту этого витамина.

а-Токоферол присутствует в ЦНС в достаточной концентрации, однако его содержание в головном мозге ниже, чем в надпочечниках, печени и лейкоцитах (Vatassery G.T. et al., 1984).

Для ткани мозга .млекопитающих характерен высокий уровень аскорбата (витамина С) и глутатиона (трипептид глутамил-цистеинил-глицин) -низкомолекулярных водоростворимых антиоксидантов (Lyrer Р et al., 1991; Rice М.Е. 1995). Наиболее важной функцией этих соединений является нейтрализация реактивных свободных радикалов и поддержание нормального red/ox статуса нервной клетки (Cohen G., 1994).

У большинства млекопитающих аскорбиновая кислота синтезируется в печени и почках, а у человека, приматов и морских свинок аскорбат поступает в организм с пищей (Nishikimi М., 1994). Из крови аскорбат может поглощаться СМЖ, пересекать ГЭБ и в виде окисленного продукта (дегидроаскорбата) попадать в мозг (Lam D.K. and Daniel P.M., 1986).

Содержание аскорбиновой кислоты в мозге в 10 раз превышает его уровень в плазме крови, причем наибольшие количества этого антиокиданта обнаруживаются в сером веществе и гиппокампе (Stamford J.A., 1984). Глутатион, в отличие от аскорбата, локализуется преимущественно в глии (Raps S.P., 1989).

Аскорбиновой кислоте в мозге отводится важная нейропротекторная роль (Rice М.Е , 2000). Она является эффективной ловушкой различных свободных радикалов (Vatassert G.T., 1996). Важной функцией аскорбата является защита

клеток мозга от кислородных радикалов, генерируемых активацией глутаматных рецепторов, поскольку как каинат, так и NMDA могут быть причиной деполяризации митохондрий и увеличения ими продукции супероксид-аниона (Prehn J.H., 1998; Lafon-Cazal М. et ah, 1993). Аскорбат, как и антагонисты глутаматных рецепторов, способны предотвратить формирование отека мозга.

Аскорбат защищает нейроны от окислительного повреждения (Sharma Р., 1997) и снижает уровень генерируемых глутаматом реактивных кислородных радикалов (Hillered L., 1988; Ciani Е., 1996). При этом уровень аскорбата и других низкомолекулярных антиоксидантов падает, и возрастает чувствительность клеток к окислительному повреждению (Lyrer P. et al., 1991).

Низкомолекулярные антиоксиданты сталкиваются с АФК в тех компартментах клетки,, которые по тем или иным причинам лишены антиоксидантных ферментов. Так, распространенной иллюстрацией сказанному является подавление а-токоферолом разветвленных цепных реакций ПОЛ в гидрофобном компартменте клеточной мембраны.

Инициация процесса ПОЛ, происходящая при взаимодействии липидной молекулы с гидроксид-радикалом в отсутствие витамина Е, быстро приводит к разветвленным цепным реакциям образования пероксильных и алкоксильных радикалов. Эти радикалы накапливаются в ограниченном гидрофобном объеме мембранного бислоя, и реакция легко может стать неуправляемой. а-Токоферол является соединением, с высоким сродством восстанавливающим пероксильные радикалы и превращающимся при этом в относительно нереакционноспособный феноксильный радикал. В таком состоянии он может находиться в мембране до тех пор, пока не будет восстановлен аскорбатом в исходное состояние. Пара «витамин Е - витамин С» служит примером согласованного взаимодействия гидрофобных и гидрофильных антиоксидантных молекул в клетке.

Низкомолекулярные антиоксидантные соединения (аскорбат, глутатион.

витамин Е) взаимодействуют как друг с другом, так и с антиоксидантными ферментами - супероксиддисмутазой и глутатинопероксидазой (Cohen G., 1994). Так, аскорбат может предотвращать окисление а-токоферола, окисленный продукт аскорбата (дегидроаскорбат) восстанавливается глутатионом и другими внутриклеточными тиолами, а в некоторых популяциях клеток, включая нервные клетки, - глутатионзависимой дегидроаскорбат-редуктазой, присутствие которого было недавно обнаружено в мозге (Rose R.C., 1993).

В настоящее время список низкомолекулярных антиоксидантов дополнен рядом других соединений, в числе которых каротиноиды, дипептид карнозин, N-ацетилцистеин, таурин, дигидролипоевая кислота, карнитин, мочевая кислота; (Packer L.et al., 1997; Болдырев А.А., 1999).

Карнозин выделяется из этого ряда своими высокими концентрациями и специфической локализацией в возбудимых тканях. Карнозин и родственные ему гистидинсодержащие дипептиды широко представлены в тканях животных, в том числе в мозге (карнозин и гомокарнозин), где эти соединения вовлекается в различные физиологические процессы (Болдырев А.А., 1998). Карнозин выполняет в организме ряд функций, среди которых основными являются антиоксидантные и мембранопротекторные свойства, способность связывать протоны и ионы тяжелых металлов. Карнозин эффективно связывает ионы металлов с переменной валентностью, в том числе железо (Vladimirov Y.A.. 1996). Комплексы карнозина с Си и Zn обладают супероксиддисмутирующей активностью, играющей существенную роль в антиоксидантном действии этого дипептида.

Карнозин эффективно защищает один из наиболее уязвимых мембраносвязанных ферментов мозга Na,K-ATOa3y от воздействия свободных радикалов (Boldyrev А.А., 1988), регулирует активность периотонеальных макрофагов, подавляет активацию NMDA-рецепторов как in vitro, так и in vivo

(Boldyrev A.A. et al, 1999).

Другое эндогенное биологически активное соединение - карнитин и его ацетилированные производные также обладают антиоксидантными свойствами, поскольку способны предотвращать липидное переокисление и восстанавливать в тканях сниженный уровень глутатиона, однако механизмы этого действия остаются неясными (Luo X. et alj 1999).

L-карнитин обнаружен во всех органах и тканях животных и растений. Он синтезируется преимущественно в печени и почках, в другие ткани это соединение поступает с кровью. Впервые наличие карнитина в хмозге было описано Hath P.J. в 1981 году в срезах коры и культуре нервной ткани крыс, а также в препаратах синаптосом мышей (VIетапі М.А., et al., 1994;). Способность карнитина пересекать гемато-энцефалический барьер позволяет ему проникать во все отделы мозга (содержание в клетках мозга составляет 0,1 - 0,2 мМ), максимальное количество этого соединения отмечено в гипоталамусе.

В 1955 году Fritz впервые определил основную функцию карнитина. заключающуюся в транспорте длинноцепочечных жирных кислот из цитоплазмы внутрь митохондрий; где осуществляется процесс их р-окисления. Полагают, что в мозге карнитин также выполняет эту физиологическую роль в метаболизме липидов (Naleez К.А., et al., 1997).

Длительное введение карнитина старым крысам улучшало способность этих животных к обучению и приводило к снижению в гиппокампе липофусцина — пигмента старения, обнаружение которого послужило первым доказательством протекание реакций липидного переокисления в мозге (Luo X. et al, 1999). По-видимому, с этим свойством карнитина тесно связана его способность стабилизировать клеточные мембраны.

Антиоксидантное действие карнитина проявлялось в способности снижать уровень ТБК-продуктов в тканевых гомогенатах коры головного мозга крыс

(Halcak L.et al., 1998), но детали этого процесса не были описаны. Ослабление карнитином индуцированной кардиотоксином активации ПОЛ, регистрируемой по уровню ТБК-реактивных продуктов у крыс, возможно, связано со способностью карнитина улучшать энергетический метаболизм миокарда. (Luo X. et al., 1999).

Антиоксидантные свойства способны проявлять стероидные гормоны, они
входят в состав естественных антиоксидантных систем организма. Так,
эстрогены относятся к группе истинных антиоксидантов (на процессы ПОЛ они
действуют подобно а-токоферолу). Антиоксидантное действие эстрогенов
считают одним из компонентов их вазопротекторного!

(противоатеросклеротического и противоишемического) эффекта.

Экспериментально выявлено ингибирование эстрадиолом процессов ПОЛ в сердце, крови и аорте (Караченцев А.Н, Мельниченко И.А., 1997).

В последние годы внимание ученых привлекла способность природных низкомолекулярных антиоксидантов проявлять в определенных условиях прооксидантное действие. Впервые это было отмечено для аскорбата в условиях in vitro (Halliwell В, 1996), когда этот типичный антиоксидант при низких концентрациях ив присутствии ионов железа оказался способен инициировать ПОЛ благодаря своей способности восстанавливать трехвалентное железо в двухвалентное. Реакция является; обратимой, и известно много. претендентов вновь превратить окисленную молекулу в восстановленную. По-видимому, именно эта легкость превращений в зависимости от окислительного потенциала клетки сделала аскорбат нейропротектором, несмотря на то, что многие млекопитающие (в том числе, все приматы и человек) утратили способность синтезировать это соединение. Аналогичную двойственную роль могут играть глутатион (Болдырев А.А., 1999), липоевая кислота (Packer L., 1995). Одно и то же вещество может быть как ингибитором, так и провокатором процессов

свободнорадикального окисления. Например, образующийся при окислении сс-токоферола феноксильный радикал может стимулировать перекисное окисление в ЛПНП. В то же время, феноксильные радикалы а-токоферола могут участвовать в обрыве цепных реакций перекисного окисления. а-Токоферол ингибирует накопление гидроперекисей липидов в ЛПНП.

Основным механизмом ингибирования окисления ЛПНП является регенерация феноксильного радикала а-токоферола убихинолом и аскорбиновой кислотой, что сопровождается образованием радикалов супероксида и семигидроаскорбата и приводит к «экспорту свободнорадикального состояния» в водную фазу. Возможно, что именно это свойство антиоксидантов было причиной их неоднозначного действия при использовании в терапии ряда заболеваний, сопровождающихся ростом АФК (Henneken С. et al., 1994; Winder А., 1997). Действительно, эффективность действия антиоксидантов как других лекарственных средств определяется дозой, сроками и способом их введения, а также тяжестью патологического процесса.

Система антиоксидантов определяет суммарную антиокислительную активность (АОА) липидов ткани, которая зависит как от относительного количества биоантиоксидантов и их взаимодействия, так и от наличия веществ, способных усиливать или ослаблять действие биоантиоксидантов, а также от присутствия компонентов, способных к радикалообразованию или ускорению окислительных реакций в модельных системах (Бурлакова Е.Б. и соавт., 1982).

Высокий уровень АОА характерен для органов с интенсивным метаболизмом, в частности для тканей головного мозга, поскольку мозг человека является системой, потребляющей значительную часть поступающего в организм кислорода. В условиях, когда антиоксидантные системы не в состоянии нормализовать клеточный уровень АФК, в тканях накапливаются продукты их взаимодействия с клеточными компонентами. Это является

сигналом к вступлению в действие систем клеточной репарации. Метионин сульфоксид редуктазы обращают процесс окисления метионина, протеазы разрушают необратимо окисленные белки, способствуя их замене новообразованными молекулами. Фосфолипазы удаляют поврежденные жирнокислотные хвосты фосфолипидов, а ацил-СоА трансферазы репарируют мембранные структуры клеток. Эндонуклеазы удаляют окисленные нуклеиновые основания, способствуя процессу репарации нуклеиновых кислот. Насколько эти процессы могут, успеть поддержать клеточную целостность -решается соотношением эффективности образования и нейтрализации АФК.

Некомпенсируемое повышение уровня АФК свидетельствует об истощении антиоксидантной системы и грозит клетке опасностью мутагенных изменений. Свидетельством этого является накопление модифицированных липидов (гидроперекиси жирных кислот, МДА) и белков (содержащих S-S связи, карбонилы и другие модифицированные группы), а также фрагментов окисленных нуклеотидов (в наибольших количествах - 8-дигидрогуанозина). Эти метаболиты могут накапливаться в высоких количествах в клетках и тканях, в том числе в крови и моче. Накопление этих продуктов свидетельствует о состоянии окислительного стресса, переживаемого организмом.

1.1.3. Окислительный стресс и мозг

Окислительный стресс - это нарушение баланса между продукцией свободных радикалов и механизмов антиоксидантного контроля за их содержанием. Окислительный стресс сопровождается повышенной скоростью образования свободных радикалов и снижением активности АО системы, что приводит к увеличению уровня радикальных соединений и возможной гибели клетки. (Halliwell В., Gutteridge J.M.C., 1999; Ланкин В.З.и соавт., 2000).

Поскольку молекулярной мишенью для действия свободных радикалов являются липиды, белки и ДНК (Carney J.M. et al., 1996; Chan P.H., 1996; Hayashi Т. et al., 1999).

По ряду причин мозг высоко чувствителен к окислительному стрессу (Halliwell В. and Gutteridge J.M.C., 1999; Aruoma О. and Halliwell В., 1999). Так, составляя всего 2% от общей массы тела, мозг утилизирует 20-25% получаемого кислорода. И этот уровень так велик, что превращение в супероксид-анион радикал даже только 0,1% метаболизируемого нейронами кислорода окажется токсичным для ткани.

Совершенствование методов клеточной нейрохимии позволило продемонстрировать существенное возрастание в мозге целого ряда радикалов при развитии окислительного стресса. Обнаружено возрастание супероксид-аниона и NO-радикала до 100 пМ и 100 нМ соответственно (то есть примерно в 10 раз), а также гидроксид-радикала (до 150 нМ) и пероксинитрита (120 дМ), которые в нормальных условиях обнаруживаются только в следовых количествах (Chiueh С. et al., 1994). Серьезность этого факта нельзя недооценивать, поскольку массированная атака АФК несет сигнал о клеточной смерти.

Первым доказательством протекания свободнорадикальных реакций липидного переокисления в мозге явилось обнаружение липофусцина -пигмента старения, продукта взаимодействия малонового диальдегиад (МДА) с белками (Iry G.O. et al., 1985). Наличие продуктов ПОЛ в мозге было показано в большом числе опытов как in vitro (Dirks R.C. and Flamm M.D., 1982), таким vivo (Cheeseman K.H. et al., 1988).

Взаимодействие гидроксильного радикала с ненасыщенными жирными кислотами в области метиленовых групп, прилежащих к двойным углеродным связям, является одной из основных реакций инициирования ПОЛ в

биологических мембранах (Chvapil М., et al., 1982; Биленко М.В., 1989). Свободнорадикальное окисление липидов принимает участие в нормальной жизнедеятельности клеток нервной ткани и участвует в выполнении ряда таких важных физиологических функций, как проведение возбуждения и способность генерировать потенциал действия, регуляции секреции нейромедиаторов, репарации нервных волокон (Каган В.Е. и соавт., 1983; Прилипко Л.Л. и соавт., 1983). В физиологических условиях свободнорадикальное окисление липидов протекает на низком стационарном уровне, и его интенсивность во многом зависит от пола, возраста организма, а также от сезона, фазы циркадного ритма и ряда других факторов (Tappel A.L., 1973).

Механизм ПОЛ в клетках ЦНС аналогичен механизмам в других.тканях,
однако интенсивность\ процесса здесь значительно выше. Во, многом это
определяется высоким содержанием і в мозге ПНЖК - субстратов ПОЛ. Так
содержание фосфолипидов (ФЛ) в мозге составляет 25% от его сухого веса, что в
1,5 раза больше, чем в печени, и в 3-4 раза больше, чем в сердце. При этом
значительная часть суммарных ФЛ в нервной ткани, представлена их наиболее
легко окисляемыми фракциями: фосфатидилэтаноламином и

фосфатидилсерином, в составе которых половина жирнокислотных остатков является ненасыщенными (O'Brien J.S. and Sampson E.L., 1965; Ansell J.B., 1973). Химический анализ,липидов головного мозга человека показал, что во фракции глицерофосфатидов в сером веществе в 3-6 раз больше высоконенасыщенных ПНЖК, особенно арахидоновой и докозагексаеновой, чем в той же фракции миелина, причем максимальное содержание ПНЖК отмечено в синаптических мембранах, являющихся мишенью для АФК.

В нервной ткани, как и в любой другой, существуют два пути окисления ПНЖК. Первый - это неферментативное аутоокисление в присутствии ионов металлов с переменной валентностью (двухвалентного железа или меди) (Chan

P.H. et al., 1982), а второй - ферментативное окисление (преимущественно арахидоновой кислоты) липооксигеназным (с образованием перекисей липидов) или циклооксигеназным (с синтезом простагландинов и лейкотриенов) путем (Asano Т. et al., 1985; Dempsey R.J. et al., 1986). Высокий уровень арахидоновой кислоты в составе мембранных липидов мозга делает этот путь весьма существенным для ткани мозга.

Высокая интенсивность процессов ПОЛ в ЦНС определяется также высокими концентрациями катализаторов свободнорадикальных реакций -ионов металлов с переменной валентностью, в основном железа и меди.. Присутствие железа в ЦНС необходимо для нормального функционирования ферментов, регулирующих метаболизм моноаминов, и для работы дофаминовых рецепторов (Halliwell В, Gutteridge J.M.C, 1984.). Большая часть железа находится в связанном комплексе с белками (в том числе - с ферментами). Нарушения кислородного метаболизма приводят к ацидозу, который' способствует высвобождению из связи с белками ионов железа, которые активируют образование супероксид-аниона кислорода и становятся катализаторами свободнорадикальных реакций.

Высокий уровень ПОЛ в ЦНС обусловлен также и низкой активностью специализированных ферментных систем и недостаточным уровнем эндогенных низкомолекулярных антиоксидантов. Таким образом, любое нарушение метаболизма мозга может привести к развитию свободнорадикальных реакций с усиленным образованием и накоплением продуктов этих реакций (Владимиров Ю.А., Арчаков A.M., 1972). Предполагается, что к запуску свободнорадикального перекисного окисления в мозге приводит возрастание уровня гидроксид-радикала, способного атаковать двойные связи мембранных жирных кислот.

Метаболизм фосфолипидов в митохондриях и других клетках мозга является главной причиной мембранной дезорганизации, увеличения продукции ПНЖК и. формирования свободных радикалов. В результате окислительной атаки ПНЖК образуются различные токсические продукты свободнорадикальных реакций (Ikeda Y. and Long D.M., 1990; Kehrer J. P., 1993). Окисление мебранных фосфолипидов обладает способностью к самоускорению из-за возникновения разветвленных цепных реакций. Некомпенсированная активация ПОЛ либо вследствие прямого взаимодействия продуктов ПОЛ с мембраносвязанными ферментами и рецепторами, либо вследствие изменения, свойств липидной матрицы (образования гидрофильных пор и каналов, конформационные изменения мембранных белков) приводит к нарушению проницаемости мембран, работы ионных насосов, ферментов и рецепторов,. к снижению электрической стабильности мембраны и потере ею барьерных свойств.

Основными конечными молекулярными продуктами окисления фосфолипидов являются гидроперекиси жирных кислот, гидроксиноненали, малоновый диальдегид. В нормальных условиях концентрация этих соединений в тканях чрезвычайно мала, но при нарушении кислородного метаболизма создается ситуация окислительного стресса, характеризующаяся стойкой повышенной продукцией АФК. Одним из его проявления является накопление вышеназванных продуктов (Keller J.N. et al., 1997; Kruman Г. Et al., 1997). Гидроперекиси липидов нарушают регулярную упаковку мембранного бислоя и вызывают образование в мембране дефектных зон. Гидроксиноненали обладают способностью образовывать аддукты с фосфолипидами, белками и нуклеиновыми кислотами, которые обладают токсическими свойствами. Малоновый диальдегид. взаимодействуя с белками и нуклеиновыми кислотами, вызывает образование внутри- и межмолекулярных сшивок, причем это его

свойство активируется при ацидозе. Следствием этого является повышение микровязкости (ригидности) мембран (Chen J.J., and Yu В.Р., 1994). В итоге ПОЛ быстро приводит к нарушению целостности клеточных мембран, несовместимому с жизнеспособностью клеток.

Множество белковых соединений подвергается окислению, в том числе и рецепторы, факторы транскрипции, митохондриальные ферменты, аминокислоты и; т. д. В окислительную модификацию белков вовлекаются различные аминокислотные радикалы. Амино- и сульфгидрильные группы белков особенно легко окисляются АФК и гипохлоритом. Кроме цистеина, в белковых молекулах легко окисляются лизин, тирозин и карбоксильные группы дикарбоновых аминокислот. Белки легко, взаимодействуют с сахарами, что приводит к накоплению гликированных продуктов. Гликирование белков обычно; осуществляется в результате прямого взаимодействия Сахаров с аминогруппами лизина (наиболее легко гликируются те радикалы лизина, соседней группой которых является пролин). В результате образуются Шиффовы основания, которые при* перегруппировке превращаются в стабильные соединения (продукты Амадори). Вместе с продуктами перекисного окисления липидов они накапливаются в липофусциновых комплексах, образующих в подкожной клетчатке характерные "старческие" пятна.

Радикальная атака нуклеиновых оснований в ДНК и РНК приводит к гидроксилированию и нарушает регулярную упаковку двойной спирали ДНК или стабильность РНК. Это вызывает фрагментацию молекул нуклеиновых кислот, которые с трудом поддаются репарации. Фактически, окислительная модификация нуклеиновых кислот в клетках с активным кислородным метаболизмом ежедневно происходит в количествах, превышающих десятки тысяч повреждений. Тот факт, что подавляющее большинство из них не имеет

40,

РОССИЙСКАЯ ГО СУДАРСТВЕН ПАЯ СИВЛИОТЕКА I

последствий для жизнедеятельности организма, отражает наличие в клетках специальной репаративной системы (Packer L., 1995а).

Основным эндогенным продуктом окисления нуклеиновых оснований является 8-дезоксигуанидин (8-ДГ), уровень которого характеризует степень окислительного повреждения нуклеиновых кислот. Высокий уровень 8-ДГ определяется при окислительном стрессе в крови и моче. Повреждения белков и нуклеиновых кислот могут быть не менее, а даже более существенны для клетки.. Как правило, эти процессы в присутствии АФК начинаются еще до того, как развивается окислительное повреждение мембранных липидов (Болдырев А.А., 1995; Болдырев А.А., Куклей М.Л., 1996).

Таким образом, в физиологических условиях свободные радикалы продуцируются в ходе различных метаболических процессов. В норме- в биологических системах поддерживается баланс между генерацией и нейтрализацией АФК, который регулируется эндогенной антиоксидантной системой. В условиях, когда антиоксидантная система не в состоянии нормализовать клеточный уровень АФК, в тканях накапливаются продукты их взаимодействия с клеточными компонентами. Нарушение баланса между продукцией свободных радикалов и механизмов контроля за их содержанием приводит к развитию окислительного стресса. Продукция свободных радикалов в нейронах может усиливаться в результате различных неблагоприятных факторов, включающих нарушения кровообращения, а также при изменении условий функционирования или выявлении генетически обусловленных дефектов. АФК являются химически нестабильными и высокореактивными соединениями, что и обусловливает их способность к атаке и повреждающему воздействию основных клеточных компонентов - белков, липидов и ДНК.

Таким образом, свободные радикалы являются медиаторами тканевого повреждения и могут индуцировать каскад патофизиологических процессов.

приводящих к дисфункции и клеточной смерти (Kehrer J.P., 1993) при различных патологических состояниях, включая ишемию и реперфузию (Davies M.J;, 1989).

1.2. Каскад патофизиологических событий при нарушениях мозгового

кровообращения

Известно, что нарушения кровообращения головного мозга приводят к развитию церебральной ишемии с инициацией каскада биохимических реакций, приводящих к развитию тканевого повреждения (Mattson М.Р. and Mark R:l, 1996; Dirnagl U. etal., 1999; Mattson М.Р. et al., 2000). В ишемизированных нейронах, лишенных кислорода и глюкозы, быстро снижается уровень АТФ и, возможно, креатинфосфата, что сопровождается значительным увеличением концентрации аденозиндифосфата (АДФ) и аденозинмонофосфата (АМФ) (Rehncrona S.et al., 1981; Wallimann Т. et al., 1992). Уже в течение первых 1-2 мин глобальной ишемии мозга уровень АТФ снижается на 90%, а через 5 мин ишемии наблюдается почти полная потеря АТФ (Martin R.L.et al., 1994). Важным следствием падения АТФ является активация гликолиза и, в результате - нарастание клеточного ацидоза. Снижение энергетического метаболизма в условиях ацидоза мозга может быть существенным условием необратимых патохимических процессов в нервных клетках (Siesjo В.К., 1988).

Как при глобальной, так и при очаговой ишемии мозга наблюдаются выраженные нарушения ионного гомеостаза. Наступает длительная мембранная деполяризация, происходит ингибирование Ка,К-АТФазы, обусловливающая увеличение концентрации Na⁺ и снижение концентрации К⁺ внутри клетки (Wallimann Т. et al., 1992). Во время глобальной ишемии наблюдается резкое падение внеклеточного Са в первые 60-90 с от начала инсульта (Xie Y. et al:, 1995), когда он входит во внутрь нейронов через кальциевые каналы и проникает

в митохондрии (Taylor С.Р et al., 1999). Повышение внутриклеточного кальция может быть одной из главных причин некротической гибели нейронов (Choi D.W., 1995; Kristian Т., and Siesjo В.К., 1996) как при глобальной, так и очаговой ишемии мозга у крыс (Silver LA., and Erecinska М, 1992).

Значительное повышение уровня Са все еще отмечается спустя 6-24 ч после глобальной ишемии в митохондриях гиппокампа песчанок (Dux Е. et al., 1987) и крыс (Zaidan Е. and Sims N.R., 1994) Блокирование Са²⁺-каналов нимодипином оказывает защитное действие против ишемического повреждения, при этом зона инфаркта уменьшается на 50% (Mossakowski M.J. and Gadamski R., 1990).

Кальций играет центральную роль во многих значимых физиологических процессах, включая высвобожение трансмиттеров и синаптическую пластичность. Вместе с тем, нерегулируемое увеличение концентрации свободных ионов кальция в нейроне приводит к инициации ряда клеточных; и цитоплазматических процессов и развитию глубоких тканевых повреждений, поскольку активация протеолитических ферментов вызывает деградацию белков цитоскелета (Mattson М.Р. et al., 2000).

Существенным фактором повреждения клеток мозга, вызванного его ишемизацией, является увеличение уровня внеклеточного цинка (Koh J.Y et al., 1996), который выявляется во всех дегенеративных нейронах. Высвобождение ионов цинка в межсинаптическую цель в условиях ацидоза рассматривается как нейротоксический процесс (Choi D.W and Koh J.Y, 1998). Показано, что цинк может индуцировать гибель нейронов по пути как апоптоза, так и некроза (Manev Н et al., 1997).

Увеличение внутриклеточного уровня Na⁺ происходит в первые 5 мин аноксии/ишемии. Лекарства (ламотриген, тетрод отоксин, лидокаин). блокирующие вход Na~, предотвращают ионные изменения как при очаговой,

так и при глобальной ишемии. Предполагается несколько путей, по которым массированный вход Na⁺ может способствовать повреждению в острой фазе инсульта, поскольку он, как и СГ, являются причиной внеклеточного отека (Lisko P.G. et al., 1994; Crumrine R.C et al., .1997).

Ингибирование Ка,К-АТФазы приводит к глубокой аноксической деполяризации нейронов и глии, которая в центре ишемического очага может быть необратимой (Chen Q et al., 1993). Аноксической деполяризации при ишемии посвящено много обзоров (Lauritzen М., and Hansen A.J., 1992; Xie Y. et al., 1995).

Таким образом, падение АТФ, аноксичесакя деполяризация и вход в цитозоль ионов Na⁺ - три самые ранние ишемические нарушения; падение рН и генерация свободных радикалов, сопровождающиеся структурными изменениями в митохондриях, наступают позже.

Аноксическая деполяризация является критическим моментом синаптического высвобождения глутамата (Nicholls D. and Attwell D., 1990; Choi D.W., 1996). В последние 20 лет накоплены данные об участии экзайтотоксических процессов в патогенезе ишемического повреждения мозга. Недостаток АТФ в условиях ишемии мозга является причиной снижения активности глутаминсинтетазы, катализирующей превращение глутамата в глутамин, что приводит к увеличению концентрации свободного глутамата (Coyl J.T., et al., 1982; Benveniste H et al., 1984; Rothman S.M. and Olney J.W., 1986; ). Уже через 1-2 мин после начала ишемии начинается повышение уровня глутамата (Baker A.J., et al., 1995) до 16-30 мМ, в то время как в норме его уровень составляет 1-5 мМ (WahlF. et al., 1994).

Будучи мощным нейротоксином, глутамат играет важную роль в повреждении нервной ткани во время ишемии (Garthwaite G. et al., 1992; Lafon-Cazai M. et al., 1993; Strijbos P.J.L.M. et al., 1996; Ankarcrona M. et al., 1996).

Диффузия глутамата во внеклеточное пространство может
способствовать распространению деполяризации (периинфарктная

деполяризация). В то же самое время затрудняется энергозависимый пресинаптический захват возбуждающих аминокислот за счет торможения Na,K-АТФазы пресинаптических мембран, что увеличивает накопление глутамата во внеклеточной жидкости. Активация ионотропных NMDA-рецепторов и метаботропных глутаматных рецепторов приводит к перегрузке нейронов ионами кальция (Olanov C.W., 1993). АМРА-рецепторы активируют каналы, проницаемые для натрия и калия, и вход натрия через эти (или каинат-зависимые) каналы активирует потенциал-зависимые Са-каналы. Дополнительным результатом активации этих рецепторов является внутриклеточная продукция различных АФК, главным образом супероксид-аниона и гидроксид-радикала, а также активация NO-синтазы (Болдырев А.А., 2000). Как результат такой гиперактивации, ионы натрия и хлора входят в нейроны, что приводит к развитию отека мозга, регистрируемого на компьтерной или магнитно-резонансной томографии головного мозга и является одним из решающих показателей того, как переживет пациент первые часы после инсульта.

В период рециркуляции в присутствии кислорода глутамат становится еще более токсичным (Dubinsky J.M. et al., 1995). Поэтому прямым терапевтическим подходом в этих условиях должно было бы быть блокирование глутаматных NMDA-рецепторов. Применение антагонистов NMDA до или во время окклюзии СМА (на модели очаговой ишемии мозга) продемонстрировало эффективную нейропротекцию. Блокаторы Ыа⁺-каналов (лидокаин, тетродотоксин, ламотриген) полностью ингибируют высвобождение глутамата при ишемии, а блокаторы кальциевых каналов снижают высвобождение глутамата на 50% (Lisko P.G. et al., 1994). Следует отметить, что высвобождение

глутамата при глобальной и очаговой ишемии чрезвычайно зависит от температуры (Baker C.J. et al., 1995; Zornow M.H, 1995): снижение в стриатуме и гиппокампе температуры на 2-4С (от 37С до 33С) приводит к редукции высвобождения глутамата в несколько раз.

Однако терапевтическое окно для действия антагонистов NMDA-рецепторов ограничено 1-2 часами после окклюзии артерии. Поэтом}' результаты исследований, касающихся действия антагонистов NMDA при ишемии противоречивы. В одних работах введение антагонистов NMDA на 50% снижает повреждения нейронов в зоне ишемической полутени у крыс (Kuwahara O.et al., 1992), особенно в сочетании с гипотермией. В других публикациях не было обнаружено протективного действия антагонистов NMDA (Sheardown MJ et al., 1993). He обнаружено защитного действия антагонистов на инфарктную зону, у крыс (Buchan A.M. et al., 1992a) и на модели тромботического инсульта (Yao Н et al., 1994). Из-за противоречивости полученных результатов трудно оценить эффективность влияние антагонистов NMDA как возможных лекарственных препаратов при экспериментальной ишемии мозга.

В клинике одной из важных терапевтических стратегией является нейропротекция, направленная на снижение чувствительности ткани мозга к ишемии (Lee J.-M.et al., 1999). В литературе обсуждаются нейропротекторные подходы, сфокусированные главным образом; на блокировании экзайтотоксичности, поскольку избыточное высвобождение глутамата является триггером нейрональной смерти (RothmanS.M. and Olney J.W., 1986). В обзоре Jin-Moo Lee et al., (1999) описано более 30 различных клинических испытаний, которые включали применение как прямых (антагонисты глутаматных рецепторов), так и непрямых (электро-зависимые блокаторы Na и Са -каналов) блокаторов экзайтотоксичности. И, несмотря на то, что применение антагонистов NMDA-рецепторов снижало гибель нейронов в некоторых

экспериментальных моделях ишемии мозга (Albers G.W. et al.,1992), созданные на их основе лекарственные препараты в клинике, в большинстве случаев, оказались неэффективны. Возможно, что причиной неудачных клинических испытаний является то, что этот механизм не является преобладающим в гибели нервных клеток. Возможно, это связано с выполнением глутаматом нейротрансмиттерной функции в мозге. И, хотя блокирование глутаматных рецепторов защищает от экзайтотоксичности, оно может иметь ряд нежелательных эффектов, таких как psychotomimesis, угнетение дыхания или нарушение сердечно-сосудистой регуляции, что показано в некоторых клинических испытаниях.

В ряде работ показано положительное влияние антиоксидантов на степень высвобождения глутамата. Супероксиддисмутаза (СОД) и маннитол способны на 60% снижать высвобождение глутамата из срезов гиппокампа, обусловленное ишемией в опытах in vitro (Nanri К et al., 1998.'.В опытах in vivo применение СОД в комбинации с каталазой на 80% ингибировало выход глутамата и ГАМК при глобальной ишемии мозга (O'Regan M.H. et al., 1997). Эти данные указывают на существенную связь высвобождения глутамата и генерации свободных радикалов во время ишемии.

Наряду с глутаматом во внеклеточном пространстве во время ишемии значительно увеличивается содержание моноаминов, ацетилхолина, ГАМК, норадреналина (Kumagae Y. and Matsui Y., 1991; Gustafson I., et al., 1991). Гипоксия приводит к активации кислород-зависимые ферменты, включающиеся в синтез катехоламинов (тирозин- и триптофангидроксилазы) и ацетилхолина (холинацетилтрансферазу ) (Zivin J.A. et al., 1986). В дальнейшем катехоламины могут подвергаться аутоокислению с генерацией высокотоксичных свободных радикалов. Кроме того, высвобождение катехоламинов может провоцировать накопление Н₂Ог с участием МАО после глобальной ишемии у крыс (Simonson

S.G et al., 1993). Показано, что в адренергических нейронах 6-гидроксидофамин может служить медиатором в процессе продуцирования свободных радикалов (Graham D.G. et al., 1978). Экзайтотоксичность глутамата проявляется ив экспрессии; генов, которые инициируют постишемическое воспаление и другие патогенетические процессы, вызывающие ишемическое повреждение.

Эксперессию ряда клеточных генов вызывают и другие факторы, сопровождающие ишемию - ацидоз, гипоксия, гипогликемия. При этом пластичность мозга возрастает, и клетки начинают синтезировать белки циклины, свойственные этой ткани в период раннего эмбриогенеза. Таким образом появляется GAP-43 (белок цитоскелета), аксональные белки, ассоциированные с ростом дендритов (MAP 2), белки филаментов (нектины) и регулятор клеточного цикла - циклин D-1. Все они начинают синтезироваться;в зоне ишемической полутени на второй день инфаркта мозга. Это обстотельство отражает нестабильность клеточного генома в этой зоне. Такая ситуация часто приходит в противоречие со стремлением врачей уменьшить объем зоны повреждения, потому что одновременно с этим подавляется и способность мозга к репарации.

Поврежденными клетками мозга продуцируются такие медиаторы воспаления, как фактор активации тромбоцитов, фактор некроза опухолей (TNF) и различные интерлеикины, которые активируют микроглию и вызывают инфильтрацию лейкоцитов в эндотелий через гемато-энцефалический барьер. В результате этого индуцируется адгезия молекул на поверхности клеток эндотелия. Адгезированные молекулы легко взаимодействуют с поверхностью рецепторов нейтрофилов, которые, в свою очередь, прилипают к эндотелию, пересекают сосудистую стенку и проникают в паренхиму мозга (Siesjo В.К. et al., 1995). Макрофаги и моноциты следуют за нейтрофилами в ишемический мозг, где они обнаруживаются даже спустя 5-7 дней после ишемии (Iadecola С,

1997). Хемокины продуцируются в поврежденном мозге и становятся проводниками миграции воспалительных клеток через ГЭБ к мишени. Клетки мозга также включаются в воспалительный ответ. Через 4-6 ч после ишемии астроциты становятся гипертрофированными, белые клетки микроглии прекращают выполнять, свои функции, что типично для активированной микроглии. Эти процессы развиваются в зоне ишемической полутени спустя 24 ч после окклюзии СМА и свидетельствуют о развитии постишемических процессов воспаления в ишемизированном мозге.

В последние годы развивается новое направление - изучение роли лейкоцитов в ишемическом повреждении. Показано (Kochanek P.M., and Hallenbeck J.M., 1992; Clark W.M., and Zivin J.A., 1997), что клетки белой крови вовлекаются в процессы ишемического повреждения мозга. Об этом свидетельствует появление нейтрофилов в ишемической ткани и обнаружение их повреждающего действия при накоплении в тканях мозга, а также положительный эффект препаратов, предотвращающих накопление или активацию нейтрофилов (Weiss S.J., 1989).

Аккумуляция нейтрофилов обнаруживается в инфарктной зоне уже через 24 ч после очаговой ишемии (Kato Н et al., 1996; Yanaka К. et al., 1997). Полиморфноядерные лейкоциты накапливаются в кровеносных сосудах мозга начиная с 4 часа ишемии (Kochanek P.M., and Hallenbeck J.M., 1992; Garcia J.H. et al., 1994) у обезьян и начиная с 6-го часа - у людей с ишемическим инсультом (Akopov S.E et al., 1996). Значительная инфильтрация их в паренхиму выявляется спустя 12 ч после ишемии, и этот процесс сопровождается клеточным некрозом (Garcia J.H., et al., 1994; Zhang R.L. et al., 1994). Лейкоциты могут инициировать токсические реакции,. включающие продукцию свободных радикалов ЫАДРН оксидазой, гипохлорита - миелопероксидазой, а также вызывать активацию протеаз (Matsuo Y et al., 1995; Jaeschke H., and Smith C.W., 1997). Полагают, что

активация лейкоцитов при ишемии индуцируется цитокинами, синтезируемыми в клетках эндотелия и глии, которые могут активировать свободнорадикальные реакции и продукцию N0 паренхимальной тканью (Chao С.С et al., 1996).

Нейтрофилы являются потенциальным источником свободных радикалов как во время, так и после очаговой ишемии (Matsuo Y et al., 1995). Макрофаги эффективно продуцируют супероксид-анион и NO-радикал с формированием высокореактивной молекулы пероксинитрита в микроглии во время дыхательного взрыва.

Постишемическое воспаление может способствовать повреждению ткани мозга по нескольким механизмам. На экспериментальной модели ишемии мозга у золотистых хомячков и у больных с ишемическим инсультом обнаружено, что инфильтированные нейтрофилы продуцируют NO-синтазу, генерирующую избыточное (токсическое) количество NO-радикала, при этом ингибирование NO-синтазы снижает степень повреждения мозга. Кроме того, нейрональная экспрессия циклооксигеназы-2 - «медиатора ишемического повреждения», приводит к образованию супероксида и токсических простаноидов (Barone F.C. et al., 1992).

Одним из факторов, способствующим проявлению токсического действия свободных радикалов, является активация фактора транскрипции (NFkB), которая блокируется антиоксидантами (Clemens J.A et al., 1998). Аспирин и другие салицилаты также полностью блокируют активацию NFkB и защищают нейроны от глутаматной токсичности (Grilli М. et al., 1996). В свою очередь, активаторами NFkB являются цитокины, регуляция которых нарушается уже на ранних сроках ишемии и реперфзии. Воспаление характеризуется высвобождением группы цитокинов из поврежденной ткани (Flohe L., et al., 1985; Hurst J., and Barrette W.C. Jr, 1989). Уровень цитокинов в эндотелии и микроглии быстро повышается во время ишемии (Degraba T.J., 1998; Zhang Z.G.

et al., 1998), а высвобождаются они главным образом из макрофагов. Ишемические нейроны продуцируют цитокин TNFa (фактор некроза опухолей), способный усиливать ишемическое повреждение (Вагопе F.C.etal., 1998) путем действия на электрон-транспортную цепь митохондрий и увеличения уровня свободных радикалов (Vanantwerp D.J et al., 1998). Цитокины являются стимуляторами генерации свободных радикалов (Goossens V. et al., 1995). Для предотвращения этого процесса необходимо ингибировать высвобождение провоспалительных щгтокинов (таких, как фактор некроза опухолей) из микроглии или астроцитов, которые могут повышать адгезию лейкоцитов на эндотелии и способствовать формированию отека (Betz A.L.et al., 1995; Li N.X., and KarinM., 1999).

Хотя роль фактора некроза опухолей до конца не известна, предполагают, что этот цитокин может оказывать лечебное действие на поврежденный ишемизированный мозг благодаря своей способности активировать антиоксидантные ферменты. (Giulian D., 1997).

Воспалительные реакции могут продолжаться до нескольких недель после ишемического повреждения. Из этого видна необходимость терапевтического вмешательства в ишемический инсульт, поскольку провоспалительные факторы играют центральную роль в регуляции защитных механизмов против инсульта и воспаления (Li N.X., and Karin М., 1999). Эта тарапия может включать препараты, снижающие инфильтрацию нейтрофилов; ингибирующие ферменты (NO-синтазу и циклооксигеназу-2), которые продуцируют токсические медиаторы повреждения, что открывает перспективу использования противовоспалительной терапии при ишемическом инсульте.

Приток свободного кальция в цитозоль может привести к активации Са-зависимых фосфолипаз. которые высвобождают свободные жирные кислоты из глицерофосфолипидов, составляющих около 80% всех фосфолипидов нервной

ткани (Slater T.F.,. 1984: Kinouchi H.et al., 1990). Метаболизм фосфолипидов в митохондриях и других клетках мозга в условиях ишемии мозга является главной причиной мембранной дезорганизации, увеличения продукции ПНЖК (арахидоновой, олеиновой, пальмитиновой, стеариновой) и формирования свободных радикалов.

Первое сообщение о быстром повышении уровня ПНЖК в первые 5 мин глобальной ишемии сделал N. Bazan в 1970 году. Согласно его данным, через 15 мин от начала ишемии в мозге в 8-Ю раз повышается уровень свободных ПНЖК. В дальнейшем эти данные были подтверждены исследованиями на различных моделях ишемии; мозга и разных видах животных (Sun G.Y et al., 1992). При очаговой ишемии увеличение ПНЖК в первые 15 мин длительной 60 мин окклюзии СМА происходит в 4-Ю раз (Zhang Y.P. and Sun G.Y., 1995). Если через 1 час ишемия становится обратимой, то уровень ПНЖК возвращается к норме, но от 16-24 часа реперфузии вновь повышается. Высвобождение ПНЖК из фосфолипидов обусловлено фосфолипазами Аг и С (Sun G.Y. et al., 1988, 1992), при условии увеличения Са²⁺. Возможно, что продукцию жирных кислот и аккумуляцию Са²⁺ усугубляет фактор активации тромбоцитов (PAF), что также имеет важное значение в ишемическом повреждении (Lindsberg P.J. et al., 1991).

Во время глобальной и очаговой ишемии происходит высвобождение ПНЖК, включая арахидоновую кислоту (АК) (Nakano S. etal., 1990), которая начинает особенно активно метаболизировать в ходе глобальной ишемии. Известно, что в нормальном мозге содержится небольшое количество свободной арахидоновой кислоты (5-20 нмоль/г ткани). Под влиянием активированной фосфолипазы Аг арахидоновая кислота высвобождается из мембранных фосфолипидов и индуцирует значительные биохимические изменения ишемизированных клеток мозга (Dempsey R.J. etal., 1986; Kinouchi Н., 1990). Метаболизм АК приводит к образованию простагландинов (ПГ), тромбоксанов

(ТК) и лейкотриенов (ЛТ) (Wolfe L.S., 1982; Moskowitz M.A..et al., 1984). Этот процесс сопровождается генерацией свободных радикалов как побочных продуктов реакций АК. В дальнейшем ПГ, ТК и ЛТ включаются в различные физиологические и патологические процессы, такие как воспаление, хемотаксис, агрегация тромбоцитов и гормональные эффекты.

Фермент циклооксигеназа-2, активирует метаболизм простагландинов - в 3 раза повышается уровень PGE2 в момент максимального повышения этого фермента. В экспериментах показано, что блокаторы продукции PGE₂ на 30-50% снижают зону инфаркта: (Nogawa S et al., 1997). Накопление эйкозаноидов происходит в ходе окислительного метаболизма арахидоновой кислоты (Katsuki Н. and Okuda S., 1995) по циклооксигеназному или липооксигеназному пути, что сопровождается продукцией супероксид-анион радикала или ОН-радикала (Kuehl F.A. and Egan R.W., 1980). Следовательно, основным механизмом накопления эйкозаноидов является индуцированная ишемией экспрессия циклооксигеназы-2 (Nakayma М. et al., 1998).

Окислительный метаболизм АК, обусловленный ишемией, приводит к генерации свободных радикалов особенно бурно в период реоксигенации. Содержание АК остается повышенным в регионе СА1 в течение 24 часов после 5 мин ишемии (Abe К. et al., 1991), что свидетельствует о пролонгированной генерации ПНЖК в чувствительных к ишемии областях мозга, играет важную роль в механизме повреждения и сопровождается ранним ингибированием митохондриального дыхания (Chan Р.Н et al., 1982). Активация фосфолипазы А₂ и циклооксигеназы в этот период вызывает усиленную генерацию различных свободных радикалов, продукцию липидных перекисей и повреждение мембран. Следовательно, метаболизм АК можно рассматривать как источник свободных радикалов во время и после глобальной ишемии. Однако фармакологических

препаратов, которые могли бы приостановить этот процесс в мозге, не существует.

В настоящее время установлено, что фосфолипазы играют значительную роль в функционировании мембранных структур мозга, поскольку интенсивность защиты от токсических продуктов восстановления кислорода во многом определяется структурной организацией мембран. Активация фосфолипаз, сопровождающаяся накоплением в мембранах продуктов их функционирования, приводит к модификации липидного бислоя мембран нервных окончаний, что, в свою очередь, ведет к изменению физико-химических параметров синаптических мембран - трансмембранного потенциала и микровязкости липидного бислоя. В итоге, окисление ПНЖК, протекающее по свободнорадикальному механизму, способствует нарушению целостности нейрональных мембран и может стать реаальной причиной их гибели (Edgar A.D. et al., 1982; Rehncrona S. et al., 1982; Adesuyi S.A. et al., 1985; Chan P.H. and FishmanRA., 1985).

Результатом свободнорадикальной атаки во время ишемии и в постишемическом периоде является ингибирование белкового синтеза в нейронах, локализованных в чувствительных к окислительному стрессу регионах мозга. Так, у песчанок синтез белка в области СА1 гиппокампа составил 30% от базального уровня через 24 ч после ишемии (Fukuta S et al., 1993; Widman R et al., 1993). Это процесс зависим от изменений энергетического и ионного баланса (Raley-Susman К.М. and Lipton P., 1990). Условия, приводящие к ингибированию белкового синтеза, заключаются в увеличении цитозольного Са²⁺ и генерации свободных радикалов (Abe Н. and Nowak T.S, 1996).

При окислении белков образуются карбонильные группы или дисульфіиньїе сшивки (Stadtman E.R., and Oliver C.N, 1991). Свободные

радикалы ингибируют наиболее важные ферменты, включая №,К-АТФазу (Elmoselhi А.В. et al., 1994; Bodyrev, 2002) и Са-АТФазу, креатинкиназу (Zaidan Е and Sims R., 1993), некоторые митохондриальные дегидрогеназы (Zhang Y et al., 1990).

Продукция свободных радикалов и/или пероксинитрита начинает лимитировать синтез белков. Протеолиз, развивающийся во время ишемии, также является причиной клеточной смерти как в ишемическом очаге, так и в прилегающей области (пенюмбре) (Zhang Y.-L et al., 1996). Са²⁺-зависимая протеаза (кальпаин) участвует в тканевом повреждении как при очаговой, так и при глобальной ишемии (Saido Т et al., 1994). Он атакует цитоскелетные белки, что приводит к снижению постсинаптической плотности (Dosemeci A. and Reese T.S., 1995). Это заключение было сделано на основании успешного применения ингибиторов кальпаина (Bartus R.T, 1997), терапевтическое окно действия которых составляет 6 ч после очаговой ишемии (Markgraf C.G. et al., 1998).

Свободнорадикальная атака приводит к расщеплению ДНК с последующей активацией PARP - Poly(ADP-ribose)polymerase, ядерного фермента, активирующегося только при разрыве цепей ДНК (Szabo С, 1996). Активация этого фермента играет критическую роль в повреждении, обусловленном очаговой ишемией. Для предотвращения блокады PARP используют различные классы лекарственных препаратов (Zhang J. et al., 1998), включая мочевую кислоту как ловушку пероксинитрит-радикалов (Yu Z.F., et al., 1998).

В течение последних пятнадцати лет рядом авторов была выдвинута концепция о существенной патогенетической роли свободнорадикальных реакций липидного переокисления в повреждении клеток мозга, обусловленном его ишемией (Flamm E.S. et al., 1978; Halliwell В. and Gutteridge J.M.C., 1985; Cao

W. et al., 1988; Watson B.D. et al., 1988). В настоящее время эта гипотеза приобретает все большее подтверждение.

В опытах in vitro на культуре клеток нервной ткани в системе генерации свободных радикалов отмечалась деструкция мембранных фосфолипидов с сопутствующим высвобождением свободных жирных кислот (СЖК), увеличением продуктов липидного переокисления и снижением уровня эндогенных антиоксидантов. Активация процесса ПОЛ сопровождалась повреждением ткани мозга, что было подтверждено гистологическими и ультраструктурными исследованиями.

Повреждающее воздействие кислородных свободных радикалов на эндотелиальные клетки гемато-энцефалического барьера (ГЭБ), нейроны и глию было продемонстрировано ив морфологических исследованиях. Результаты этих исследований указывают на повреждающее действий свободных радикалов на ткань ЦНС (Schmidley J.W., 1990а).

Наряду с увеличением концентрации субстратов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в зоне ишемии нарастает интенсивность функционирования систем генерации активных форм кислорода, накапливаются прооксиданты -стимуляторы ПОЛ (Abe К. et al., 1988; Floyd R.A., 1990). Эти условия сочетается со снижением активности антиоксидантных ферментов и нарушением функционирования физиологических систем защиты от повреждающего действия радикалов кислорода (Cino М. and Maestro R.T., 1989).

В ряде исследований, выполненных на различных моделях ишемии мозга, показано значительное снижение уровня эндогенных антиоксидантов, происходящее при одновременном накоплении продуктов липидного переокисления. Истощение уровня эндогенных антиоксидантов и нарушение ферментативных механизмов антирадикальной защиты приводит к

неуправляемой и некомпенсированной интенсификации ПОЛ (Cino М. and Maestro R.T., 1989).

Продукция свободных радикалов увеличивается во время как глобальной, так и очаговой ишемии мозга. Показано, что при глобальной ишемии формирование свободных радикалов начинается сразу после окклюзии сосудов мозга (Tominaga Т. et al., 1994; Olesen S.P et al., 1997). Методом ЭПР зарегистрирован сигнал, измеренный в коре, гиппокампе и стриатуме, который свидетельствует о 10-кратном увеличении уровня свободных радикалов в течение 15 мин 4-сосудистой ишемии (Zini I. et al., 1992; Piantadosi С. A. and Zhang J., 1996). Увеличение ЭПР сигнала отмечено также через 20 мин развития 2-сосудистой ишемии (Sakamoto A.et al., 1991). В противоположность этим данным, в работе Oliver C.N et al. (1990) не было обнаружено повышения уровня свободных радикалов в конце 10 мин ишемии у песчанок. Следовательно, в литературе представлены противоречивые данные, касающиеся возможности активации свободнорадикального окисления липидов в условиях ишемии мозга.

При очаговой ишемии мозга, как показано в исследовании Morimoto Т (1994), продукция свободных радикалов начинается в первые 30 мин, что зарегистрировано по накоплению перекисных продуктов и одновременно - по снижению уровня эндогенных антиоксидантов - а-токоферола, аскорбата и убихинола (Kinuia Y. Et al., 1989) и значительному снижению активности супероксиддисмутазы (Fabian R.H et al., 1995).

В большинстве исследований указывается на то, что избыточная продукция свободных радикалов отмечается в период рециркуляции. Измерение люцигенин-зависимои хемилюминесценции в зоне ишемическои полутени показало, что продукция свободных радикалов продолжается в следующие 6-12 ч после ишемии (Peters О. et al., 1998). Во время очаговой ишемии на

протяжении 60 мин повышается генерация NO-радикала (Malinski T.et al., 1993; Kumura Е et al., 1996).

В целом очаговая ишемия характеризуется: продукцией свободных радикалов, высвобождением глутамата из очага заболевания, который диффундирует в зону ишемической полутени, увеличением в цитозоли поврежденных нейронов ионов Са и активацией синтеза N0. В дальнейшем происходит индукция NO-синтазы в эндотелии и лейкоцитах, активация циклооксигеназы-2 в нейронах и выявляется свободнорадикальное повреждение митохондрий.

Недавние исследования продемонстрировали, что в очаге ишемии отмечаются небольшие изменения свободнорадикальных процессов по сравнению с зоной ишемической полутени, в которой идет наиболее интенсивная генерация свободных радикалов с дальнейшим увеличением в период реперфузии (Solenski N. et al., 1997). Дополнительным источником активных форм кислорода там могут быть полиморфноядерные лейкоциты, в избытке появляющиеся в этой зоне.

В настоящее время в различных лабораториях всесторонне изучается роль свободных радикалов в ишемическом повреждении клеток (Siesjo et al, 1995; Samdani A.F. et al., 1997; Chan P.H et al., 1998; Lipton P., 1999). В результате получены веские доказательства того, что свободные радикалы могут вызывать массированные повреждения и гибель клеток мозга. Ишемия создает условия, которые способствуют генерации свободных радикалов.

Первые исследования, указывающие на вероятность повреждения
ишемизированного мозга свободными радикалами, были проведены

Demopoulos Н.В. (1973, 1977, 1979 гг.). В дальнейшем гипотеза о взаимосвязи процесса ПОЛ и повреждения мембран мозга во время ишемии была подтверждена несколькими группами исследователей (Watson B.D. et al., 1988;

Kontos H.A., 1989). В экспериментальных исследованиях, выполненных Rehncrone S. (1980) и Suzuki (1984), значительная активация процесса ПОЛ была показана на ранней стадии ишемии мозга. Watson B.D. с соавторами (1984) в экспериментальном исследовании также отмечали увеличение содержания продуктов ПОЛ в мозге в течение первых 3 мин глобальной ишемии головного мозга с последующим нарастанием активности процесса в постишемическом периоде (на стадии реперфузии).

Однако другие исследователи (Siesjo В.К., 1981; Nayini N.R., 1985) считают, что повреждение ткани мозга свободными радикалами с активацией процесса ПОЛ происходит исключительно в постишемическом периоде - на стадии рециркуляции (Семченко В.В. и др., 1983; Floyd R.A., 1990; Schmidley J.W., 1990). Kogure K.et al. (1982) на экспериментальной модели ишемии мозга, вызванной эмболией, показали, что генерация свободных радикалов начинается на ранних стадиях реоксигенации. На модели окклюзии 4 сосудов головы у крыс уровень липидных перекисей, регистрируемый по накоплению ТБК-реактивных продуктов, оставался неизменным во всех отделах мозга после 30-ти минутной ишемии, в то время как в условиях рециркуляции отмечалось значительное увеличение содержания ТБК-продуктов (Bromont С. et al., 1989). На модели обратимой ишемии мозга было показано увеличение уровня низкомолекулярного железа, коррелирующее с повышением содержания продуктов ПОЛ (коньюгированных диенов и малонового диальдегида) в постишемическом периоде рециркуляции крови (Nayini N.R. et al., 1985). Согласно этим данным, максимальная активация ПОЛ отмечается в период реоксигенации ишемизированного мозга.

По-видимому, изменения, инициированные во время ишемии, могут стать причиной развития дальнейших деструктивных мембранных процессов, которые могут привести к гибели клетки нервной ткани (Kirsch I.R. et al., 1987; Becker

D.P. et al., 1988), Резкое восстановление циркуляции крови по церебральным сосудам в постишемическом периоде может привести к усилению процесса ПОЛ за счет избыточной генерации АФК, которые могут стать главной причиной дальнейшего повреждения нервной ткани после ишемии.

Предполагают существование нескольких возможных механизмов генерации свободных радикалов в постишемическом периоде (Kogure К. et al., 1985). Во-первых, в период рециркуляции арахидоновая кислота, накопившаяся во время ишемии, вступает в каскад ферментативных реакций, катализируемых ферментами циклооксигеназой и липооксигеназой. В ходе этих реакций свободные радикалы генерируются как побочные продукты в процессе биосинтеза простагландинов и лейкотриенов. При этом отмечается корреляция между увеличением синтеза простагландинов и ростом уровня супероксида. Во-вторых, гипоксантин, накопившийся во время ишемии в реакциях катаболизма АТФ, становится субстратом окисления при поступлении кислорода и обеспечивает усиленную продукцию супероксида (McCord J.M. and Roy R.S., 1982). Как указывалось ранее, для непосредственного участия свободных радикалов в инициации свободнорадикальных реакций в липидах необходимо присутствие в качестве катализаторов металлов с переменной валентностью, в частности, ионов железа. В норме железо находится в клетках мозга в виде комплексов с белками, однако любое повреждение мозга (в том числе, и в первую очередь - ацидоз) может быть причиной его высвобождения из этого комплекса с восстановлением до двухвалентного состояния. Таким восстановителем может быть кислород (Halliwell В. and Gutteride J.M.C., 1986; Aruoma O.I. et al., 1989) в результате чего развивается некомпенсированная активация ПОЛ, приводящая к повреждению нервной TKaHH(Floyd R.A., 1990).

Механизм генерации свободных радикалов, индуцирующих перекисное окисление липидов нейрональных мембран в ишемизированной ткани мозга

предположительно можно представить следующим образом: нарушение процесса окислительного фосфорилирования приводит к прогрессирующему снижению уровня, АТФ в нейронах с увеличением в ней АДФ и АМФ. Вследствие метаболизма последнего до аденозина, инозита и гипоксантина возможна перегрузка клетки гипоксантином (Halliwell В. and Gutteride J.M.C., 1984; Schmidley J.W., 1990). В нормальных условиях гипоксантин превращается при участии ксантиндегидрогеназы в ксантин и мочевину. Однако при ишемии возможен частичный (Са-зависимый!) протеолиз ксантиндегидрогеназы, в результате чего фермент переходит в другую форму - ксантиноксидазу. Ксантиноксидаза, используя молекулярный кислород как акцептор электронов, способна катализировать образование супероксид-анион радикала и перекиси водорода следующим образом:

Активность ксантиоксидазы повышается в 5 раз через 30 мин после 15 мин глобальной ишемии у крыс с образованием в качестве побочного продукта мочевины (Kinuta Y., et al., 1989; 1989а).

ксантиноксидаза
гипоксантин + Ог —* Ог'+НгОг + мочевина

В итоге; происходит накопление в клетке инициаторов свободнорадикального ПОЛ в количествах, превышающих возможности антиоксидантной системы по их нейтрализации (Halliwell В., 1992; Packer L.. 1995).

Эти события в большей степени относятся к глобальной ишемии (Kinuta Y., et al., 1989а) и обусловлены тем, что в этих условиях изменения АТФ и кальция гораздо более выражены. При очаговой ишемии превращения ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу не происходит; наиболее вероятно, что именно по этим причинам аллопуринол не способен предотвратить отек мозга и продукцию мочевины (Betz A.L., et al., 1991).

Гипоксантин, накопившийся во время ишемии в результате деградации АТФ, становится субстратом окисления при поступлении кислорода и способствует образованию супероксида (McCord J.M. and Roy R.S., 1982; Halliwell В. and Gutteride J.M.C., 1984).

Ксантиндегидрогеназа модифицируется в условиях окислительного стресса разным путем и с различной скоростью. Окисление SH-групп приводит к образованию дисульфидных связей в молекуле ксантиндегидрогеназы и изменяет характер катализируемой ею реакции окисления гипоксантина (ксантина): она превращается в ксантиноксидазу и начинает продуцировать супероксид-анион кислорода в качестве второго продукта реакции, что приводит к увеличению внутриклеточного уровня АФК. Иной путь модификации осуществляется с участием Са-активируемой протеиназы кальпаина, который отщепляет от фермента хвостовую часть, что приводит к такой же модификации катализируемой им реакции. Первый путь занимает десятки секунд, а второй -минуты и осуществляется в случае, когда, нарушение мембранной структуры клеток АФК приводит к повышению внутриклеточной концентрации кальция. В мозге этот путь является серьезным источником АФК из-за высокого содержания ксантиндегидрогеназы.

Другим источником свободных радикалов при ишемии является их генерация убихинолом. Это связано с двумя причинами. Во-первых, небольшое поступление кислорода происходит по коллатералям, во-вторых, во время гипоксии переносчики в дыхательной цепи разобщены, восстановления кислорода до воды не происходит и убихинол взаимодействует непосредственно с кислородом, образуя супероксид анион-радикал, который в результате реакции дисмутации восстанавливается до воды.

Весьма интересным открытием в последние годы было обнаружение влияния глутаминовой кислоты на процесс генерации окиси азота (N0) в

ишемизированных нейронах мозга (Болдырев А.А., 1995). Механизм этого эффекта сводится к следующему: глутамат, действуя на NMDA-рецепторы, усиливает поток значительного количества ионов кальция; внутрь нейрона.

активируя Са2+-кальмодулин - зависимую NO-синтазу, что приводит к образованию NO (Schmidt H.W. et. al., 1992; Iadecola С, 1997).

Активация NO-синтазы во время и после ишемии сопровождается повреждением во всех значимых модельных экспериментах по ишемии мозга (Iadecola С, 1996). При кратковременой очаговой ишемии для защиты сосудов используются специальные ингибиторы этого фермента в дозах, не снижающих скорости кровотока. Применение таких препаратов снижало на 55% объем инфарктной зоны спустя 7 дней после 2-ч окклюзии СМА без снижения кровотока (Escott K.J. et al., 1998). Таким образом, N0' потенцирует токсический эффект супероксид аниона, образующегося благодаря активации ферментативных систем генерации активных форм кислорода (ксантиноксидаза-гипоксантин и др.) и вносит существенный вклад в перепроизводство свободнорадикальных форм кислорода в тканях мозга в условиях окислительного стресса. (Szabo С, 1996).

Во время ишемии, даже при повышенном уровне глюкозы (20 мМ), ацидоз в совокупности с высвобожденным железом также способствует формированию свободных радикалов (Pulsinelli W.A;et al., 1985) и усугубляет течение очаговой ишемии у животных (Wei J.N. et al., 1997).

Нейроны в ишемизированной ткани мозга взаимодействуют с активированной глией, макрофагами и нейтрофилами, как и микрососуды, служат мощным источником экстанейрональных свободных радикалов, v способных существенно модифицировать физиологический ответ нервных клеток на воздействие окислительного стресса и сопровождаться резким усилением ПОЛ и нейродеструктивных процессов (Дупин A.M. и соавт., 1997).

Очевидно, что метаболические нарушения при церебральной ишемии и реперфузии, приводящие в итоге к тканевому повреждению, обусловлены, во-первых, возобновлением кровотока и, во-вторых, наличием так называемой прооксидантной зоны вокруг ишемического очага (или зоной "ишемической полутени"). В ней существенно активированы процессы ПОЛ, с одной стороны за счет пшероксии, а с другой - из-за нарушения способности утилизировать в процессе тканевого дыхания поступивший туда кислород.

В вышеизложенных условиях возможны нарушения мембран клеток гемато-энцефалического барьера, что приводит с одной стороны к выходу из ЦНС в кровь продуктов клеточного распада и образованию в крови антител к ним, повреждающих затем нативные нейроны, а с другой стороны, к поступлению в ЦНС патогенных для нервной ткани соединений. Липопероксиды влияют на реакции синтеза простагландинов, ингибируют образование эндотелиального ПГІ2 и стимулируют синтез тромбоксана Аг, что приводит к адгезии и агрегации тромбоцитов, к усилению вазоконстрикции и окклюзии микроциркуляторного русла.

Важным аспектом участия процесса ПОЛ в ишемическом повреждении клеток мозга является его роль в возникновении отека мозга (Chan Р.Н. et al.. 1983; 1984). Результаты экспериментального исследования, выполненного Abe К. et al. (1988) на модели окклюзии средней мозговой артерии у крыс показали, что введение ингибиторов ПОЛ предотвращало отек мозга.

Подводя итог, можно предположить, что ишемия и последующая реоксигенация - это два патофизиологических процесса, которые могут приводить к генерации АФК. В случае невозможности нейтрализовать избыток АФК, генерируемых в условиях ишемии мозга, происходит активация каскада реакций, вызывающих хаотическую (по типу некроза) или программируемую (по типу апоптоза) смерть клетки.

1.3. Апоптоз и некроз как возможные пути гибели нервных клеток при

ишемии головного мозга

Основным показателем гибели нервной ткани, обусловленной ишемией головного мозга, можно считать необратимую потерю ее морфологических и функциональных характеристик (Nedergaard М., 1987). Существуют два разных пути гибели ишемической клетки (Clarke P.G.H., 1990; Majno G., and Joris I., 1995), представляющие собой апоптоз или некроз. В настоящее время невозможно объяснить, почему один и тот же вид инсульта может порождать разные виды клеточной смерти в одной и той же популяции клеток (Clarke P.G.H., 1990; Martin L.J.etal., 1998).

Апоптоз - это запрограммированный физиологический процесс. Вклад этого процесса в необратимые повреждения нервной ткани значителен как при очаговой ишемии, так и при аноксии/ишемии; поскольку в обоих случаях наблюдаются четко выраженные морфологические изменения, характерные для апоптоза (Charriaut-Marlangue С. et al., 1996). Данные об участии апоптоза в клеточной смерти при глобальной ишемии мозга противоречивы.

Имеется ряд морфологических, биохимических и фармакологических доказательств, определяющих участие апоптоза в гибели клеток мозга, обусловленной их ишемией. Морфологические и биохимические признаки апоптоза после ишемического повреждения обнаруживаются как в нейронах, так ив глии (Linnic M.D., et al., 1993). Апоптоз может индуцироваться с помощью различных стимулов и в разных условиях, однако ишемия является превалирующим фактором для его протекания,, включающим усиленную генерацию свободных радикалов (Jacobson M.D., 1996; Patel Т., et al., 1996), в том числе NO-радикала (Nicotera P. et al., 1995); нарушение митохондриальной функции (Jacobson N.D et al., 1994; Wolvertang E.J et al., 1994), увеличение

концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме поврежденных клеток (Nicotera Р et al., 2000), активацию кальпаина, активацию каспаз -специализированных цистеиновых протеаз - непосредственных инициаторов апоптоза (Chan S.L.et al, 1999, 1999а) и, наконец, фрагментацию ядерной ДНК. Активация каспаз блокируется. как in vivo, так и in vitro низкомолекулярными пептидами, ковалентно связывающимися с ними и инактивирующими их, что приводит как к уменьшению объема погибших ишемических клеток, так и к снижению неврологического дефицита.

Инициирующим фактором активации каспаз является высвобождение цитохрома с из митохондрий в цитозоль (Neame S.J. et al, 1998; Fujimura M. et al., 1998). Доказательством подверженности нейронов апоптозу является быстрое увеличение уровня белка паркина-4 (Chan S.L et al., 1999). Все эти изменения не типичны для нейронов, находящихся в условиях некроза.

Другой механизм апоптоза включает секрецию лейкоцитами фактора некроза опухолей и внеклеточные индукторы апоптоза - цитокины, действующие через их собственные рецепторы. Денатурация белков также активирует апоптоз из-за уменьшения концентрации свободного белка теплового шока. Следовательно, клетка уходит в апоптоз, если что-то случается (а) с ее ДНК, (б) белками или (в) липидами.

В случае инсульта запуск апоптоза осуществляется, по-всей вероятности, событиями, сопутствующими реоксигенации после определенного периода ишемии. При этом погибнут не только клетки, так или иначе поврежденные при ишемии, но и их ближайшие соседи. Вот почему небольшие некротические зоны окружены гораздо более обширными областями клеток, умерших от апоптоза.

Предполагается, что нейрональный апоптоз начинается в области синапсов (Mattson М.Р et al., 1998а, 2000; Duan W. et al., 1999). Клетки глии, находящиеся во взаимодействии с нейронами, астроциты, способны

продуцировать различные антиапоптические факторы и поэтому играют защитную роль в уменьшении чувствительности нейронов к апоптозу.

Апоптические нейроны характеризуются уменьшением тела клетки, формированием клетки в виде "пузырька", конденсацией ядерного хроматина и фрагментацией ДНК. Плазма мембран и органеллы (митохондрии и эндоплазматический ретикулум) остаются долгое время неповрежденными в процессе апоптоза. Наиболее примечательным в процессе нейронального апоптоза является фрагментация дендритов и аксонов, которая начинается на последующих этапах этого процесса. В дальнейшем апоптические нейроны распознаются и поглощаются микроглиеи, такая «очистка» от апоптических клеток не вредна для соседних клеток и не вызывает воспаления (Mattson М.Р et al., 1998,2000).

В числе первых авторов, продемонстрировавших подверженность нейронов процессу апоптоза в зоне ишемической полутени, были Linnikc соавт. (Linnik M.D et al., 1993). В исследованиях, проведенных позже, было показано, что культура нейронов, обработанная Мп-СОД, становится резистентной к процессу апоптоза, индуцированного ишемией (Keller J.N. et al., 1998).

Активность ксантиоксидазы повышается в 5 раз через 30 мин после 15 мин глобальной ишемии у крыс с образованием в качестве побочного продукта мочевины (Kinuta Y., et al., 1989; 1989а).

Таким образом, критическую роль в стимулировании апоптоза играет снижение эндогенных антиоксидантов (Mignotte В. and Vayssiere J.L., 1998), поскольку нарушение баланса между АФК и антиоксидантами, соотношения АТФ/АДФ, индуцирует деполяризацию митохондрий в результате чего высвобождаются проапоптозные белки, активируются каспазы, непосредственные медиаторы апоптоза (Rathmell J.C. and Thompson СВ., 1999).

Некроз также обусловлен стойкой генерацией свободных радикалов, повышением цитозольного уровня Са²⁺ и Na⁺, который поддерживается за счет внеклеточного повышения уровня глутамата. Индукция некроза АФК (Troy СМ., and Shelanski M.L., 1994; Bonfoco Е et al., 1995; Greenlund LJ.S et al., 1995) показана на культуре нейронов, когда введение антиоксидантов эффективно предотвращало этот процесс (Krohn A.J. et al., 1998).

Выбор типа клеточной смерти во многом определяется тяжестью повреждения, зрелостью клеток и концентрацией свободного Са²⁺. Некроз является преобладающим механизмом острого периода длительной окклюзии магистральных артерий головы. В случае более мягкого экспериментального воздействия на мозг, гибель клеток может пойти по пути апоптоза (в случае очаговой ишемии - в зоне ишемической полутени).

Доказано, что в экспериментальных условиях ишемии мозга нейроны могут гибнуть как по пути апоптоза, так и по пути некроза (NicoteraP and Lipton S.A., 1999). Умрет ли нейрон, когда подвергнется инсульту, по-видимому, зависит от того, по какому пути он пойдет - апоптозу или некрозу, что во многом зависит от состояния митохондрий (Zaidan Е., and Sims N.R, 1994; Kohno К. et al, 1997; Brorson J.R. et al., 1999). Свободные радикалы окисляют кардиолипины - основные липидные компоненты митохондрий, и эти изменения могут вызывать дефекты в цепи транспорта электронов (Paradies G, et al., 1997).

Важным аспектом лечения инсульта может стать применение фармакологических препаратов, предотвращающих апоптоз поскольку избирательное блокирование каскада апоптоза с помощью генетических или фармакологических способов может защитить клетки мозга от гибели в условиях ишемии (Kitagawa К et.al., 1998; Enders М. et al., 1998).

1.4. Свободнораднкальное окисление липидов и антиоксидантная терапия

при заболеваниях ЦНС 1.4.1. Свободнорадикалъное окисление липидов при различных заболеваниях

Активация свободнорадикального окисления липидов (ПОЛ) отмечена при различных заболеваниях, вызванных как эндогенными, так и экзогенными причинами. Особое значение в настоящее время придается нарушению регуляции в системе ПОЛ при неврологических заболеваниях. Так, активация процесса ПОЛ отмечена у животных с экспериментальной травмой спинного мозга. Повышение содержания продуктов ПОЛ, пропорциональное степени тяжести травматического поражения, отмечено у больных с черепно-мозговой травмой (Зацепина С.Н. и соавт., 1983). У больных с инфекционно-токсическим поражением ЦНС также выявлена активация ПОЛ, регистрируемая по накоплению продуктов липидного переокисления в крови и спинно-мозговой жидкости (СМЖ) пациентов. Оценивалось участие процесса ПОЛ в развитии нервно-мышечных дистрофий. Отмечено, что вызванные ПОЛ изменения в спектре фосфолипидов отражают нарушения структуры и функции мембран прогрессирующих мышечных дистрофий (Бадалян Л.О. и соавт., 1984).

Данные об участии свободнорадикальных процессов в патогенезе рассеянного склероза противоречивы. Роговина и Хохлов (1980) при исследовании продуктов ПОЛ у больных рассеянным склерозом (PC), не обнаружили МДА в ликворе, а содержание диеновых конъюгатов было достоверно снижено. В противоположность этому, в комплексном изучении свободнорадикальных реакций и аутоантител к фактору роста нервов А.С. Переседовой (1999) впервые было отмечено повышение уровня АФК в нейтрофилах крови, увеличение содержания МДА и уровня антител к фактору

роста нервов в сыворотке крови и СМЖ больных с рассеянным склерозом. Полученные автором данные свидетельствуют об участии свободнорадикальных реакций и аутоантител к фактору роста нервов в патогенезе PC.

М.Н Захаровой (2001) изучался сложный комплекс патохимических нарушений, отражающих активацию свободнорадикальных процессов и выраженную недостаточность антиоксидантной системы при боковом амиотрофическом склерозе. Автором выявлена тесная взаимосвязь изученных параметров системы прооксидантов-антиоксидантов с возрастом больных, клиническими особенностями и длительностью заболевания.

Интенсификация процесса ПОЛ и снижение активности антиоксидантных ферментов, была обнаружена при развитии болезни Паркинсона (Cadet J.L. and Brannock С, 1998;Савищева О.С.'и соавт, 2000).

По данным некоторых исследователей, некомпенсированная активация свободнорадикальных реакций в нервной ткани является важным звеном эпилептогенеза. Так, повышение уровня продуктов ПОЛ в плазме и СМЖ больных сопоставлялось с длительностью и формой судорожных приступов и наличием изменений на электроэнцефалограмме (Крыжановский Г.Н и соавт., 1984,НикушкинЕ.В., 1991).

В экспериментальных исследованиях показано усиление ПОЛ в синаптосомах головного мозга животных при: нарушении сна, а также увеличение продуктов ПОЛ в крови пациентов с неврозами (Prilipko L.L., 1984; Коровин A.M., и соавт., 1991).'Активация ПОЛ при стрессорном поражении ЦНС, по всей вероятности, вызвана выходом в кровь катехоламинов (КА), накоплением их в органах-мишенях и активацией их метаболизма. Это подтверждается тем, что введение у-аминомасляной кислоты (ГАМК), которое предотвращает выброс КА, предупреждало активацию ПОЛ (Меерсон Ф.З., 1986,1988).

В литературе широко обсуждается вопрос о роли ПОЛ в этиологии и патогенезе атеросклероза (Полесский В.А., 1986; Ланкин В.З., 1988). В работе А.К.Тихазе (2000), направленной на изучение роли процессов свободнорадикального перекисного окисления липидов в клеточно-молекулярных механизмах атерогенеза и атеросклеротическом поражении стенки сосуда человека. Автором дано теоретическое и экспериментальное обоснование необходимости использования антиоксидантов для коррекции гиперлипопероксидации при атеросклерозе.,

В настоящее время установлено, что одним из важнейших звеньев патогенеза этого заболевания является накопление холестерина и его эфиров в гладкомышечных клетках сосудов, макрофагах, а также в клетках крови эритроцитарного и лейкоцитарного ряда. Одной из основных причин, вызывающих эти нарушения, считается модификация атерогенного класса липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), приводящая к увеличению нерегулируемого захвата ЛПНП клеткой и перехода холестерина из липопротеинов в клетку (Лопухин Ю.М. и соавт., 1983, Климов А.Н., 1985; Steinberg D. et al., 1989). Показано, что только модифицированные ЛПНП способствуют эстерификации холестерина и являются необходимым условием формирования пенистых клеток (Климов А.Н., Попов А.В., 1989).

Предполагают, что одним из факторов, модифицирующих структуру липопротеинов, может быть активация процесса ПОЛ (Ланкин В.З.и соавт., 1988). Следует отметить, что ЛПНП весьма подвержены перекисному окислению в процессе их циркуляции в кровяном русле (Осис Ю.Г. и соавт., 1982). Окисление ЛПНП сопровождается изменением конформации апо-протеина В и перемещением из гидрофобной зоны частицы в водную фазу (Ланкин В.З., 1985), что в свою очередь должно способствовать увеличению нерецепторного захвата атерогенных ЛПНП эндотелиальными клетками стенки

сосуда или макрофагами, вследствие чего они превращаются в пенистые клетки (Фармазюк В.Е., 1981).

В плазме, крови пациентов с атеросклерозом обнаружено значительное увеличение продуктов липидного переокисления (Калмыкова В .И.. Бурлакова Е.Б., 1982). Накопление МДА и других продуктов ПОЛ в крови может также приводить к модификации интактных ЛПНП с образованием поперечных сшивок МДА с ЛПНП через остатки лизина, входящие в состав апо-В-липопротеина. Повышение физиологического уровеня МДА, присутствующего в плазме крови при преходящих и острых ишемических нарушениях мозгового кровообращения оказывает модифицирующее воздействие на ЛПНП (Haberland М.Е. et al., 1982). Усиленному окислению ЛПНП, вероятно, способствует снижение в крови активности ферментов, утилизирующих перекисные продукты (Панасенко О.М. и соавт., 1988, Шалхарова Ж.Н., 1987).

Таким образом, окисление ЛПНП является одним из главных: факторов риска, включающимся в атерогенез. Последующими событиями этого процесса является снижение уровня эндогенных антиоксидантов и усиление липидного и белкового переокисления с формированием токсичных и высокореакционных продуктов их реакций.

В двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании сообщалось о защите витамином Е больных атеросклерозом против возможности возникновения инфаркта миокарда (N.G.Stephens et al., 1996). В это исследование было включено 1767 пациентов с коронарным атеросклерозом, из них 800 человек получали капсулы с препаратом а-токоферола по 400-800 IU, а 967 - плацебо. Лечение а-токоферолом значительно снижало риск развития нефатального инфаркта миокарда с сохранением этого эффекта спустя год после лечения, но не оказывало существенного влияния на смертность пациентов от кардиоваскулярных заболеваний. Результаты исследования Azen S.P. et al. (1996)

показали, что прием а-токоферола может препятствовать прогрессированию атеросклеротического заболевания.

В ряде исследований показана тенденция к уменьшению смертности от кардиоваскулярных заболеваний при длительном приеме низких доз а-токоферола в комбинации с Р-каротином и селеном (W.J.Blot et al., 1993). Комплексное применение а-токоферола и аскорбиновой кислоты также снижало прогрессирование атеросклероза (Jialal і. and Devaraj S., 1996). В отличие от а-токоферола, аскорбат не связывается с липопротеинами плазмы. Он ингабирует атерогенную модификацию ЛПНП клетками эндотелия. По-видимому именно этот эффект лежит в основе его способности снижать риск развития кардиоваскулярных заболеваний и инсульта (J.A.Simon et al., 1998). Эти результаты нашли свое подтверждение в исследовании, проведенном в Финляндии, которое показало, что низкий уровень аскорбиновой кислоты в крови мужчин является важным фактором риска развития инфаркта миокарда (K.Nyyssonen et al., 1997).

Активация ПОЛ, регистрируемая по накоплению липидных перекисей как в клеточных мембранах артериальной стенки, так и в плазме крови, также имеет важное значение в механизмах возникновения и развития артериальной гипертонии (АГ) (Брюховецкий А.Г. и соавт., 1985; Ярема Н.И., Рудык Б.И., 1991; Schiokava О. et al., 1988). В работе Schmidley J.W. (1990а) показано, что при острой гипертонии в гладкомышечной оболочке сосуда и в эндотелии происходит высвобождение из фосфолипидов арахидоновой кислоты, дальнейшие превращения которой приводят к формированию простагландинов и генерации свободных радикалов (как побочных продуктов этих реакций). Показано, что кислородные свободные радикалы, действие которых коррегировалось смесью ферментов СОД и каталазы (Olesen S.P., 1987), способны оказывать влияние на микрососуды ЦНС. Эти предполагаемые

свободнорадикальные механизмы острой гипертонии можно отнести и к гипертонической энцефалопатии у человека (Schmidley J.W., 1990а). Исходя из вышеизложенного, свободнорадикальное окисление липидов можно рассматривать как молекулярный механизм, способствующий повреждению клеток нервной ткани после различного рода воздействий.

Причиной раннего повреждения нервной ткани может быть гипоксия, которая способствует формированию свободных радикалов с последующей активацией процесса ПОЛ (Demopoulos Н.В. et al., 1977). Так у животных с хронической (сроком до 2 недель), экспериментальной гипоксией отмечалось повышение уровня ТБК-реактивных продуктов в мозговой ткани, а также в аорте и сыворотке крови (Fridovich I., 1979). Оказалось, что при гипоксии ЦНС реакции свободнорадикального окисления в мембранных липидах нервных клеток проходят наиболее интенсивно (Прилипко Л.Л., 1982; Yoshikawa Т. et al., 1982; Imaizumi S., et al., 1984), а кислород может быть триггером биохимических, функциональных и структурных изменений нервной ткани (Fukuzumi К., 1986). По-видимому, это обусловлено повышенной чувствительностью ткани ЦНС млекопитающих к любому типу гипоксии (Schurr A and Rigor В.М., 1987) и объясняется высокой интенсивностью обменных процессов в ткани мозга, отсутствием в ней запасов энергии, большим содержанием ПНЖК в нейрональных мембранах, особенностями кровоснабжения а также относительно недостаточной активностью защитной антиоксидантной системы.

1.4.2. Состояние сеободнорадикальных процессов при ишемических острых нарушениях мозгового кровообращения у больных

Нарушения процессов ПОЛ наблюдаются у пациентов с различными

цереброваскулярными заболеваниями. Отмечено значительное повышение уровня продуктов липидного переокисления, измеряемых в крови и ликворе пациентов с различными сосудистыми заболеваниями головного мозга, включающими дисциркуляторную энцефалопатию (ДЭ) и ОНМК ишемического типа. (Kunio Y., 1976; Kibata М. et al., 1977; Дельва В.Е. и соавт., 1984; Бобырева Л.Н., 1984; Francesco V. et al., 1985; Виничук СМ., 1991; Реброва О.Ю., 1992, 1995; Мельникова Е.В., 1996)

В исследованиях P.P. Шакаришвили (1988) и Э.С. Шамсиева (1989) показано повышение продуктов ПОЛ в различных биологических образцах (крови, ликворе и мембранах эритроцитов) с одновременным снижением эндогенного антиоксидантного фона (а-токоферола, каротиноидов) при различных ЦВЗ. Выраженность этих изменений коррелировала с формой и тяжестью ОНМК, особенно при неблагоприятном исходе заболевания. Клинико-биохимические исследования, проведенные Л.И. Рейхерт и соавт. (1987);. установили повышение уровня продуктов ПОЛ в эритроцитах у больных с ишемическими ОНМК.

В работе О.Ю. Ребровой (1992) было показано, что максимальная интенсивность ПОЛ в апо-В-липопротеинах сыворотки крови у пациентов с ишемическим инсультом наблюдалась во вторую фазу заболевания. Автором установлено, что измерение уровня ПОЛ в мембранах эритроцитов может служить тестом для дифференциальной диагностики типа инсульта (ишемический или геморрагический) в его острейшем периоде.

В клинико-биохимическом исследовании, выполненном М.Ю. Максимовой (1996)были выявлены особенности активации процессов ПОЛ у больных с ишемическим инсультом в зависимости от его механизма и степени неврологического дефицита.

Исследование уровня ПОЛ у больных с ишемическими ОНМК дает

возможность объективизировать ряд клинических особенностей состояния (например, длительность и тяжесть заболевания) и является важной предпосылкой для установления целесообразности применения антиоксидантов в комплексной терапии данного заболевания.

1.4.3. Применение антиоксидантов при ишемии головного мозга

Из литературных источников известно, что экспериментальная ишемия головного мозга сопровождается снижением в церебральной ткани концентрации эндогенных антиоксидантов, которые, вероятно, расходуются в попытке "тушения" свободнорадикальных реакций, запускаемых ишемией (Yasuda Н. et al., 1981; Frei В., et al., 1988; Yohshita H. et al., 1989). При этом снижение уровня общего количества антиоксидантов коррелирует с нарастанием в мозговой ткани продуктов липидного переокисления (Wee Е.Р., et al., 1981; Yoshida S. et al., 1982; Bromont С et al., 1989; LenzM.L., et al., 1990;).

Доказательством участия окислительного стресса в механизмах ишемического повреждения нейронов является способность антиоксидантов предотвращать эти повреждения на экспериментальных моделях. Например, введение мочевой кислоты, нейтрализующей пероксильный и гидроксильный радикалы, крысам с очаговой ишемией уменьшало повреждения коры и стриатума головного мозга (Yu Z.F. et al., 1998).

В условиях ишемии в чувствительных областях мозга отмечается изменение эндогенного уровня СОД. Снижение активности СОД при ишемии хорошо коррелирует с повреждением клеток в регионе СА1 гиппокампа. Активность фермента значительно снижается в чувствительных регионах мозга (СА1 и СА4) песчанок практически сразу после глобальной ишемии (Matsuyama Т. et al., 1993). Аналогичные результаты получены относительно снижения

митохондриальной Mn-СОД после 4-сосудиетой окклюзии у крыс (Liu X et al., 1993). Снижение активности Cu/Zn-СОД ускоряет смерть клеток по пути апоптоза (Greenlund L.J.S. et al., 1995) и увеличивает зону инфаркта после очаговой ишемии (Murakami К. et al., 1998).

Подтверждением важной роли СОД в защите мозга от ишемических повреждений являются эксперименты, проведенные с трансгенными мышами, для которых характерен в несколько раз более высокий уровень СОД. Оказалось, что 30 мин экспериментальная ишемия переносится этими животными при ослабленной неврологической симптоматике и с гораздо меньшим уровнем смертности (Mikawa S. et al., 1996).

Введение Cu/Zn-СОД значительно снижало повреждения в СА1 у крыс после кратковременной 10 мин 2-сосудистой окклюзии, что подтверждает участие свободных радикалов в повреждении (Chan P.H.et al., 1998). Однако чрезвычайно короткое время жизни СОД и каталазы в токе крови, а также их неспособность пересекать ГЭБ лимитируют их терапевтическое использование при ишемическом повреждении головного мозга. Imaizumi S. et al. (1990) предложил использовать липосомы в качестве переносчика супероксиддисмутазы через ГЭБ. Введение липосом, нагруженных СОД, за 10-20 мин до перевязки общих сонных артерий крысам повышало активность этого фермента в плазме и мозговой ткани на протяжении длительного периода времени, что коррелировало со снижением содержания гидроперекисей и уменьшением размеров очага ишемии. Авторы предполагают, что данный эффект обусловлен способностью липосом доставлять СОД непосредственно в мозг, где она проявляет свое терапевтическое действие. СОД, коньюгированная с полиэтиленгликолем, как и СОД, встроенная в липосомы, снижала зону инфаркта на 25-40% при очаговой ишемии (Imaizumi S. et al., 1990). Введение

митохондриальной Mn-СОД также снижало объем инфарктной зоны (на 20%) через сутки после 1 часа ишемии (Jacobson M.D., 1996).

Внутривенное введение СОД защищало мозг от повреждения, вызванного тремя, следующими друг за другом, ишемическими эпизодами, при этом комбинированное введение СОД и каталазы было более эффективным (Truelove D. et al., 1994). Инфузия в желудочки мозга Cu/Zn-СОД, непосредственно перед ишемией, снижало повреждение в СА1 (Uyana О. et al., 1992). Аналогичное действие оказывал и оксипуринол (ингибитор ксантиноксидазы и эффективный антиоксидант) при его внутривенном введении в дозе 40мг\кг веса животного (Phillis J.W, 1989). Синтетический антиоксидант U-101033, способный проникать через клеточные мембраны, на 50% ослаблял повреждение в СА1 после 20 мин 2-сосудистой окклюзии (Soehle М. et al., 1998). Аналогичным образом синтетический препарат МС-1, являющийся ловушкой гидроксильньгх радикалов, снижал повреждение клеток в СА1 на 70% спустя 3 дня после 10 мин 4-сосудистой окклюзии, а лечебный эффект этого антиоксиданта сопровождался 50% снижением уровня гидроксид-радикалов в этой области мозга (Сао X. and Phillis J.W, 1994;. Yamamoto Т. et al., 1997). Профилактическое введение (per os) песчанкам в течение 2 недель до вызывания ишемии и спустя 1 неделю после нее флавиноидного антиоксиданта /?-катехина защищало гиппокамп (СА1) против ишемии и коррелировало с 25% повышением антиоксидантного статуса в гомогенатах коры (Inanami О. et al., 1998).

Эффективными противоишемическим:'^- средством почек, сердца и печени может быть а-токоферол, (Биленко М.В., 1982) Однако, антиоксидантное и мембраностабилизирующее действие а-токоферол а имеет отсроченный характер и начинает проявляться лишь через 3-4 ч с максимумом через 18 -24 ч (Бурлакова Е.Б. и соавт., 1982; Биленко М.В.Ю 1982а).

Изучение активности свободнорадикального окисления липидов в

зависимости от концентрации в плазме крови витамина Е проводили у здоровых доноров. Кузьменко А.И. и соавт. (1997) выявили высокую корреляционную зависимость кинетических параметров перекиснои ХЛ сыворотки крови от содержания в ней витамина Е: коэффициент корреляции находился в пределах

0,76-0,97.

Дефицит витамина Е приводит к развитию различных неврологических симптомов (Davidson A. et al., 1988). Профилактическое введение витамина Е в течение 3 недель накануне экспериментальной ишемии приводило к снижению числа апоптических нейронов в регионе СА1, регистирируемого с помощью электронно-микроскопического анализа (Tagami М. et al., 1999).

Протекторное действие а-токоферола было показано при моделировании ишемии головного мозга на экспериментальных животных (Suzuki J. et al:, 1985). Предварительное длительное введение этого антиоксиданта ослабляло активацию ПОЛ в нервной ткани и в значительной степени предупреждало развитие патологического процесса (Ramsammy L.S. et al., 1987). Он способен сохранить живыми 75% клеток, которые должны были бы погибнуть в течение 7 дней после ишемии (Нага Н. et al., 1990). Аналогичный эффект был отмечен при введении спиновой ловушки (PBN) в течение 2 дней после ишемии, причем действие PBN сопровождалось снижением температуры тела животного (Yue T.L. et al., 1992). Дефицит витамина E в диете экспериментальных животных приводит к еще большему усилению ПОЛ в постишемическом периоде по сравнению с животными, имевшими нормальный пищевой рацион (Fujimoto S., et al., 1984). Внутривенное введение а-токоферола в дозе 20 мг/кг за 30 мин до вызывания билатеральной 3-часовой ишемии мозга у крыс приводило к снижению уровня ПОЛ в мозге и в сыворотке крови в период реперфузии, повышало ресинтез АТФ и улучшало неврологический статус (Yamamoto М. et al., 1983). По-видимому, этот эффект можно объяснить тем, что а-токоферол

легко проходит через ГЭБ, встраивается в клеточные мембраны мозга и оказывать там свое антиоксидантное действие. Структурно-функциональную стабильность нейрональных мембран а-токоферол обеспечивает путем нейтрализации липофильных радикалов, образующихся при перекисном окислении липидных компонентов мембран (Ерин А.Н. и соавт., 1985). Кроме этого, а-токоферол способен "тушить" синглетный кислород и ограничивать молекулярную подвижность липидного бислоя, увеличивая его устойчивость против проникновения гидроксид-радикала (Айдарханов Б.Б. и соавт., 1989).

Из синтетических антиоксидантов достаточно широкое распространение получил ионол (дибунол). По химической структуре он является соединением фенольного ряда (4-метил-2,6-дитретбутилфенол) (Дегтярев И.А., Заиков Г.Е., 1985). Антиоксидантное действие ионола показано при ишемии скелетных мышц, почек, печени, тонкой кишки (Биленко М.В., 1989;), а также при инфаркте миокарда: предварительное введение этого препарата подавляло активацию ПОЛ, увеличивало энергетический потенциал клетки и ограничивало размеры зоны ишемического некроза миокарда (Долгих В.Т., 1984; Евсевьева М.В. и соавт., 1989). Полагают, что противоишемический эффект ионола в значительной степени связан с его способностью поддерживать уровень антиокислительной активности липидов и ингибировать накопление продуктов ПОЛ.

Протекторное действие ионола показано и при травме головного мозга, стрессорных повреждениях (Биленко М.В., 1982; Прилипко Л.Л., 1982). Применение ионола при эпилепсии снижало содержание перекисных продуктов и оказывало противосудорожное действие (Никушкин Е.В., 1991).

Известно, что ПОЛ приводит к изменению состава, микровязкости мембран, нарушению их проницаемости и к дисбалансу электролитов в клетке. В связи с этим, последние годы большое внимание уделяется взаимосвязи

процессов ПОЛ и функциональной активности тромбоцитовфч От состояния процессов ПОЛ зависит физиологическое течение агрегации и секреция тромбоцитов, поскольку каскад реакций, финалом которого является образование агрегатов, представляет собой процесс липопероксидации арахидоновой кислоты (Ланкин В.З., 1985). Токсичные продукты ПОЛ повреждают клетки эндотелия и интимы сосудов и провоцируют спастические реакции. Усиление интенсивности ПОЛ приводит к активации тромбоцитов, их агрегации и тромбообразованию. Все это усугубляет реологические и микроциркуляторные нарушения у больных атеросклерозом.

В этих условиях становится целесообразным использование антиоксидантов. Так, при исследовании влияния антиоксиданта ионола на функциональную активность тромбоцитов Спасовым А.А. и соавт. (1999) отмечалось эффективное снижение их агрегации в плазме как экспериментальных животных (кроликов), так и человека; одновременно наблюдалось уменьшение плотности образовавшегося сгустка. Ионол изменял параметры тромбоэластограммы в сторону гипокоагуляции, что свидетельствует об уменьшении коагуляционного потенциала крови.

Для защиты мозговой ткани от повреждений при ишемии в настоящее время все шире используются антиоксиданты из группы производных 3-оксипиридина - эмоксипин (2-этил-6-метил-3-оксипиридин) и мексидол (3-окси-6-метил-2-этилпиридин сукцинат), относящиеся к водорастворимым антиоксидантам биогенного типа и являющиеся структурными аналогами соединений группы витамина В6 (Дюмаев К.М и соавт., 1995). Положительным свойством эмоксипина и мексидола является их способность проникать через гематоэнцефалический барьер (Дюмаев К.М. и соавт., 1984). Исследование молекулярных механизмов действия эмоксипина показало, что этот препарат обладает широким спектром фармакологических свойств, в том числе

эффективно ингибирует свободнорадикальное окисление липидов, активно реагирует с перекисными лиггдными радикалами, а также гидроксильными радикалами и является мощным антиоксидантом. Эмоксипин эффективно стабилизирует мембранные структуры, подавляет агрегацию тромбоцитов in vivo и in vitro, ингибирует фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов, увеличивая тем самым содержание циклических аденозинмонофосфата и гуанозинмонофосфата (Воронина Т.А. и соавт., 1988).

Эмоксипин оказался эффективен при лечении экспериментальной ишемии мозга, вызванной перевязкой общих сонных артерий у крыс. Он достоверно снижал смертность животных, уменьшал тяжесть локальной и общемозговой неврологической симптоматики, а также увеличивал латентный период развития выраженных клинических проявлений (Рясина Т.В. и соат., 1988).

Другим представителем соединений этой группы является мексидол. Отличия его свойств от таковых эмоксипина, обусловлено наличием в его молекуле янтарной кислоты, обеспечивающей усиление компенсаторной активации аэробного гликолиза и снижение угнетения окислительных процессов в цикле Кребса, приводящее в условиях гипоксии к увеличению содержания АТФ и креатинфосфата, активации энергосинтезирующих функций митохондрий, стабилизации клеточных мембран (Дюмаев К.М. и соавт., 1984).

В опытах на грызунах показано, что мексидол обладает
противогипоксическим, антиамнестическим, анксиолитическим,

антистрессорным и противосудорожным действием, геропсихотропной активностью, потенцирует гексеналовый сон. В опытах на наркотизированных нембуталом крысах Погореловым В.Е. и соавт. (1997) отмечено улучшение ауторегуляции мозгового кровотока в постишемическом периоде под влиянием мексидола и новых производных 3-оксипиридина ЛКБ-10 и ЛКБ-38 как при профилактическом, так и терапевтическом способах введения. Предполагается,

что в связи с отщеплением сукцината, мексидол способен оказывать и прямое энергизующее клетки действие.

Возможен и другой механизм его участия в компенсации
постишемических нарушений мозгового кровообращения, связанный с обменом
биогенных аминов. Препарат может включаться в механизмы биосинтеза
дофамина, увеличивая его содержание в стрнатуме (Мирошниченко И.И. и
соавт., 1996). Эти данные предполагают наличие в действий мексидола
дофаминергической компоненты, обеспечивающей сохранность

ауторегуляторных реакций мозговых сосудов при ишемии мозга.

В экспериментальной практике в последние годы успешно применяются для предупреждения и лечения ишемии мозга и другие синтетические антиоксиданты, к котрым можно отнести группу лазароидов - синтетических производных 21-аминостероидов (производных глюкокортикоидов, лишенных гормональной активности) (Hall E.D. et al., 1988, 1989). В экспериментальных исследованиях (Yound W. et al., 1988; Fisher М. et al., 1990; Haraldseth O. et al., 1991) была показана их антиоксидантная активность, а также способность улучшать выживаемость животных с ишемией головного мозга..

В литературе имеются сообщения о способности D-пеницилламина ингибировать процессы свободнорадикального оксиления. Антиоксидантное действие D-пеницилламина обусловлено как его хелатирующими свойствами (способностью образовывать комплекс с ионами железа), так и прямым антирадикальным эффектом (Биленко М.В., 1982).

Перспективным антиоксидантом в профилактике и лечении ишемических, возрастных и нейродегенеративных заболеваний мозга может быть липоевая кислота - тиоловое соединение с прямым антиоксидантным действием (Packer L et al., 1997). Тиоловые соединения способны накапливаться в мозге и обладают выраженным антиоксидантным защитным действием в условиях

экспериментальной ишемии мозга с рециркуляцией (Shivakumar B.R. et al., 1995). Липоевая кислота и ее производные оказывают нейропротекторное действие, регистрируемое на различных экспериментальных моделях очаговой и глобальной ишемии мозга. Показано, что лечение дигидролипоевой кислотой мышей с окклюзией средней мозговой артерии снижало зону инфаркта (Prehn J.H.M. et al., 1992). Защитный эффект липоевой кислоты против ишемического повреждения мозга был также продемонстрирован на модели глобальной ишемии у монгольских песчанок, который выражался в снижении повреждения в области гиппокампа (Сао X. and Phillis J.W., 1995).

Известны и другие природные метаболиты, проявляющие антирадикальное действие. Достаточно эффективным природным антиоксидантом является мочевая кислота, проявляющее свое действие как при профилактическом введении, так и непосредственно после вызывания ишемии (Yu Z.F et al., 1998). Есть данные о положительном влиянии р-каротина при кардиоваскулярных заболеваниях (G.van Poppel, 1996).

Из природных антиоксидантов мощным профилактическим действием на клинические и биохимичесике проявления ишемии головного мозга обладает карнозин. Эффективность его профилактического применения представлена на различных моделях гипоксии и ишемии мозга (Болдырев А.А., 1999; Стволинский С.Л., Доброта Д., 2000). Благодаря своему широкому спектру биологического действия, это соединение способно вмешиваться во многие патохимические процессы, сопровождающие ишемические нарушения и эффективно их корригировать.

Таким образом, при ишемии головного мозга отмечается значительное
истощение эндогенных антиоксидантов. Дефицит эндогенной антиоксидантной
системы ставит вопрос о целесообразности применения природных или
нетоксичных синтетических антиоксидантов ингибиторов

свободнорадикального окисления липидов. Антиоксиданты, защищая мозг от АФК и различных свободнорадикальных продуктов, могут быть важным терапевтическим средством лечения церебральной ишемии.

1.5. Экспериментальные подходы к характеристике окислительной

устойчивости клеточных структур

1.5.1. Экспериментальные модели ишемии головного мозга

Для изучения ишемического повреждения головного мозга используется ряд экспериментальных моделей как in vitro, так и in vivo. Модели in vitro позволяют изучать ишемические повреждения на клеточных культурах или изолированных срезах мозга. Срезы мозга, преимущественно гиппокампа; являются удобной моделью для изучения аноксического/ишемического повреждения (Kass I.S. and Lipton P., 1982; Lobner D. and Lipton P., 1993; Schmedtje J.F. et al., 1997). Используются также и культуры клеток - нейронов и глии из разных отделов мозга. Работа на моделях in vitro может быть, использована как основа для дальнейшего изучения ишемических процессов in vivo.

Описано множество экспериментальных моделей ишемии головного мозга in vivo, которые различаются как видами животных, так и методами остановки кровотока. Наиболее часто для изучения патохимии ишемизированного мозга используются крысы и монгольские песчанки. Имеется три класса моделей ишемии головного мозга in vivo: глобальная ишемия, очаговая ишемия и ишемия, отягощенная последующей гипоксией.

Глобальная ишемия вызывается окклюзией сосудов или полной остановкой кровообращения в мозге. Наиболее часто используют три модели глобальной ишемии: 4-сосудистую (Pulsinelli W.A. and Brierly J.B., 1979;

Pulsinelli W.A. andBuchan A.M., 1988) и 2-сосудистую окклюзию в комбинации с вызванным паденийиартериального давления крови до 50 мм рт.ст. у крыс, а также 2-сосудистую окклюзию у песчанок и у трансгенных мышей (Kitagawa К., et al. 1998; Strijbos P.J.L.M. et al., 1996).

При 2-сосудистой окклюзии у крыс сохраняется остаточный кровоток, поэтому ее называют неполной. Эта модель предпочтительна для песчанок, поскольку у этого вида грызунов отсутствуют задние соединительные артерии и 2-х сосудистая окклюзия приводит к глубокой ишемии (Kirino Т., 1985) и тяжелым повреждениям мозга с развитием выраженного неврологического дефицита (Imon Н et al., 1991).

Другие модели глобальной ишемии мозга включают асфиксию (Eleff S.M et al., 1991), остановку сердца (Crumrine R.C. and Lamanna J.C., 1991; Ekholm A^ et al., 1992). Продолжительность глобальной ишемии может колебаться от 3 до 30 мин, более длительная ишемия приводит к летальному исходу.

При глобальной ишемии температура мозга у песчанок и крыс падает на 3-5С и восстанавливается к первой мин реперфузии (Minamisawa Н.Р. et al., 1990). Снижение температуры может иметь защитное действие, так как оно способствует уменьшению зоны инфаркта (Zhang R.L et al., 1993).

Очаговая ишемия характеризуется локализацией повреждения и включает ишемический очаг и околоинфарктную зону или пенюмбру (зона ишемической полутени). Этот тип ишемии часто вызывают у кошек, приматов и грызунов, создавая преимущественно окклюзию средней мозговой артерии (Ginsberg M.D. and Busto R., 1989), хотя в некоторых случаях лигатуру накладывают и на сонную артерию.

Особый интерес представляет модель локальной ишемии мозга, вызванной фотоиндуцированным тромбозом. Эта модель (Романова Г.А. и соавт, 1998) основана на том, что введение фоточувствительной краски Bengal rose в

сочетании с фокусированным освещением черепа (длина волны 560 нМ) ведет к повреждению сосудистой стенки вследствие «кислородного взрыва», тромбированию сосудов с последующим образованием в коре очага некроза.

Моделирование очаговой ишемии мозга может включать постоянную или временную окклюзию средней мозговой артерии, причем временная окклюзия принимается как наиболее близкое отражение инсульта у человека (Mhairi-Масгае I., 1992). Окклюзия периферического отдела СМА при очаговой ишемии повреждает кору, поэтом}' ишемическое повреждение может иметь обратимый характер (Ginsberg M.D. and Busto R., 1989; Buchan A et al., 1992).

Гемодинамические, метаболические и ионные изменения: не распространяются одинаково на всю область ишемического очага. В нем формируется центральная зонах окружающей ее зоной ишемической полутени.' В центре кровоток составляет 20% от нормы, в этой области аноксическая деполяризация развивается через несколько минут после ишемии, наступает, биоэнергетический дефицит и полное нарушение ионного гомеостаза, клетки здесь гибнут быстро в процессах липолиза и протеолиза (Anderson М. L. et al., 1990; An G. et al., 1998). В отличие от летального повреждения центра, в зоне ишемической полутени частично сохраняется энергетический метаболизм (Andine Р., 1993). Терапевтическое «окно» для областей мозга, прилегающих к зоне инфаркта, может составлять несколько часов. Образующиеся в этой области белки теплового шока препятствуют расширению зоны инфаркта и усиливают стабильность клеток. Отсроченная гибель нейронов была продемонстрирована в зоне ишемической "полутени". Она может возникать спустя 48 ч после прекращения острой ишемии и восстановления кровотока, вместе с тем доказано восстановление функциональной активности нейронов в этой зоне, наступающее спустя многие месяцы (Cardell М. et al., 1989; Bullock R et al, 1994). Однако в дальнейшем (в отсутствие лечения) эта зона может увеличиваться за счет

локального высвобождения экзайтотоксинов, деполяризации, воспаления и процесса апоптоза. Это обусловливает необходимость незамедлительного введения нейропротекторов, направленных на сохранение и поддержку нейронов.

При очаговом инсульте в центре ишемического очага происходит снижение температуры приблизительно на 1,5С, что обусловлено снижением кровотока и повреждением гипоталамуса. В зоне ишемической полутени кровоток также снижен, но несколько меньше, чем в центре ишемического очага. Центр характеризуется массивными обратимыми ионными и метаболическими нарушениями, восстановление которых зависит от продолжительности инсульта. В зоне ишемии происходит интенсивное повреждение артериол. Очаговая ишемия сопровождается ишемической деполяризацией - увеличением внеклеточного калия и глутамата; аналогичные события развиваются и в зоне ишемической полутени (Nedergaard М. and Hansen A.J., 1993;HossmannK.A., 1994, 1996;BackT., etal., 1996; BuschE. etal., 1996)

Экспериментальные данные позволяют предполагать, что необратимый дефицит метаболизма может развиться в случаях, когда кровоток не восстанавливается в течение 3-4 ч (Bhalla U.S. and Iyengar R., 1999). Центральная зона артериального бассейна представляет собой эпицентр ишемии, и инфаркт в ней может развиться через 60 мин после возникновения повреждающего действия (Barone F.G. et al., 1998).

Кратковременная очаговая ишемия формирует зону инфаркта после 1-2 дней реперфузии, в отдельных случаях зона инфаркта формируется уже к 1 часу ишемии (Kaplan В., et al., 1991; Memezawa Н et al., 1992). В зоне ишемической полутени инфаркт развивается после 2-3 ч окклюзии (Garcia J.H.,et al., 1995).

При длительной очаговой ишемии зона инфаркта формируется после 3-12 ч (Nedergaard М, 1987; Osborne К.А., 1987; Du С. et al., 1996) и продолжает

нарастать после первых суток ишемии, хотя и с меньшей скоростью. Так, у крыс Wistar инфаркт возрастает на 30% в промежутке от 24 ч до 72 ч после ишемии (Garcia J.H. etal., 1993).

Окончательной стадией развития инфаркта при очаговой ишемии является формирование очага некроза. Механизмы, лежащие в основе этого процесса изучены недостаточно. Однако предполагается, что привести к формированию очага некроза может длительная продукция свободных радикалов (Chan Р.Н. et al. 1984). По-видимому, этот процесс является следствием аккумуляции Са²⁺ (Turrens J.F., 1997) и роста АДФ, что и приводит к продукции гидроксид-радикалов (Dugan L.L et al., 1997), которые действуют на митохондрии как ингибитор Мп-СОД, усиливая продолжительность заболевания после очаговой ишемии (Murakami К. Et al., 1998), поскольку активность фермента снижается, именно в инфарктной зоне (Keller J.N et al., 1998).

Два важных признака отличают очаговую ишемию от глобальной: первый - при очаговой ишемии кровоток всегда выше, второй - имеется значительная разница в состоянии вещества мозга в центре ишемии и в самом отдаленном от. нее участке, что сопровождается различным метаболизмом мозга.

Вследствие своей гетерогенности, очаговый инсульт является наиболее ценной моделью для изучения инсульта, так как он создает условия, приближенные к патологии человека. Протективная терапия при очаговом инсульте должна быть направлена на снижение зоны инфаркта и на блокирование ишемической гибели нейронов.

1.5.2. Методы регистрации уровня перекисного окисления липидов

В литературе описано множество методов определения продуктов перекисного окисления липидов на разных стадиях этого процесса, начиная со

стадии образования липидных радикалов и кончая стадией образования метаболически инертных соединений.

Измерение уровня свободных радикалов в тканях представляет собой достаточно сложный процесс, поскольку они имеют короткое время жизни, низкий стационарный уровень и высокую реакционную способность. Поэтому большинство исследователей используют косвенные методы определения первичных и вторичных молекулярных продуктов свободнорадикальных реакций (конъюгированные диены, гидроперекиси липидов или соединения, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой).

Первичные молекулярные продукты ПОЛ образуются при перераспределении электронной плотности в радикале полиненасыщенной жирной кислоты с последующей перегруппировкой двойных связей с образованием коньюгированного диена (КД), имеющего максимум поглощения при длине волны 232-234 нм. Данная конфигурация молекулы сохраняется вплоть до стадии образования липоперекисей и является достаточно стабильной. Используемые методы определения КД предполагают экстракцию липидов из образца, определение концентрацией липидов в нем и измерение его оптической плотности. Все манипуляции рекомендуется проводить при низкой температуре в струе инертного газа (Владимиров Ю.А., Арчаков A.M., 1972).

Для определения липидных радикалов можно использовать метод привитой сополимеризации. Животным вводится раствор С-акриламида в нетоксичной концентрации, при этом его мономеры связываются с липидными радикалами в тканях, после чего в гомогенате, предварительно отмытом от несвязавшегося мономера, на (3-счетчике определяют концентрацию связанного акриламида (Владимиров Ю.А., Арчаков A.M., 1972).

Как уже было сказано, свободные радикалы трудно поддаются непосредственному измерению. В настоящее время предложена технология

прямого измерения свободных радикалов с применением метода электронного парамагнитного резонанаса (ЭПР-спектрометрии). В основе этого метода лежит использование спиновых ловушек, которые способны связывать нестабильные радикалы с образованием более стабильного комплекса (Yue T.L. et al., 1992). В качестве ловушки часто используется PBN (1-фенил4-бутил-нитрол), а образующиеся аддукты измеряют по изменению характеристических компонентов спектра ЭПР (Яхьев А.В. и соавт., 1985; Tominada Т., et al., 1985; Cao W., et al., 1988; Floyd R.A., 1990). На модели экспериментальной ишемии мозга у крыс с помощью этого метода Sakamoto A. et al. (1991) показано, что накопление свободных радикалов коррелирует с активностью липидного переокисления.

Большинство известных методов определения липоперекисей основано на высокой окислительной активности этих соединений. Способность гидроперекисей; липидов восстанавливаться на катоде положена в основу полярографического метода их определения. При интерпретации кривых "сила тока - потенциал" можно получить информацию о концентрации липоперекисей в пробе, а также о природе переокисленного липида (Данилов B.C. и соавт., 1972, 1975). Максимальная чувствительность метода порядка 10"¹⁰ г-экв перекисей/мг липидов. Трудности при определении ГП связаны с их нестойкостью, высокой скоростью распада и утилизации. (Нейфах Е.А., Каган В.Е, 1969).

Достаточное распространение получило иодометрическое определение липоперекисей, : ^:"-. ' -'-.." Оно проводится в неполярной среде в присутствии уксусной кислоты. Титрование выделившегося иода проводят раствором тиосульфата натрия с амперометрической регистрацией точки эквивалентности (Козлов Ю.П. и соавт., 1972). Его максимальная чувствительность составляет 5"⁹ - 10'⁹ г-экв перекисей/ мг липидов. На основе

иодометрии разработано большое количество колориметрических методов определения липоперекисей (Takagi Т., et al., 1978). Свободный иод имеет максимум поглощения при> длинах волны 290 и 360-380 нм и может определяться непосредственно. Он также образует окрашенные комплексы с ионами кадмия (максимальная длина волны поглощения равна 410-350 нм), с крахмалом - 560 нм (Asakawa Т., Matsushita S., 1980). Высокая окислительная активность липидных гидроперекисей используется в методах их определения с дифенилкарбазидом и хлористым алюминием (Hamm D.L., et al., 1965; Eskin N.A.M., Frencel С, 1976). Общим недостатком этих методов является невысокая чувствительность.

Наиболее широко применяемы колориметрические или флуориметрические методы определения МДА в реакции с тиобарбитуровой кислотой с образованием хромогена розового. цвета, поглощающего в области 500-550 нм (Draper Н.Н., and Hadley М., 1990; Esterbauer Н., and Cheeseman К.Н., 1990);, Поскольку ТБК может вступать в реакции с различными соединениями, в настоящее время употребляется более широкое понятие - продукты., реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (Janero D.R., 1990; Armstrong D., Browne R., 1994).

Первое упоминание о применении этого метода относится к 1958тоду. С тех пор появилось большое число различных модификаций оригинальной методики. Концентрацию МДА можно измерять в различных биологических объектах, включая гомогенаты тканей, сыворотку крови, суспензию эритроцитов и субклеточных частиц (Ghoshal А К., 1966; Tappel A.Z., 1971; Kunio Y., 1976; Hicks M., Gebicki J.M, 1979; Ohawa H et al., 1979; Kovachich G.B., Mishra O.P, 1980; Asakawa T, 1980; Recknagel R.O; Tanizawa H et al., 1981; Hachett С et al., 1988). При заборе крови следует избегать гемолиза, так как он приводит к увеличению концентрации МДА в плазме.

Коплекс [МДА-ТБК] в плазме крови и моче может быть измерен более специфичными методами высокоэффективной жидкостной с электрохимической детекцией (Knight J.A et al., 1988; Largilliere G., Melanson S.B., 1988; Tatum V.L., et ah, 1990; Draper H.H et al., 1990; C.Rice-Evans et al.,1991; Y.Yamamoto,1994) или газовой хроматографии (Tomita M., et al., 1990).

Изменение содержания МДА хорошо коррелирует с кинетикой образования липоперекисей в высокой концентрации. В целом. методД простота позволяет использовать его практически в любой биохимической лаборатории, но недостаточно чувствителен и специфичен, что может привести к неадекватной трактовке полученных результатов. Необходимо также учитывать, что МДА может метаболизироваться митохондриями и микросомами, образовывать комплексы с аминосодержащими соединениями (Tappel A.L., 1971) с образованием Шиффовых оснований (Kikugawa К., Berry М., 1987), имеющих максимум поглощения в области 360-380 нм и максимум флуоресценции в области 440-470 нм.

Во время экстракции липидов часть флуоресцирующих оснований остается в водной фазе (производные аминокислот, нуклеотидов, белков и т.д.), часть - в липидном экстракте (липофусцин, производные аминосодержащих фосфолипидов и др. (Kikugawa К., et al., 1981). Обычно» ограничиваются определением жирорастворимых флуоресцирующих оснований. Примеси ретинола, имеющие сходный спектр флуоресценции, легко разрушаются под действием ультрафиолетового облучения.

Во время липидного, переокисления кроме МДА образуются и другие альдегиды, в частности, 4-гидроксиноненали и 4-гидроксигексенали (Esterbauer Н., et al., 1990; 1991). Методы измерешія 4-гидроксиноненалей основаны на ВЭЖХ с ультрафиолетовой детекцией (Lang J., et al., 1985). В диапазоне

концентраций от 10 до 100 цМ 4-гидроксиноненали вызывают агрегацию тромбоцитов и формирование тромбоксана А₂ (Selley M.L., et al., 1988).

Предельные углеводороды, также являющиеся вторичными молекулярными продуктами ПОЛ, представлены в основном этаном и пентаном и могут быть определены методом газовой хроматографии (Warner К, 1974; Lin S.N., Horning Е.С., 1975; Masaru S., Tappel A.L., 1979). Определение производится либо в выдыхаемом воздухе, либо в воздухе, собранном из пробирки с гомогенатом ткани (Dillard C.J. et al., 1977). Показана линейная зависимость между динамикой накопления МДА в ткани и изменением содержания этана в выдыхаемом воздухе (Riely С.A, et al., 1974)-

Важными методическими условиями является специфичность применяемых методов исследования ПОЛ. При проведении экспериментальных исследований необходимо измерение 1-2 маркеров, при этом измерение наиболее часто применяемого МДА нельзя сбрасывать со счетов, поскольку этот показатель несет в себе частичную информацию об активности процесса ПОЛ. Однако измерение МДА необходимо сочетать с другими, более специфичными методами.

В последние годы в качестве маркеров ПОЛ используют ряд изопростаноидов. Простагландин-подобные соединения Fі и F₂ изопростаноиды формируются in vivo путем неферментативного свободнорадикального окисления ПНЖК (преимущественно АК) (Т. Liu et al., 1999; A. Lawson, 1999). Впервые метод определения изопростаноидов был описан Morrow J.D., et al. (1990). Они формируются во время переокисления докозогексаеновой кислоты (Nourooz-Zaden J. et аЬ, 1998). Эти соединения представляют новый класс простаноидов и присутствуют органах, тканях и биологических жидкостях человека (Morrow J.D. et al., 1995; L.J. Roberts et al., 1999). Эты химически стабильные конечные продукты липидного переокисления, по определению В.

Halhwell, являются адекватными маркерами ПОЛ и индикаторами метаболических нарушений, которые включаются в процесс заболевания (Lynch S.M. et al., 1994; Morrou J.D., 1994).

Наиболее чувствительным является метод регистрации ХЛ, инициированной ионами двухвалентного железа (Лопухин Ю.М. и соавт., 1983). Его удобной модификацией является хемилюминесцентный метод. С его помощью можно определять содержание перекисных радикалов в исследуемом образце: гомогенате, суспензии субклеточных частиц, различных биологических жидкостях и срезах тканей (Иванов И.И., Петрусевич Ю.М., 1966; Frei В. et al., 1988). Испускание кванта света в видимой области спектра происходит в peaKUHH:ROO* + ROO* -» Р

Интенсивность хемилюминесценции связана с концентрацией радикалов следующим соотношением: ^тхл = К х [ROO*], где К - константа реакции, J -квантовый выход: ХЛ. Детектирование так называемого «сверхслабого свечения», испускаемого объектом, осуществляется фотоумножителем, работающим в режиме счетчика квантов (Маренков B.C., 1974; Нейфах Е.А., Каган В.Е., 1969). Применение метода хемилюминесценции началось с регистрации сверхслабого свечения, обусловленного реакциями рекомбинации радикалов супероксида, гидроксида и липидных радикалов, что сопровождается собственной или неактивированной хемилюминесценцией (Владимиров Ю.А. и др., 1972; Журавлев А.И., 1974). Для усиления сигнала предпринимаются попытки использования различных активаторов хемилюминесценции.

К числу химических активаторов, вступающих в реакции с определенными радикалами, относятся люцигенин, дающий свечение с радикалами супероксида, и люминол, дающий свечение в присутствии разнообразных радикалов. Для изучения свободнорадикальных реакций при цепном окислении липидов Ю.А. Владимировым с соавторами были

предложены такие физические активаторы, как краситель родамин G, комплекс европия с тетрациклином, лазерные красители - производные кумарина, механизм действия которых заключается в способности увеличивать квантовый выход ХЛ за счет переноса энергии электронного возбуждения от продуктов реакции на активатор (Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я., 1984).

Значительное усиление свечения можно наблюдать при добавлении перекиси водорода или растворов солей двухвалентного железа (Шестаков В.А. и соавт., 1979; Шляпинтох В .Я. и соавт., 1981). Наиболее изучен механизм цепного окисления липидов, катализируемого ионами двухвалентного железа. Роль ионов железа обусловлена их участием в реакции разложения гидроперекисей, которая прекращается лишь после окисления всех ионов двухвалентного железа (Владимиров Ю.А, 1989). За развитие ХЛ в присутствии ионов двухвалентного железа ответственны две различные хемилюминесцентные реакции. И только одна из них (стадии быстрой, вспышки и медленного разгорания ХЛ) связана с реакциями липидных радикалов, а природа другой (стадии стационарного свечения) остается неясной (Дремина Е.С., 1992). ХЛ является прямым доказательством наличия возбужденных электронных состояний, т.к. свечение молекулы возникает при переходе ее из возбужденного состояния в стационарное в результате взаимодействия свободных радикалов (Yamamoto Y., 1987).

ХЛ несет информацию об интенсивности и механизме свободнорадикального окисления липидов в биологических объектах (Кузнецов В.И., Станишевская О.Б., 1991). Преимуществом хемилюминесцентных реакций является их высокая чувствительность и специфичность по отношению к процессам ПОЛ (Владимиров Ю.А. и соавт., 1979; Cadenas Е et al., 1981).

Итак, достаточно высокой чувствительностью для определения ПОЛ в биологических объектах обладают хемилюминесцентный анализ и методы

ВЭЖХ для определения ТБК-продуктов и 4-гидроксиноненалей. Другие методы
следует отнести к ограниченно годным, т.к. в большинстве своем их
чувствительность недостаточна для определения концентрации гидроперекисей
липидов в тканях и биологических жидкостях здорового организма. Однако
значительное увеличение содержания липоперекисей, сопутствующее

различным заболеваниям, может быть зарегистрировано и с помощью этих методов, в частности, при определении ТБК-реактивных продуктов.

1.5.3. Интерпретация хемилюминесцентных кривых

В наших экспериментальных и клинико-биохимических исследованиях в
качестве основного метода оценки состояния активности процессов ПОЛ и
антиоксидантного статуса различных биологических объектов использовалось
измерение кинетики Ре²⁺-индуцированной хемилюминесценции,

сопровождающей цепное окисление липидов.

Концентрация ионов Fe²⁺, при которой достигается самоускоряющееся образование продуктов свободнорадикального окисления, получила название «критической концентрации» [Fe ] (Владимиров, Арчаков, 1972; Погосян Г.А. и соавт, 1996). Дреминой (1992) показано, что кинетика ПОЛ, индуцированного ионами Ре²⁺обьясняется изменением реальной концентрации Fe²⁺, связанного с фосфолипидными мембранами.

В настоящее время описаны 3 основные реакции образования свободных радикалов под действием ионов двухвалентного железа (Владимиров Ю.А., 1998). Первая - это реакция разложения перекиси водорода (реакция Фентон) с образованием гидроксильных радикалов, вторая - реакция разложения гипохлорита с большим выходом гидроксильных радикалов и третья реакция -взаимодействие ионов двухвалентного железа с гидроперекисями

ненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов различных биологических мембран. В этом случае реакция образования радикалов в присутствии ионов двухвалентного железа становится разветвленной и дает начало новым цепям окисления. В присутствии ионов двухвалентного железа образуются прежде всего гидроксильный радикал и липидные радикалы, участвующие в реакциях цепного окисления ненасыщенных жирнокислотных цепей липидов и липопротеинов плазмы крови: l)Fe²⁺ + LOOH' -> Fe³⁺ + LO"' + ОБГ -> Ш₂*

Взаимодействие Fe²⁺ с липидными гидроперекисями в биологических системах продуцирует новые липидные радикалы в цепных реакциях переокисления: 2)L0₂* + LH* -> Fe³,⁺ + LOOH +L* ~+ LOOH + L0₂*

Реакция между Fe~⁺ и липидными радикалами заканчивается полным окислением железа и формированием стабильных молекулярных продуктов: 3) Fe²⁺ + L0₂* -> Fe³⁺+ стабильные молекулярные продукты.

Следовательно, ионы двухвалентного железа, вступая в реакции с различными субстратами на разных стадиях хемилюминесцентного процесса, индуцируют развитие кинетической кривой с рядом ХЛ параметров.

Для инициирования реакции ПОЛ в суспензию исследуемого
биологического образца (тканевые гомогенаты мозга, плазма крови, или
суспензия липопротеинов) вводится необходимое количество

свежеприготовленного подкисленного раствора двухвалентного железа (FeS0₄ 7Н₂0). Во всех экспериментах мы использовали избыточную концентрацию сернокислого железа (2,5 мМ), исключающую проявление его прооксидантных свойств.

Хемилюминесцентная реакция индуцированного железом ПОЛ протекает через ряд последовательных стадий. Можно выделить несколько характерных

стадии кинетики этого процесса. На рис. 2 представлена типичная картина изменения хемилюминесценции с двухфазной кинетикой свечения. В ответ на добавление сернокислого железа происходит быстрая вспышка хемилюминесценции (h) (она длится несколько десятков секунд) и ее интенсивность характеризует уровень предобразованных продуктов ПОЛ (прешгущественно гидроперекисей липидов). На этой стадии процесса происходит разложение липидных перекисей, содержащихся в образце. В случае достаточной концентрации железа интенсивность быстрой вспышки ХЛ будет зависеть только от относительного содержания гидроперекисей в растворе.

Рис. 2. Типичная кривая развития Ре²⁺-индуцированной хемилюминесценции биологического образца при перекисном окислении липидов

Затем наблюдается латентный период (т) в развитии ХЛ, свидетельствующий о резистентности субстрата к дальнейшему окислению. По длительности латентного периода судят об антиоксидантном эндогенном потенциале: чем больше в исследуемой пробе различных антиоксидантов, тем

более длительное время он продолжается. Поскольку двухвалентное железо не полностью расходуется на первом этапе реакции, по окончании латентного периода начинается медленная фаза возгорания ХЛ (Н), связанная с дальнейшим окислением ионов двухвалентного железа и накоплением продуктов ПОЛ. Интенсивность ХЛ нарастает постепенно, достигает своего максимума и затем начинает снижаться. Величина медленного возгарания ХЛ (максимально возможная интенсивность ХЛ) отражает способность субстрата к окислению. ХЛ. Затем происходит постепенное затухание хемилюминесцентного процесса до величины стационарного свечения, Природа ХЛ на данном этапе процесса остается неясной, поскольку механизм ХЛ реакций, определяющих стационарное свечение в настоящее время полностью не определен.

Кроме величины быстрой вспышки и латентного периода показательном является светосумма (S) ХЛ,. регистрируемая за первые 15-30 мин возгорания ХЛ, как показатель интенсивности образования перекисных.радикалов в ходе Ре²⁺-индуцированного окисления мембранных липидов.

Для оценки адекватности результатов, получаемых с помощью Fe²⁺-индуцированного хемилюминесцентного анализа, мы провели исследование степени изменяемости параметров хемилюминесцентной. кривой в зависимости от концентрации вводимого в пробу антиоксидантного вещества на примере карнозина в модельной системе in vitro.

В таблице 5 представлены данные о характере изменений параметров хемилюминесценции липопротеинов, выделенных из сыворотки крови здоровых лиц, в присутствии различных концентраций карнозина. Конечная концентрация карнозина в пробе составила 1,0 мМ, 2,5 мМ, 5,0 мМ, и 10,0 мМ;

Из таблицы видно, что в присутствии карнозина все параметры, регистрируемые по кривой ХЛ, претерпевают специфические изменения. Обнаружилось, что карнозин, добавленный в среду инкубации существенно

снижает амплитуду начальной вспышки на 55, 66, 68 и 76% соответственно нарастанию концентрации карнозина в ; пробе и увеличивает латентный период на 19, 42, 92 и 118% - соответственно. Снижение максимальной интенсивности ХЛ (Н) под действием карнозина также характеризуется отчетливой концентрационной зависимостью (на 4, 20, 49 и 75% соответственно).

Таблица 5. Параметры Fe—индуцированной хемилюминесценции липопротеинов сыворотки донорской крови в присутствии различных концентраций карнозина (результаты представлены в процентах по отношению к контролю).

Таким образом, карнозин продемонстрировал значительную защиту липопротеинов от окисления, пропорциональную его концентрации в пробе. Была получена четкая зависимость изменения параметров хемилюминесцентной кривой в соответствии с концентрацией карнозина в пробе.

Использование Ре²⁺-индуцированной хемилюминесценции в качестве основного метода исследования активности процессов ПОЛ и антиоксидантного потенциала обусловлено прежде всего тем, что ХЛ относится к прямым методам изучения реакций свободных радикалов. Развитие хемилюминесценции при Ре²⁺-индуцированном ПОЛ в основном определяется реакциями активных форм кислорода.

В наших исследованиях измерение Ре²⁺-индуцированой ХЛ, проведенное на большом фактическом материале с использованием различных субстратов

окисления (липопротеины сыворотки крови, гомогенаты мозговой ткани), позволило нам экспериментально определить наиболее значимые и информативные кинетические параметры ПОЛ, включающие уровень предобразованных липидных гидроперекисей (h), эндогенный антиоксидантный потенциал (т), максимальную интенсивность ПОЛ (Н), отражающую способность липидного субстрата к окислению. Кроме того, в ряде случаев мы измеряли светосумму ХЛ (S). Эти исследования позволили нам обосновать преимущество хемилюминесцентного анализа' по сравнению с другими методами оценки активности свободнорадикальных процессов.

Похожие диссертации на Окислительный стресс и защита головного мозга от ишемического повреждения

Роль окислительного стресса и нарушений обмена глутамата в патогенезе повреждений головного мозга и печени плода, развивавшегося в условиях нарушенного маточо-плацентарного кровообращенияМаслюкова Анна Валерьевна

Состояние процессов липидной пероксидации и цитокиновый ответ в остром периоде черепно-мозговой травмы при право- и левополушаных повреждениях головного мозга.Садова Валентина Алексеевна

Защитное действие от окислительных повреждений головного мозга антиоксидантов и модуляторов активности глутаматных рецепторовДобротворская Ирина Сергеевна

Биохимические механизмы повреждения головного мозга плода и новорожденного, развивавшегося в условиях нарушения маточно-плацентарного кровообращения, и их коррекция (экспериментальное исследование).Томилова, Ирина Константиновна

Чувствительность к глюкокортикостероидам и свободно-радикальное окисление в структурах головного мозга при гипокинетическом стрессеСтрельников Илья Владимирович

Коррекция окислительного стресса мозга с помощью природных и синтетических антиоксидантовСтепанова Мария Сергеевна

Оксидативный стресс и морфогенез в спинном мозге на этапах старения человекаТелешева Ираида Борисовна

Биохимия стресса и формирования устойчивости у картофеля при повреждении колорадским жукомЦветкова Мария Александровна

Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стрессаЧистяков, Владимир Анатольевич

Роль динитрозильных комплексов железа в защите биомолекул и клеточных структур от окислительного, нитрозативного и карбонильного стрессовШумаев, Константин Борисович