Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. Внеклеточные нуклеиновые кислоты: функции в биологических системах и применение в исследовательской и медицинской практике 7
1.1. Введение 7
1.2. Экзогенные нуклеиновые кислоты и их судьба в клетках млекопитающих 7
1.3. Нуклеиновые кислоты внеклеточных жидкостей 12
1.3.1. Нуклеи новые кислоты сред культур клеток 12
1.3.2. Нуклеиновые кислоты плазмы крови 14
1.3.3. Нуклеиновые кислоты других физиологических жидкостей 16
1.4. Биологические эффекты и функции внеклеточных нуклеиновых кислот 19
1.4.1. Внеклеточные нуклеиновые кислоты как возможные переносчики информации между клетками и органами иммунной системы. - 20
1.4.2. "Неспецифические" эффекты нуклеиновых кислот 22
1.4.3. Горизонтальный перенос генов 27
1.4.4. Биологические эффекты, детерминированные структурой и последовательностью внеклеточных нуклеиновых кислот 28
1.5. Нуклеиновые кислоты как противоопухолевые вакцины 32
1.5.1. Дендритные клетки, заполненные РНК 34
1.5.2. РНК-вакцины, основанные на заключении РНК в липосомы (липосомные РНК-вакцины) 35
1.5.3. «Голые» РНК-вакцины 36
1.5.4. Самореплицирующиеся вакцины 37
1.5.5. Иммунология РНК вакцин: механизмы и иммуномодуляторы 38
1.6. Генная терапия 40
1.6.1. Основные средства доставки генов в организм 40
1.6.2. Направленная доставка генов 43
1.6.3. Экспрессия трансфицированных генов 44
1.6.4.0 типах клеток-мишеней. Стволовые клетки 44
1.6.5. Генная терапия рака 46
2. Материалы и методы
3. Результаты и их обсуждение 59
3.1. Нуклеиновые кислоты плазмы молока человека 60
3.2. Олигонуклеотиды сыворотки крови 62
3.3. Олигонуклеотиды спинномозговой жидкости 65
3.4. Определение состава нуклеиновых кислот человеческого молока 72
3.5. Количественная оценка содержания РНК в человеческом молоке 78
3.6. Анализ РНК человеческого молока двумерным электрофорезом в ПААГ 80
3.7. Выделение индивидуальных олигорибонуклеотидов человеческого молока и установление их первичной структуры 80
3.7.1. Первичная структура олигорибонуклеотидов 1-3 84
3.7.2. Первичная структура олигорибонуклеотида 4 86
3.7.3. Первичная структура олигорибонуклеотида 5 89
3.8. Механизмы происхождения внеклеточных нуклеиновьк кислот в молоке человека 92
3.9. Биологические эффекты внеклеточных нуклеиновых кислот 94
3.9.1. Влияние внеклеточных РНК человеческого молока на фосфорилирование молочных белков 95
3.9.2.Влияние внеклеточных РНК молока на жизнеспособность клеток аденокарциноми молочной железы человека MCF-7 97
4. Выводы 104
5. Список литературы 105
- Нуклеи новые кислоты сред культур клеток
- Основные средства доставки генов в организм
- Олигонуклеотиды спинномозговой жидкости
- Механизмы происхождения внеклеточных нуклеиновьк кислот в молоке человека
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время нуклеиновые кислоты (НК) и их синтетические аналоги получают все большее распространение в научной и медицинской практике не только как инструменты исследования, но и как потенциальные лекарственные средства. Именно поэтому усилия многих научных лабораторий сегодня сосредоточены на изучении способов проникновения нуклеиновых кислот и их производных внутрь клетки, их взаимодействия с биологическими макромолекулами и влияния на физиологические процессы.
В то же время, в последние годы во внеклеточных жидкостях организма млекопитающих были обнаружены собственные соединения нуклеотидной природы, в том числе высокополимерные фрагменты нуклеиновых кислот. Было показано, что некоторые из них играют важную роль в регуляции механизмов функционирования клеток и организма в целом. Эти соединения являются не только необходимыми метаболитами, но выступают как биоактивные вещества1, участвующие в регуляции многих процессов. Известно, например, что нуклеотиды и нуклеозиды молока обладают иммуномодулирующим действием, стимулируя выработку антител, способствуют адсорбции металлов в кишечнике и влияют на синтез полиненасыщенных жирных кислот на ранних стадиях развития новорожденных.
Кроме того, к настоящему моменту накоплены многочисленные данные о повышении концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот в организме при онкологических заболеваниях и при аутоиммунных и пульмонологических расстройствах.
Тем не менее, вопросы о механизмах появления, составе и возможных функциях собственных внеклеточных нуклеиновых кислот здорового организма во многом остаются открытыми.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось выделение и характеризация внеклеточных нуклеиновых кислот молока человека, а также исследование их возможных биологических функций.
В ходе исследования решались следующие задачи: - выделение внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы молока человека и сравнение их с наборами внеклеточных нуклеиновых кислот других жидкостей организма;
плазмы молока
определение концентрации нуклеиновых кисдот d препаратах плази
человека;
БИБЛИОТЕКА С Петеру 09
її т 1*
определение нуклеотидной последовательности внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы человеческого молока;
анализ влияния внеклеточных РНК молока человека на физиологические процессы, происходящие в молоке и культуре клеток молочной железы.
Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой первое систематическое исследование внеклеточных нуклеиновых кислот молока человека. Впервые проведено выделение набора нуклеиновых кислот молока и их сравнение с наборами внеклеточных нуклеиновых кислот спинномозговой жидкости и плазмы крови. Установлено, что основной формой нуклеиновых кислот плазмы человеческого молока являются фрагменты РНК длиной до 100 нуклеотидных звеньев, обладающие развитой вторичной структурой. Показано, что концентрация нуклеиновых кислот в плазме молока варьирует в интервале от 16 до 58 мкг/мл и является индивидуальной характеристикой донора. Впервые определены нуклеотидные последовательности ряда олигорибонуклеотидов плазмы человеческого молока и показано, что эти олигорибонуклеотиды являются фрагментами рибосомных и транспортных РНК. Установлено, что олигорибонуклеотиды человеческого молока участвуют в процессах фосфорилирования/дефосфорилирования белков молока. Показано, что препараты суммарной РНК человеческого молока оказывают цитопротективное действие на клетки MCF-7 в условиях холодового шока, которое проявляется при низкой плотности клеток. Цитопротективными свойствами обладают фрагменты РНК длиной не менее 30 нуклеотидов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на международных конференциях "RNA as therapeutic and genomic target" (Новосибирск, 2001), "Chemical and Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 2004), "Chemical Biology" (Новосибирск, 2005) и 5-ой международной конференции им. Я. Парнаса "Molecular Mechanisms of Cellular Signaling" (Киев, Украина, 2005).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 23 рисунка Библиография включает 237 литературных источников.
Нуклеи новые кислоты сред культур клеток
Процесс секреции - захвата нуклеиновых кислот был показан для самых различных клеток. Адаме и МсИнточ в работах с фибробластами эмбриона цыпленка обнаружили, что эти клетки секретиругот ДНК в комплексе с белками, липидами и РНК (общий размер секретируемых комплексов - около 5 х 10 дальтон) [35]. Оказалось, что источником ДНК-комплексов является цитозоль клеток, комплексы быстро захватьгеаются соседними клетками, оставаясь при этом неразрушенными [36]. ДНК этих комплексов транспортируется в ядра клеток-реципиентов, но не интегрирует в геном клетки-хозяина. Авторы предположили, что обнаруженная ДНК играет регуляторную роль [37].
Большой вклад в изучение проблемы секреции и захвата внеклеточных нуклеиновых кислот клетками и органами животных внесла группа под руководством Ф. Анкера, Эти исследователи обнаружили секрецию ДНК лимфоцитами человека и клетками предсердия лягушки [38-42]. Было показано, что выделяемая клетками ДНК является вновь синтезированной, двуцепочечной, имеет молекулярный вес от 3.5 х 105 до 3.7 х 10й Д [41] и секретируется в комплексе с низкомолекулярной РНК [42] и ферментами, способными осуществлять внеклеточный РНК-зависимый синтез ДНК [39, 40, 42]. Авторы высказали предположение, что циркулирующая ДНК может играть роль мессенджера, перенося информацию между клетками и тканями организма [26]. Мелгрен постулировал, что реутилизация ДНК является общим явлением, и репарация генома может проходить через обмен фрагментами ДНК [43]. Что касается РНК, то еще в 1971 г. Колодный продемонстрировал возможность передачи высокомолекулярной РНК между клетками млекопитающих в культуре. Автор предположил, что РНК переходит из клетки в клетку в местах межклеточных контактов, а не высвобождается в культуральную среду, захватываясь затем соседними клетками [44]. В 1972 г. Колодный и соавт. обнаружили РНК в культуральной среде нетрансформированных клеток и клеток, трансформированных вирусом ЗТЗ. Таким образом, вероятно, возможны оба варианта передачи РНК от клетки к клетке. Найденная РНК оказалась низкомолекулярной (2S - 5S) и устойчивой к действию РНКаз. Кроме того оказалось, что внеклеточная РНК метилирована в гораздо большей степени, чем известные тРНК и рРНК [45]. На основании этих данных авторы предположили, что РНК может играть роль посредника при передаче информации, активируя или инициируя синтез внеклеточных ДНК. Ситиков и соавт. обнаружили РНК в культуральных жидкостях исследованных линий супрессорных Т-клеток. Одна из этих линий, секретирующая супрессорный фактор, специфичный к клеткам Н9 лейкоза человека, продуцировала "на экспорт" РНК длиной около 135 нт; другая, секретирующая супрессорный фактор, специфичный к эпитопу молекулы главного комплекса гистосовместимости, экспортировала РНК длиной 380 нт. Авторы предположили, что эта РНК существует а виде рибонуклеопротеидных частиц и входит в состав растворимого специфического Т-супрессорного фактора [46]. При исследовании кинетики высвобождения нуклеиновых кислот культурами клеток HeLa и А431 было показано, что секретируемые клетками ДНК и РНК аккумулируются в культуральной среде и на поверхности исследуемых клеток. РНК культурапьной среды была представлена фрагментами длиной 100 - 200 нуклеотидов (2,5 5S), в то время как РНК, ассоциированная с поверхностью клеток, была высокомолекулярной (подвижность этой РНК соответствовала подвижности фрагментов ДНК длиной около 10 000 и.о.). Через 3 ч после обработки клеток буфером PBS/EDTA в культуральной среде обнаруживали фрагменты ДНК размером 0.4-, 0.85-, 1.5- и 8.5 - 10 тысяч п.о., а через 24 ч после такой обработки клеток в среде регистрировали только фрагменты ДНК длиной 8.5-10 000 п.о. [47]. 13.2. Нуклеиновые кислоты плазмы крови Было показано, что ДНК присутствуют в плазме крови человека в норме и при патологии [48-53]. Концентрация ДНК в плазме крови здоровых людей поданным разных авторов составляет 20-100 нг/мл [53 - 55] или 12-16 мкг/мл [49]. Концентрации 12 - 16 мкг/мл, полученные в работе [49], по-видимому, являются завышенными, поскольку используемый авторами метод забора крови иглой диаметром 0.5 мм может приводить к повреждению форменных элементов крови и загрязнению препарата плазмы клеточной ДНК. Концентрация нуклеиновых кислот в плазме крови онкологических больных значительно выше, чем в плазме крови здоровых людей, и составляет 300-400 нг/мл [53-56]. В крови матери в норме присутствуют как клетки, так и свободные нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) плода. Концентрация свободной ДНК плода в крови матери на 2 - 3 порядка выше, чем общая концентрация ДНК клеток плода, присутствующих в материнской крови [57]. С течением беременности концентрация ДНК плода в крови матери возрастает, особенно в последние 8 недель беременности [58]. Часть циркулирующей в крови матери ДНК плода происходит из элементов крови, остальная же - большая часть - из плаценты. Таким образом, увеличение содержания ДНК или клеток плода в крови матери может указывать на патологические процессы в плаценте или в организме плода [59]. Известно, что при онкологических заболеваниях [56], аутоиммунных растройствах [60] и некоторых пульмонологических патологиях [61] в плазме крови больных резко возрастает количество фрагментов ДНК размером около 180 п.о., что соответствует длине нуклеосомньгх фрагментов. Увеличение концентрации таких фрагментов ДНК в крови онкологических больных, вероятно, является результатом деградации клеточной ДНК вследствие массового апоптоза раковых клеток. В работе [62] показано, что низкомолекулярная ДНК появляется в организме млекопитающих в ответ на некоторые экстремальные воздействия. Так, после облучения в крови крыс обнаруживали ДНК длиной 180 и.о., количество которой коррелировало с дозой облучения. Эти ДНК обогащены G/C парами, их последовательности гомологичны различным повторяющимся элементам генома, и они способны образовывать достаточно устойчивые нуклеосомы. Хотя, нельзя исключить, что появление в крови таких ДНК также может быть связано с активизацией апоптотических и некротических процесов в организме животных вследствие полученной дозы облучения. Однако Анкер и соавт. отмечают, что присутствие ДНК в плазме крови можно объяснить не только процессами некроза или апоптоза клеток организма [50, 51]. Предполагают, что ДНК секретируется клетками постоянно, причем преимущественно это вновь синтезированная ДНК [39, 41, 51], и, таким образом, ни апоптоз, ни некроз не является единственным источником экстраклеточных ДНК.
Основные средства доставки генов в организм
Генетические конструкции можно вводить непосредственно в организм in vivo, а можно - в заранее извлеченные из организма его собственные или чужие клетки - ex vivo. В последнем случае можно говорить о генно- клеточной терапии. Если же в организм вводятся просто клетки, несущие здоровый естественный генетический набор, такая терапия называется клеточной. Современная генная терапия имеет дело главным образом с генной трансформацией соматических клеток [198].
В настоящее время применяются разные средства введения генов в клетки и в организм. К ним относятся прежде всего конструкции наиболее разработанных вирусных векторов, при которых используются ретро-, адено-, лентивирусы, аденоассоциированные вирусы, герпес-вирусы, вирусы гепатита В, а также искусственно создаваемые вирусы, которые сочетали бы желаемые качества. Помимо этого, используют катионные липосомы с образованием ДНК-липидных комплексов, комплексы ДНК с полилизином, синтетические микросферы с плазмидной ДНК. Все эти способы доставки генов имеют свои преимущества и недостатки. Ретро-вирусы, например, способны обеспечить стабильную экспрессию гена, но имеют ограниченную емкость для внедрения трансгена и встраиваются в геном только делящихся клеток. Кроме того, ретровирусы представляют определенную опасность, поскольку в результате случайной рекомбинации возможно возникновение инфекционного вируса, приводящего к возникновению рака. Аденовирусы имеют большой размер генома и тропность к широкому спектру тканей, но они не встраиваются в геном и не могут обеспечить стабильную экспрессию встроенных генов. Кроме того, аденовирусы вызывают иммунный ответ хозяина и реакцию воспаления [199, 200].
Для транспорта ДНК в цитоплазму и далее в ядро клетки применяют различные комплексообразукхдие и конденсирующие агенты. С этой целью используют поливалентные катионы, поликатионы (спермин, спермидин, гистоны), а также полимеры (полиэтиленимины, катионные липосомы). Полиионные комплексы ДНК с катионными полимерами считаются наиболее перспективными кандидатами для невирусных систем доставки генов [201].
Другое направление, расширившее возможности генной терапии, - развитие искусственных хромосом как дополнительного средства поддержания целостности вводимого гена. Использование искусственных хромосом особенно актуально при необходимости корректировать большие делецин или инсерционные мутации. Однако они могут играть определенную роль в инициации анеуплоидии.
Способность естественных фрагментов хромосомы человека служить вектором для введения больших отрезков ДНК человека в мьппь была впервые продемонстрирована в 1997 г. По сравнению с ранее использованными векторами хромосомный вектор имеет ряд преимуществ: 1) использование в качестве трансгена полной геномной последовательности, включающей все интроны и значимые регуляторные элементы, что обеспечивает правильную и контролируемую экспрессию трансгенов in vivo; 2) введение больших генов и кластеров генов, для которых неприемлема техника клонирования; 3) отсутствие риска инсерционного мутагенеза, благодаря полному отделению от хромосом хозяина [202]. В качестве перспективных векторов также рассматривают синтетические полимеры типа полиэтиленоксид-полиэтилэтилен, а также биологические полимеры (декстран, желатин), образующие при определенных условиях упаковки микросферы, называемые полимеросомами. Они растворяются в живых тканях, способны к биодеградации и в то же время могут служить в качестве депо. Одна из таких векторных конструкций - Solvoplex -представляет собой комбинацию ДНК и органических растворителей [203]. Для доставки генов в клетки также используют методы электропорации и магнитофенции. При магнитофенции генные вектора ассоциируют с супермагнитными наночастицами, и направленную доставку генов осуществляют в магнитном поле. Магнитофенция обеспечивает высокую производительность трансфекции in vitro и улучшает ее эффективность in vivo [204]. В последнее время предпринимаются активные попытки создания конструкций, улучшающих захват превносимой ДНК ядром клеток-мишеней. Одним из таких подходов является связывание ДНК с синтетическими пептидами, содержащими сигналы ядерной локализации (NLS - nuclear localization signal). При этом результирующий комплекс ДНК-NLS узнается как ядерный субстрат специфическими рецепторными белками [205]. Активно разрабатываются методы коррекции генных дефектов путем исправления или замены "больного" гена непосредственно в геномной ДНК. При этом в культуру клеток добавляют небольшие по размерам синтетические комплементарные гибридные молекулы ДНК/РНК - химеропласты. В последовательность шпилечной структуры ДНК/РНК включают нужное основание, по которому планируется замена. Поскольку химеропласт комплементарен участку геномной ДНК, несущему мутацию, при смешивании химеропласта и геномной ДНК чаще происходит гомологичная рекомбинация. Другой подход, направленный на коррекцию самого генома, - метод выбрасывания экзона. При этом in vitro в культуру клеток вводятся короткие анти смысловые последовательности РНК, комплементарные местам сплайсинга первичного РНК-транскрипта. Их гибридизация в ядре приводит к проскальзыванию петли сплайсинга с захватом и выбрасыванием из мРНК экзона, несущего мутацию. Оба метода могут быть применены только ex vivo. Затем "исправленные" клетки пересаживаются в организм больного [198].
Олигонуклеотиды спинномозговой жидкости
Возможно, обнаруженные олигонуклеотиды могли попасть в СМЖ при черепномозговой или спинномозговой травме в результате некротической гибели или разрушения клеток. В этом случае в препаратах СМЖ должны были наблюдать высокий уровень маркерных цитоплазматических ферментов. Однако анализ содержания 3-фосфоглицераткиназы в образцах СМЖ по методу [223] показал наличие лишь следовых количеств этого фермента (данные не иллюстрированы). Таким образом, присутствие олигонуклеотидов в СМЖ, по-видимому, не являлось следствием лизиса или некроза клеток в результате перенесенной черепномозговой или спинномозговой травмы. Скорее всего эти олигонуклеотиды присутствуют в СМЖ здоровых людей.
Относительно происхождения олигонуклеотидов в СМЖ можно сделать следующие предположения. Возможно, фрагменты внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы крови транспортируются в СМЖ вместе с белками крови (например, альбумином) или независимым образом. Кроме того, обнаруженные нами олигонуклеотиды могут являться продуктами секреции клеток центральной нервной системы и клеток мозга, в частности лейкоцитов [40,42,46, 224].
Таким образом, нам удалось показать, что все исследованные внеклеточные жидкости (молоко, спинномозговая жидкость, плазма крови) содержат нуклеиновые кислоты. Наборы нуклеиновых кислот разных внеклеточных жидкостей значительно отличаются. Это свидетельствует о разных механизмах попадания фрагментов НК во внеклеточные жидкости или о существенных различиях в глубине и специфичности постсекреторной деградации этих НК. Согласно литературным данным [9, 13, 14, 225] и результатам настоящей работы (см. разделы 3.1 и 3.2), в организме млекопитающих внеклеточные нуклеиновые кислоты могут находиться как в комплексе с белками, так и в свободном состоянии. Поэтому можно предположить, что внеклеточные олигонуклеотиды СМЖ, как и олигонуклеотиды молока [70, 71 и раздел 3.1] и сыворотки крови [225 и раздел 3.2] присутствуют в организме в комплексе с белками. Следует отметить, что наборы олигонуклеотидсвязывающих белков СМЖ и сыворотки крови отличаются, о чем свидетельствуют данные по аффинной модификации белков этик внеклеточных жидкостей алкилирующим производным олиготимидилата ClRCH2NHpT(pT)24 (см. рис.7). Видно, что в случае СМЖ главным продуктом модификации является полипептид с молекулярной массой 36 кДа (р36) (до 90% радиоактивности от общего количества радиоактивности, включившейся в белки, обнаружено в полосе, соответствующей этому полипептиду) (рис. 7, дорожка 2). В случае сыворотки крови основным продуктом модификации является поли пептид с молекулярной массой 78 кДа (р78) (около 80% радиоактивности от общего количества радиоактивности, связанной с белками, найдено в полосе, соответствующей р78) (рис. 7, дорожка І), в то время как модифицированного продукта с молекулярной массой 36 кДа не обнаружено (рис. 7, дорожка 1). Учитывая молекулярную массу ковалентно присоединенного остатка реагента, равную приблизительно 8 кДа, можно заключить, что в случае СМЖ модификации подвергался в основном белок с молекулярной массой 28 кДа (р28) и в меньшей степени модифицировались белки с молекулярными массами 70 и 64 кДа (р70 и рб4 соответственно) (рис. 7, дорожка 2). В сыворотке крови алкилированию подвергался главным образом белок р70 и в меньшей степени белок р64. (рис. 7, дорожка 1). Очевидно, белок с молекулярной массой 28 кДа, в результате аффинной модификации которого образовывался р36, отсутствует в сыворотке, или его концентрация в СМЖ намного выше, чем в крови. 72 3.4. Определение состава нуклеиновых кислот человеческого молока Для определения природы углеводных остатков нуклеиновых кислот человеческого молока мы использовали несколько различных подходов. а) Разделение нуклеиновых кислот молока хроматографией на гидроксиаппатите (ГАГР. Известно, что различные формы нуклеиновых кислот удается эффективно разделить сорбционной хроматографией на ГАПе [219]. Как видно из данных рис. 8, времена элюции основного пула нуклеиновых кислот молочной плазмы с сорбента соответствуют временам выхода коротких фрагментов РНК. Оценка оптической плотности элюента при временах элюции ДНК позволяет говорить о том, что содержание ДНК в препаратах нуклеиновых кислот молока не превышает 0.5%. Эти данные указывают на то, что основной пул нуклеотидного материала молока представлен олигорибонуклеотидами. б ) Гидролиз фосфодиэфирных связей олигонуклеотидов молока ферментами и основаниями. Для установления структуры сахарофосфатного остова (0-рибоза/2-дезокси-0-рибоза) препараты нуклеиновых кислот плазмы молока человека подвергали обработке гидролизующими ферментами (ДНКазой I, РНКазой А) и щелочному гидролизу. Результаты представлены на рис. 9. Видно, что суммарный набор олигонуклеотидов молока практически не меняется под действием ДНКазы I (рис. 9, дорожка 2). В присутствии РНКазы А происходит частичный гидролиз олигонуклеотидов (рис. 9, дорожка 3). А под действием щелочи - деградация НК до нуклеозидмонофосфатов и коротких олигонуклеотидов (рис. 9, дорожка 4). Таким образом, анализ устойчивости фосфодиэфирных связей нуклеиновых кислот человеческого молока к действию гидролитических ферментов и оснований также показал, что суммарный пул олигонуклеотидов молока представлен, в основном, рибонуклеиновыми кислотами. Аналогичные данные мы получили для НК сыворотки крови (данные не представлены) и НК препарата сывороточного альбумина человека (рис. 4).
Механизмы происхождения внеклеточных нуклеиновьк кислот в молоке человека
Одним из наиболее важных аспектов в исследованиях структуры и функций экстраклеточных нуклеиновых кислот является вопрос о механизме их секреции во внеклеточное пространство. Известно, что количество эпителиальных клеток молочной железы, погибающих по механизму апоптоза, увеличивается и достигает максимума к завершению вскармливания [232]. Так как при этом происходит снижение концентрации РНК в молоке (рис. 12), можно заключить, что апоптотическая гибель секреторных эпителиоцитов дает несущественный вклад в процесс секреции РНК в молоко. Это заключение косвенно подтверждается данными о низкой концентрации в молоке фрагментов ДНК я продуктов их деградации (рис. 1, 8 и 9 а также [74]). Таким образом, наиболее оправданным является предположение об активной секреции РНК в молоко жизнеспособными клетками. Активная секреция РНК может быть обусловлена функционированием двух независимых механизмов: во-первых, транспортом РНК из кровотока, и, во-вторых, локальным синтезом и высвобождением РНК клетками молочной железы. Известно, что короткие внеклеточные олигонуклеотиды в сыворотке крови циркулируют в виде нековалентных комплексов с сывороточным альбумином и иммуноглобулинами [71, 225]. В то же время, существенная часть альбумина молока не синтезируется клетками молочной железы, а транспортируется в молоко из кровотока [233]. Возможно, с альбумином транспортируются и короткие РНК плазмы крови. Однако такой путь секреции РНК в молоко, видимо, не является основным, так как куполообразная зависимость изменения концентрации РНК в молоке от времени лактации не характерна для изменения концентрации сывороточного альбумина и иммуноглобулинов, концентрации которых лишь незначительно снижаются с увеличением времени лактации [79]. Кроме того, согласно полученным нами данным, спектры олигорибонуклеотидов молока человека и плазмы крови значительно различаются, в частности, в молоке выше относительное содержание фрагментов НК, протяженность которых превышает 28 нуклеотидных звеньев (рис. 5). Возможно, также, что транспорт нуклеиновых кислот из системного кровотока в молоко происходит по специализированному механизму, отличному от траясцитоза белков. От 3 до 5% массы человеческого молока составляют липиды, в основном -триацилглицериды в составе жировых гранул. Жировые гранулы формируются в цитоплазме эпителиоцитов молочной железы в виде триацилглицеридных капель. Капли, достигая апикальной мембраны эпителиоцита, обволакиваются клеточной мембраной и выталкиваются из клеток в полость альвеол. При этом небольшая часть цитоплазмы секреторных клеток оказывается заключенной между поверхностью капли и внутренней поверхностью мембраны жировых гранул [234]. Таким образом, механизм секреции триацилглицеридов мог бы объяснить присутствие в молоке компонентов цитоплазмы секреторных клеток, в том числе цитоплазматических РНК, большую часть которых составляют рибосомные и транспортные. В том случае, если бы этот процесс был единственным источником появления РНК в молоке, динамика изменения концентрации РНК коррелировала бы с изменением концентрации триацилглицеридов. Однако, как было показано ранее, концентрация РНК снижается, в то время как концентрация триацилглицеридов возрастает к завершению лактации [235]. Этот механизм не предусматривает также глубокой деградации РНК РНКазой А и 3 - фосфодиэстеразами, если полагать, что мембрана жировых гранул после отделения от эпителиоцита длительное время сохраняет непроницаемость для белков плазмы молока [234]. Какой из этих процессов в норме вносит основной вклад в формирование пула нуклеиновых кислот молока в настоящее время не установлено. Какова функция коротких фрагментов цитоплазматических РНК во внеклеточном пространстве? С одной стороны, в настоящее время в качестве основной роли рибонуклеиновых кислот молока обсуждается их пищевая ценность - РНК, как и рибонуклеозиды и рибонуклеотиды молока, рассматриваются в качестве "частично незаменимых" (semiessential) источников метаболитов, необходимых для постнатального развития млекопитающих [76]. С другой стороны, способность про- и эукариотических клеток как эндоцитировать, так и высвобождать внеклеточные РНК позволяет предположить, что реализации РНК сигналов осуществляется благодаря непосредственному участию интернализованных РНК в процессах модификации НК-мишенеЙ в цитоплазме и ядре клеток акцепторов. Исследования последнего десятилетия показали, что короткие некодирующие РНК играют важную роль в постранскрипционной модификации РНК: метилировании и псевдоуридинилировании рРНК и мяРНК, а сплайсинге мРНК, регуляции экспрессии генов и во многих других ключевых процессах в клетках млекопитающих. Подавляющее большинство коротких РНК цитоплазмы клеток млекопитающих составляют фрагменты рибосомных и транспортных РНК [147], хотя функции фрагментов этих форм РНК на сегодняшний день не установлены. В настоящей работе мы попытались проанализировать влияние внеклеточных РНК молока человека на некоторые физиологические процессы, происходящие в молоке и культуре клеток молочной железы. Известно, что добавление АТР к молоку человека приводит к фосфорилированию ряда белков [236]. Мы исследовали влияние выделенных из молока человека олигонуклеотидов на фосфорилирование белков молока. Было обнаружено, что в присутствии [у- Р]АТР в человеческом молоке происходит фосфорилирование белков с молекулярными массами 76, 38, 30 и 18 кДа, из которых мажорным фосфобелком является белок 30 кДа - Р-казеин (рис. 19, дорожка /). Добавление к молоку олигонуклеотидов или гепарина приводило к ингибированию фосфорилирования белка р38 и существенному уменьшению включения [32Р] в р18 (рис. 19, дорожки 2,3). Присутствие полианионов (олигонуклеотиды и гепарин) практически не влияло на фосфорилирование белка р76, хотя при этом наблюдали некоторое снижение фосфорилирования Р-казеина (рис. 19, дорожки 2, 3), Из полученных результатов следует, что изменение концентрации олигонуклеотидов в молоке человека может влиять на фосфорилирование его белков. Данные об изменении степени фосфорилирования белков, приведенные на рис. 19, подтверждены серией независимых экспериментов.
