Введение к работе
Актуальность проблемы. Общепринято, что среди основных факторов риска развития атеросклероза гиперхолестеринемии ( ГХС ) принадлежит ведущая роль {Аничков, 1956; Климов, 1995; Чазов, 1998; Grundy a. Denke, 1990; Grundy, 1990). Многочисленные экспериментальные, эпидемиологические и клинические исследования показывают, что развитие ГХС обусловлено как нерациональным питанием, так и генетическими факторами (Климов, 1995; Чазов, 1998; Grundy а. Denke, 1990; Grundy, 1990 ; Ordavas et al, 1995; 1998). К основным показателям нерационального питания, способствующим увеличению уровня холестерина (ХС) в плазме относятся: избыточное потребление ХС и насыщенных жирных кислот (ЖК), а также высокая калорийность пищи.
Печени принадлежит ведущая роль в поддержании нормального уровня ХС в плазме, и достигается это за счет скоординированной регуляции в печени нескольких процессов; (а) синтеза холестерина; (б) поглощения и катаболизма липопротеидов (ЛП); (в) продукции липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП); (г) окисления ХС до желчных кислот и их удаления в составе желчи ( Dietschy et al., 1993 ). Известно, что основной причиной развития алиментарной ГХС является снижение в печени активности специфических ЛНП-рецепторов, осуществляющих выведение из кровотока апо В-содержащих ЛП, обогащенных свободным и этерифицированным ХС (Brown a. Goldstein, 1986; Grundy a. Denke, 1990; Dietschy et al.,1993). Механизмы регуляции экспрессии гена этого рецептора пищевым ХС были детально изучены в ставших уже классическими работах Нобелевских лауреатов Гольдштейна и Брауна ( Brown a. Goldstein, 1986 ; 1997). В последние годы проводятся аналогичные исследований по выяснению роли пищевых липидов и ХС в регуляции секреции апо В-содержаших ЛП и синтеза желчных кислот, а также вкладе этих процессов в развитие алиментарной ГХС. Если гиперлродукция апо В-содержащих ЛП может приводить к развитию ГХС, то стимуляция синтеза желчных кислот в печени и их последующая экскреция с желчью может являться одним из основных механизмов защиты от развития ГХС (Danielsson etal., 1975; Vlachcevic et al., 1994; Schwartz etal., 1998).
Экспериментальные и клинические исследования, выполненные к началу этой работы, не позволили сделать однозначных выводов о стимуляции пищевым
ХС продукции ЛОНП печенью и о ее вкладе в развитие ГХС (Davis et at., 1983; Roth etal., 1963; McKinnon et al., 1985; Kroon et al., 1986; Grundy, 1990). В то же время в многочисленных исследованиях на крысах было установлено, что пищевой ХС стимулирует синтез желчных кислот и активирует ХС-7а-гидроксилазу (ХС-7а-ОН), и тем самым запускается механизм защиты от развития ГХС (Vlachcevic et al., 1994; Schwartz et al., 1998). Однако, до настоящего времени остается открытым вопрос о наличии этого механизма в защите от развития алиментарной ГХС у человека и у некоторых видов животных.
Все еще недостаточно изучен вопрос о причинах различной индивидуальной чувствительности к пищевому ХС и вкладе в этот феномен таких процессов обмена ХС как синтез желчных кислот, продукция ЛОНП, а также обратный транспорт ХС (Beyenen et al., 1987 Clarkson et at., 1990; Ordovas et al., 1995 ). Результаты этих исследования во многом будут способствовать созданию новых гипохолестеринемических препаратов с избирательным механизмом действия.
В последнее время клинической практикой было подтверждено, что статины
не являются универсальными препаратами для лечения всех форм
дислипопротеидемий у человека (Farmer, 1998; Durrington a. Illingworth, 1998). В этой
связи возобновился интерес к другим до недавнего времени широко используемым
гиполипидемическим препаратам, включая фибраты (Staels et al., 1998 ) и пробукол
(Ланкин и соавт., 1991 ; Лупанов и соавт., 1993; Yokoi et al., 1997). Установлено, что
фибраты являются наиболее эффективными при лечении
гипоальфалипопротеидемии и гипертриглицеридемии (ГТГ), сопряженной с неинсупин-зависимым диабетом (NCEP, 1993). К положительному терапевтическому эффекту фибратов относят не только снижение уровня апо В-содержащих ЛП в плазме ( Olsson a. Lang, 1978; Tikkanen, 1992 ), но и увеличение содержания ХС-ЛВП и их основных апо; ало А-1 и апо А-Н ( Bard et al., 1992 ; Staels a. Auwerx, 1997; 1998), играющих ключевую роль в системе обратного транспорта ХС и обеспечивающих защиту от ИБС ( Fielding a.Fielding, 1995). Лишь в последние годы наметился существенный прогресс в понимании молекулярных механизмов действия фибратов ( Staels a. Auwerx, 1997; Staels et al, 1998). В экспериментах на крысах было показано, что фибраты стимулируют пролиферацию пероксисом и активируют пероксисомальные ферменты, передавая сигнал на уровень генов через специфический рецептор (PPARa), являющийся транскрипционным фактором
(Dreyer et al., 1992). Эти данные позволили нам высказать и экспериментально проверить гипотезу, что изменение фибратами содержания основных аполипопротеинов ЛОНП (апо В и апо C-III) и ЛВП { апо A-I и апо A-II) может быть связано с изменением в печени уровней экспрессии генов этих апо.
Помимо фибратов, к препаратам с комплексным и положительным эффектом при лечении сердечно-сосудистых заболеваний и атеросклероза относится пробукол, обладающий умеренным гипохолестеринемическим, выраженным антиоксидантным и прямым антиатеросклеротическим действием. Гипохолестеринемический эффект пробукола, как установлено, связан с увеличением клиренса ЛНП печенью и стимуляцией обратного транспорта ХС через воздействие на различные этапы этого процесса (Лякишев и соавт., 1995; DISP, 1989; Ying et al, 1990 ). В то же время оставалось неизвестным его влияние на ключевой процесс выведения ХС из кровотока - синтез желчных кислот. Решению этих проблем и была посвящена настоящая работа.
В последние годы подавляющее большинство исследований по этой проблематике проведены на крысах или культивируемых гепатоцитах крысы, являющихся самыми распространенными и доступными моделями для научных и прикладных исследований. В то же время достоверно установлено, что результаты, полученные на крысах в большинстве случаев нельзя экстраполировать на человека и возникает необходимость в проведении самостоятельных исследований на гепатоцитах человека. (Gibbons, 1994; Staels a. Auwerx, 1997; Staels a. Auwerx, 1997; Schwarz et al, 1998). В этой связи настоящая работа выполнена на первичных культурах гепатоцитов человека и кролика, которые являются наиболее подходящими моделями как для изучения метаболизма холестерина и ЛП в печени человека, так и для выяснения механизма действия лекарственных препаратов (Косых и соавт., 1989; Kosykh et al., 1987; Gibbons, 1994; Staels et al., 1995). Уели исследования.
А. Изучить в эксперименте обмен холестерина в гепатоцитах в ответ на пищевую холестериновую нагрузку, приводящую к развитию гиперхолестеринемии. Б. Выяснить механизмы гиполипидемического действия фибратов и пробукола. Задачи исследования:
1. Изучить воздействие пищевого ХС на продукцию ЛОНП гепатоцитами и выяснить
роль этого процесса в развитии у кроликов ГХС, индуцированной. как чистым ХС,
так и ХС, содержащим продукты его автоокисления.
2. Исследовать влияние ЛП с различным липидным составом на продукцию
ЛОНП культивируемым гепатоцитами. Определить изменения в уровне апо В мРНК
и секреции апо В под влиянием ЛП с различным липидным составом, а также
эстерифицированного и свободного ХС.
3. Выявить особенности в метаболизме ХС в гепатоцитах кроликов с
различной чувствительностью к развитию алиментарной ГХС.
-
Изучить воздействие рХМ, р-ЛОНП и ЛВПг на синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика и человека.
-
Выяснить механизм воздействия пробукопа на синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика.
6. Изучить воздействие фибратов на продукцию гепатоцитами основных
аполипопротеинов ЛОНП и ЛВП:
A. определить изменения в секреции апо В и внутриклеточном уровне апо В мРНК
под влиянием безафибрата.
Б. выяснить влияние фибратов на уровень экспрессии гена апо С-ІІІ в печени крыс и культивируемых гепатоцитах крысы и человека.
B. исследовать воздействие фибратов на уровень экспрессию генов апо A-I и апо
А-Н в культивируемых гепатоцитах человека.
Научная новизна работы.
Впервые было показано, что гиперпродукция гепатоцитами частиц ЛОНП может является одной из основных причин развития ГХС у кроликов, содержавшихся на обогащенном ХС корме. У кроликов, получавших как чистый, так и содержащий продукты автоокисления ХС (около 5%), в равной мере увеличивается секреция гепатоцитами частиц ЛОНП. Наличие продуктов автоокисления ХС в корме, с высоким содержанием ХС, вызывает значительное увеличение секреции частиц ЛОНП, обогащенных ЭХС, что может быть причиной относительно быстрого развития ГХС у кроликов.
В исследованиях in vitro было показано, что избыточное поступление в культивируемые гепатоциты нейтральных липидов в составе обогащенных ТГ рХМ
и обогащенных ХС ЛП (Р-ЛОНП и ЛНП) приводит к увеличению количества секретируемых клетками частиц ЛОНП. Увеличение продукции апо В осуществляется на посттранскрипционном уровне. Установлено, что как вновь-синтезированные ЭХС, так и свободный ХС способны стимулировать продукцию апо В-содержащих ЛП гепатоцитаии человека.
Впервые было установлено, что в основе феномена устойчивости части популяции кроликов к развитию алиментарной ГХС может лежать как относительно высокая и устойчивая к пищевой нагрузке базальный скорость синтеза желчных кислот, так и относительно высокий уровень секреции гепатоцитами апо Е, который обеспечивает более эффективный обратный транспорт ХС в печень. В то же время повышенная чувствительность кроликов к развитию алиментарной ГХС может быть обусловлена относительно низкой базальной скоростью синтеза желчных кислот и значительным ее снижением при пищевой ХС нафузке, в результате чего увеличивается секреции обогащенных ЭХС ЛОНП и уровень ХС в плазме.
В экспериментах in vitro установлено, что в отличие от крыс, нафузка гепатоцитоа кролика и человека липидами рХМ приводит не к увеличению, а к
снижению синтеза желчных кислот, тогда как частицы р-ЛОНП и ЛВПг, участвующие в обратном транспорте ХС, стимулируют этот процесс независимо от видовой принадлежности клеток. ЛВПг, добавленные одновременно с рХМ в культуру гепатоцитов, способны значительно нивелировать эффект подавления рХМ синтеза желчных кислот, что подтверждает предположение о ключевой роли ЛВПг в обратном транспорте ХС и в поддержании нормального уровня ХС в плазме при пищевой нагрузке ХС. В экспериментах in vitro показано, что ингибирование синтеза желчных кислот пищевыми ХС и липидами в гепатоцитах является характерной и существенной отличительной особенностью кролика и человека, поскольку у крысы в этих условиях отмечается стимуляция синтеза желчных кислот. Подавление рХМ синтеза желчных кислот может быть следствием увеличения внутриклеточного содержания ЖК, а также уменьшения пула ХС, используемого для синтеза желчных кислот.
Пробукол и ос-токоферол в терапевтической концентрации стимулируют
синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика и человека. Установлен механизм стимуляции пробуколом синтеза желчных кислот.
Получены принципиально новые данные по механизмам плейотропного воздействия фибратов на метаболизм липидов и аполипопротеинов в гепатоцитах. Показано, что фибраты: а) снижают секрецию гепатоцитами частиц ЛОНП, не оказывая влияние на транскрипцию апо В гена; б) снижают в печени экспрессию гена апо C-III на транскрипционном уровне, в результате чего может активироваться гидролиз ТГ-богатых ЛП и ускоряться их выведение из кровотока печенью; в) увеличивают уровень экспрессии генов апо А-1 и апо А-Н в гепатоцитах человека, что приводит к увеличению содержания этих апо в плазме.
Научно-практическая значимость работы.
Полученные результаты означают, что развитие алиментарной ГХС связано не только со снижением активности ЛНП рецепторов в печени, но и с увеличением продукции печенью частиц ЛОНП. Одним из основных механизмов устойчивости кроликов и , по-видимому, человека к пищевой нагрузке ХС является относительно высокая базальная скорость синтеза желчных кислот. Это создает базу для целенаправленного изучения указанных изменений в метаболизме липидов в печени человека, особенно среди пациентов с высоким риском ИБС и с умеренной ГХС, а также разработки новых лекарственных препаратов, способных избирательно стимулировать синтез желчных кислот и подавлять продукцию ЛОНП печенью. Полученные данные по механизму стимуляции пробуколом синтеза желчных кислот свидетельствуют о необходимости поиска новых более эффективных аналогов пробукола, стимулирующих систему обратного транспорта ХС и оказывающих минимальное побочное влияние на синтез апо А-1 в гепатоцитах. Экспериментальные результаты по стимуляции окисленными производными ХС продукции печенью частиц ЛОНП, обогащенных ЭХС, и их вовлеченности в развитие ГХС важно учитывать при решении вопросов диетотерапии и профилактики ГХС у человека.
Использованные в работе методические подходы исследования на уровне
генов открыли новый этап в изучении механизмов действия гиполипидемических
препаратов. Полученные по механизмам действия фибратов данные закладывают
основу для выявления липидных (ЖК и др.) факторов питания и создания нового
поколения фармакологических препаратов, избирательно регулирующих
7 экспрессию ключевых генов метаболизма ЛП в печени. В работе экспериментально обосновано использование фибратов для коррекции дислипопротеидемий, связанных как с увеличением продукции частиц ЛОНП (гиперлипидемии), так и со снижением продукции апо А-1 печенью (гипоальфалипопротеидемии). Апробация диссертации состоялась 7 октября 1999 г. на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ. Основные результаты работы были представлены на различных Российских и Международных конгрессах, симпозиума и конференциях, в том числе на: 2-ом Российском национальном конгрессе" Человек и Лекарство" (Москва, 1995 г.); 1-ой Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза (Москва, 1999 г.); на 6-ом и 7-ом международном симпозиуме по метаболизму липидов (Дрезден, 1988; 1991г.); 3-ей международной конференции по метаболизму липидов (Дижон, 1990 г.); 55-ой (Брюгге, 1990 г.), 57-ой (Лиссабон, 1991 г.), 59-ой (Ницца, 1992 г.), 62-ой (Иерусалим, 1993 г.) конференциях Европейского Общества по изучению атеросклероза; Х-ом международном симпозиуме по атеросклерозу (Монреаль, 1994 г.); 66-ом конгрессе Европейского Общества по изучению атеросклероза (Флоренция 1996 г.); 13-ом международном симпозиуме " Влияние лекарств на метаболизм липидов " (Флоренция 1998 г.), 71-ой научной сессии американской ассоциации кардиологов (Даллас, 1998 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы, в том числе 18 статей в отечественных академических изданиях и 25 статей в международных изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6-ти глав литературного обзора, главы , посвященной материалам и методам, 5-ти глав, посвященных результатам собственных исследований и их обсуждению, выводов и списка литературы. Работа изложена на 222 страницах, содержит 26 таблиц и 38 рисунков. Список литературы включает 311 источников, из которых 16 опубликовано в отечественных и 295 в международных изданиях.
Похожие диссертации на Обмен холестерина в гепатоцитах при развитии алиментарной гиперхолестеринемии и механизмы действия пробукола и фибратов
