Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Ферменты, содержащиеся в поджелудочной железе животных и методы их выделения 9
1.1.1. Рибонуклеаза (РНКаза) 10
1.1.1.1. Получение рибонуклеазы (РНКазы) 17
1.1.2. Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) 19
1.1.2.1. Получение дезоксирибонуклеазы (ДНКазы). 21
1.1.3. Фермент холестеролэстераза 24
1.1.3.1. Получение холестеролэстеразы 25
1.1.4. Фермент трипсин 26
1.1.4.1. Получение трипсина 29
1.2. Использование ферментов нуклеазного действия для получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-З'-монофосфатов и биосинтез их полифосфато 30
1.2.1 .Перспективные микробные нуклеазы 30
1.2.1.1. Перспективный фермент нуклеазного действия - S'-нуклеаза и технология его выделения 33
1.2.2. Синтез рибо- и дезоксирибонуклеозид-5- трифосфатов .34
1.2.3. Иммобилизация ферментов 38
1.2.4. Методы модификации сорбентов 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 47
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 50
3.1. Разработка методов получения РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы из поджелудочной железы крупного рогатого скота 50
3.1.1. Получение "грубых" экстрактов ферментов: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы 50
3.1.2. Фракционирование ферментов экстракта поджелудочной железы сульфатом аммония... 54
3.1.2.1. Выделение и анализ холестеролэстеразы 59
3.1.2.2. Выделение и анализ трипсина 60
3.1.2.3. Выделение и анализ ДНКазы 60
3.1.2.4. Получение РНКазы высокой очистки 64
3.1.2.5. Получение субстрата (РНК) для анализа активности фермента рибонуклеазы 73
3.1.2.6. Эффективность предлагаемого метода получения ферментов РНКазы, ДНК-азы, трипсина и холестеролэстеразы из поджелудочной железы крупного рогатого скота 75
3.2. Новые подходы к синтезу дезоксирибо- и рибонуклеозид-5;-монофосфатов и их трифосфатов 77
3.2.1. Получение субстрата ДНК для получения нуклеотидов .77
3.2.2. Выделение В'-нуклеазы из микробиологической субстанции —амилоризина 77
3.2.3 ИммобилизацияЗ'-нуклеазы 79
3.2.3.1. Адсорбционная иммобилизация З^нуклеазы на углерод минеральных неорганических носителях 79
3.2.3.2, Исследование ковалентной иммобилизации З'-нуклеазы на силикатных носителях 80
3.2.4. Гидролиз нуклеиновых кислот ферментом S'-нуклеазой 82
3.2.5. Получение и анализ ацетилфосфата лития 84
3.2.6. Ферментативное фосфорилирование индивидуальных NMP 84
3.2.7. Получение dNTP и NTP сопряжённым фосфорилированием продуктов гидролиза РНК и ДНК 86
ГЛАВА 4. Экспериментальная часть 89
4.1. Получение ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы 89
4.1.1. Получение субстрата (РНК) для анализа активности фермента рибонуклеазы 89
4.1.2. Очистка ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы 90
4.1.3. Электрофоретический анализ чистоты ДНКазы и РНКазы 96
4.1.4. Определение удельной активности ферментов 96
4.1.5. Стерилизация, розлив и лиофильная сушка 100
4.2. Новые подходы к синтезу дезоксирибо- и рибонуклеозид-5'-монофосфатов и их трифосфатов 101
4.2.1. Получение субстрата (ДНК) для ферментов ДНКазы и S1- нуклеазы 101
4.2.2. Выделение ферментного препарата в^нуклеазы из амилоризина 101
4.2.3. Определение активности S '-нуклеазы 102
4.2.4. Иммобилизация Б'-нуклеазы 104
4.2.5. Гидролиз ДНК ферментом Б'-нуклеазой 105
4.2.6. Гидролиз РНК В^нуклеазой в растворе 107
4.2.7. Гидролиз РНК иммобилизованной S'-нуклеазой 107
4.2.8. Последовательный гидролиз ДНК ферментами ДНК-азой и иммобилизованной S'-нуклеазой 107
4.2.9. Последовательный гидролиз ДНК ферментами ДНКазой и не иммобилизованной З нуклеазой 108
4.2.10. Получение и анализ ацетилфосфата лития 109
4.2.11. Выделение суммарного препарата нуклеотидилкиназ с ацетокиназой 109
4.2.12. Ферментативное фосфорилирование индивидуальных NMP 110
4.2.13. Ферментативное фосфорилирование NMP и dNMP в смеси 112
Заключение 113
Выводы 116
Список литературы 117
Благодарности 130
- Рибонуклеаза (РНКаза)
- Синтез рибо- и дезоксирибонуклеозид-5- трифосфатов
- Получение "грубых" экстрактов ферментов: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы
- Очистка ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы
Введение к работе
Постоянное расширение спектра работ по химико-ферментативному синтезу генетического материала, исследований в области молекулярной биологии, генной диагностики ставит задачу создания новых высоко эффективных методов получения ферментов обмена нуклеиновых кислот, предшественников и создание на их основе нуклеотидной базы.
Анализ известных методов получения ферментов вообще, и ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников в частности, показал, что практически все методы чаще всего направлены на получение одного реже двух индивидуальных ферментов. Огромные же количества так называемого "балластного" белка или "примесных" активностей, не содержащие целевого фермента отбрасываются. Кроме того, методы очистки ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот чрезвычайно разнообразны. Всё это создаёт ряд трудностей при организации производства данных ферментов в промышленных масштабах, приводит к нерациональному использованию материальных и трудовых ресурсов.
Одним из перспективных направлений, позволяющих успешно решить поставленные задачи по созданию экономичного, эффективного и надёжного промышленного подхода к получению ферментных препаратов, является унификация процедур фракционирования клеточных экстрактов и комплексное использование микробиологического и животного сырья, позволяющая получать несколько ферментных препаратов из одного образца биомассы.
Одновременное выделение внутриклеточных ферментов из одного и того же образца сырья осуществляется пока крайне редко, изучение его началось, по сути дела, только в последнее время. Перспективность совмещённых методов выделения ферментных препаратов, позволяющая более рационально использовать сырьё, реагенты и оборудование бесспорна. Бесспорна также необходимость проведения в этом направлении серьёзных и систематических исследований, которые в настоящее время, к сожалению, проводятся недостаточно активно и в России и за рубежом.
В связи с интенсивным развитием молекулярной биологии и генной инженерии, в настоящее время остро возникла проблема получения нуклеотидов, которые являются основными реагентами для проведения исследований в данных областях. Нуклеотиды являются к тому же основными реагентами в медицинских диагностических тест-системах, широко использующихся для диагностики бактериальных, вирусных, онкологических и генетических заболеваний,
В настоящее время производство нуклеотидов в нашей стране практически прекращено, одной из причин этого стала высокая стоимость змеиного яда.
К числу путей снижения себестоимости дезокси- и рибонуклеотидов относится поиск более дешевых и доступных ферментных препаратов, например, микробных, способных осуществлять гидролиз нуклеиновых кислот. Второй путь удешевления производства компонентов биосинтеза нуклеиновых кислот - применение в подходах получения иммобилизованных ферментов и создание на их основе биореакторов.
В связи с этим целью настоящей работы является получение высокоочищенных ферментных препаратов: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы, а также создание нового простого и экономичного подхода к препаративному синтезу нуклеотидов и их полифосфатов.
Научная новизна.
Найден подход, позволяющий разработать метод одновременного получения РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы высокой чистоты, из одной животного партии сырья.
Впервые, для очистки белков использованы методы ультрафильтрации на установках с полыми волокнами и хроматографической очистки на ДЭАЭ-целлюлозе, позволяющие добиться высокой очистки фермента рибонуклеазы.
Создана ферментная база для получения нуклеотидов на основе доступного сырья: дезоксирибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота и S!-uywiea3bi из амилоризина.
Впервые показано, что использование проточного биореактора с иммобилизованной S -нуклеазой является перспективным общим подходом к получению рибо- и дезоксирибонуклеозид-5;-монофосфатов.
Разработаны новые процедуры сопряжённого фосфорилирования продуктов гидролиза РНК и ДНК до дезокси- и рибонуклеозид-З'-трифосфатов с высокими выходами и высокой чистотой.
Цель исследования.
Разработка нового подхода, позволяющего получать высокоочищенные ферментные препараты: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы. Создание нового экономичного метода препаративного синтеза нуклеотидов и их полифосфатов.
Основные задачи исследования.
Предложить новый подход и разработать технологичный метод получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов РНКазы, ДНКазы, холестеролэстеразы и трипсина из одной партии животного сырья.
Создать базу высокоочищенных субстратов РНК и ДНК для анализа ферментов нуклеазного действия.
Создать ферментную базу для получения нуклеотидов: ДНКазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота (ПЖ КРС ) и S'-нуклеазы из амилоризина.
4. Получить с использованием собственной субстратной и ферментной базы
высокоочищенные дезокси- и рибонуклеозид-З'- монофосфаты с высокими
выходами.
5. Разработать новые процедуры сопряжённого фосфорилирования продуктов
гидролиза РНК и ДНК до дезокси- и рибонуклеозид трифосфатов.
Практическая значимость работы.
Разработанный подход получения ферментов (РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы) можно использовать в промышленном получении данных ферментов.
Разработанная процедура фосфорилирования продуктов гидролиза РНК и
ДНК иммобилизованной S -нуклеазой до дезокси- и рибонуклеозид-З'-
трифосфатов может быть использована в процессах промышленного
производства данных веществ.
Разработанный эффективный метод ковалентной иммобилизации S1-нуклеазы на силикатных носителях и создание биореактора непрерывного действия на его основе позволяет упростить получение дезокси- и рибонуклеозид-5 -монофосфатов.
Объём и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 130 листах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, заключения и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами. Список литературы содержит 209 источников, из которых 86 опубликованы в отечественных и 123 в зарубежных изданиях.
Диссертационная работа Бочкова Д.В. выполнена по программе НИР НИОХ СО РАН «Ферментативный синтез биологически активных соединений» в рамках интеграционной программы СО РАН №146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация».
Рибонуклеаза (РНКаза)
Поджелудочная железа крупного рогатого скота (КРС) и свиньи, в условиях промышленного производства мясных продуктов питания в Европе, Америке и многих стран Азии, является важным многотонажным сырьём для получения ферментных материалов.
Поджелудочная железа содержит ферменты нуклеазного {дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) и рибонуклеаза {РНКаза)), протеолитического и гидролитического действия {трипсин, химотрипсин, эластаза, холестеролэстераза) и ряд других ферментов. Секрет поджелудочной железы содержит несколько ферментов относящихся к классу гидролиз, в частности ферменты рибонуклеаза {РНКаза) и дезоксирибонуклеаза (ДНКаза), которые относятся к подклассу фосфодиэстераз. Фосфодиэстеразы — это ферменты гидролизующие эфиры, в которых остаток фосфорной кислоты связан с двумя ОН-группами. Трипсин, х имотрипсин и эластаза, являются эндопептидазами, роль которых состоит в расщеплении пептидных связей расположенных внутри пептидной цепи. Трипсин гидролизует пептидные связи, образованные основными аминокислотами Arg и Lys, химотрипсин специфически расщепляет пептидные связи неполярных аминокислот Туг, Тгр, Phe и Leu, а эластаза -преимущественно связи алифатических аминокислот Gly, Ala, Val и Lie. При этом гидролиз трипсином, химотрипсином и эластазой осуществляется по карбоксильным группам указанных аминокислот. Целый ряд других ферментов поджелудочной железы выполняют разнообразные функции. Так, пептиды малого размера атакуются карбоксипептидазами, которые, будучи экзопептидазами, отщепляют отдельные аминокислоты с С-конца пептидов. Холестеролэстераза гидролизует эфиры холестерина. Липиды гидролизует липаза, колипаза, фосфолипаза А и стеринэстераза, для действия которых необходимы соли желчных кислот [1]. а-Амилаза поджелудочной железы действует как эндогликозидаза на полимерные углеводы крахмал и гликоген с образованием мальтозы, мальтотриозы и других олигосахаридов. Предметом нашего исследования является разработка методов выделения ферментов рибонуклеазы (РНКазьі), дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), холестеролэстеразы и трипсина. Поэтому последующий материал содержит сведения, касающиеся этих четырёх ферментов. Рибонуклеаза панкреатическая (КФ 3.1.26.5) - гидролаза, относящаяся к подклассу фосфодиэстераз, гидролизует рибонуклеиновую кислоту (РНК). Высоким содержанием ферментов отличается поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиньи. Функциональная роль фермента рибонуклеазы в организме животных до конца не установлена. Существует предположение, что высокий уровень фермента РНКазы в поджелудочной железе необходим для переваривания большого количества РНК, образующихся за счет микрофлоры желудка жвачных животных [1]. Панкреатические рибонуклеазы животных обладают высокой видоспецифичностью. Рибонуклеазы разных видов животных отличаются уровнем содержания в поджелудочной железе, аминокислотной последовательностью, физико-химическими характеристиками и другими показателями. При выборе источника сырья для выделения фермента рибонуклеазы, в первую очередь, учитывается содержание этого фермента в поджелудочной железе того или иного вида животных и доступность сырья. Рибонуклеаза овцы отличается от рибонуклеазы крупного рогатого скота небольшими изменениями в аминокислотной последовательности: вместо треонина у нее в положении 3 стоит серии, вместо лизина во всех положениях стоит глютаминовая кислота. Кроме того, у рибонуклеазы А свиньи наблюдается иная последовательность аминокислотных остатков в положениях 99-104 чем у рибонуклеазы А овцы. Наибольшее соответствие с рибонуклеазой А человека имеет рибонуклеаза А свиньи. Фермента рибонуклеазы А содержится в поджелудочной железе свиньи в два раза больше чем в поджелудочной железе крупного рогатого скота. Но поджелудочная железа свиньи для нас была менее доступна, поэтому-новая методика получения рибонуклеазы была нами разработана на основе поджелудочной железы крупного рогатого скота, хотя данная методика переложима и на другое сырьё.
Фермент рибонуклеаза А крупного рогатого скота, выделенная из поджелудочной железы в кристаллическом виде, имеет молекулярную массу 13,7 кДа и состоит из 124 аминокислот [2]. Четыре внутрицепочечные -S-S-связи находятся между 72 и 65, 26 и 84, 58 и 109, 95 и 40 аминокислотами. Например, аминокислотная последовательность рибонуклеазы крупного рогатого скота можно представить следующим образом:
Синтез рибо- и дезоксирибонуклеозид-5- трифосфатов
Одним из путей снижения себестоимости дезокси- и рибонуклеозидмонофосфатов имеет место поиск более доступных и дешевых ферментных препаратов, например микробных, способных осуществлять гидролиз нуклеиновых кислот до нуклеозид-З -монофосфатов.
Многочисленный и разнообразный по физиологическим свойствам класс бактерий является источником уникальных по характеру действия на нуклеиновые кислоты ферментов.
Одни виды бактерий способны выделять ферменты нуклеодеполимеразы в окружающую среду, другие виды содержат ферменты нуклеодеполимеразы внутри клетки. Препараты нуклеаз бактериального происхождения нашли практическое применение в основном в качестве специфических реагентов при изучении структуры и функции нуклеиновых кислот. В частности, бактерии относятся к одному из источников препаративного получения высокоспецифических нуклеаз - эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз).
Для препаративного гидролиза нуклеиновых кислот, среди бактериальных нуклеаз, наибольший интерес может представлять внеклеточная нуклеаза Serratia marcescens. В культуральной жидкости разных штаммов Serratia marcescens обнаружены достаточно высокие как ДНКазная, так и РНКазная активности [77]. Процедура очистки ферментного препарата, включающая фракционирование сульфатом аммония, анионообменную хроматографию и гельфильтрацию на колонках, позволила получить высокоочищенныЙ фермент и изучить его свойства [78]. Фермент очищен в 2000 раз, не содержит фосфомоноэстераз и неспецифических фосфодиэстераз. На разных стадиях очистки ДНКазная и РНКазная активности фермента остаются постоянными и, очевидно, являются функцией одного белка. В культуральноЙ жидкости ДНКазная и РНКазная активности ферментов достигают максимального значения к середине стационарной фазы роста микробной популяции. Выход фермента составляет около 7000 единиц активности на литр культуральноЙ жидкости.
Динамика накопления продуктов гидролиза разной степени полимерности указывает на эндонуклеазный характер данной нуклеодеполимеразы. Гидролизат содержит незначительное (1,5-2,0%) количество нуклеотидов, а также широкий спектр (от ди- до пентануклеотидов) олигонуклеотидов. Продукты гидролиза содержат концевой фосфат в 5 -положении.
Таким образом, фермент нуклеодеполимераза из Serratia marcescens может рассматриваться в качестве перспективной замены панкреатической нуклеазы дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) для предварительного гидролиза ДНК на олигонуклеотиды.
С начала 60-х годов в литературе стала появляться информация о новых перспективных источниках нуклеаз из актиномицетов и микроскопических грибов. Tax, Сато и Эгами [79] обнаружили в препарате такадиастаза, представляющий собой суммарный ферментный препарат нуклеаз из плесневого гриба Aspergillus oryzae рибонуклеазу, названную РНКазой 7"/. Данная РНКаза расщепляет РНК по связям, образованным с участием гуаниловой кислоты. Заика А.И., Тяглов В.В. выделили термофильную нуклеазу из гриба Spicaria violacea, способную осуществлять гидролиз нуклеиновых кислот до 5 -мононуклеотидов [80]. Фермент Ті нуклеазу, сходную с ферментом РНКазой, обнаружил Танака у актиномицетов [81].
Первые препараты нуклеаз актиномицетов, полученные японскими авторами в начале 60-х годов, не нашли практического применения. Только после того, как в СССР началось проведение систематического изучения актиномицетов как продуцентов нуклеаз и было выделено и охарактеризовано несколько актиномицетных нуклеаз, стало ясно, что эти нуклеазы могут успешно применяться на ряду с нуклеазой Т}і фосфодиэстеразой из змеиного яда и нуклеазой из ядер печени. В частности, фермент экзонуклеаза А5 из Actinomyces sp. штамм 5 (группа coelicor) широко применяется в работах с нуклеиновыми кислотами. Нуклеаза А5 специфична к полимерам, обладающими вторичной структурой (т-РНК, нативная ДНК). Хорошие результаты дает применение данной нуклеазы в комплексе с эндонуклеазой, гидролизующей полимер на олигонуклеотиды. В случае с т-РНК, таким вспомогательным ферментом может быть эндонуклеаза А236 из Actinomyces sp. штамм 236 (группа viridis). Как показано в [82], при совместном действии этих двух нуклеаз, нативная т-РНК очень быстро количественно расщепляется на рибонуклеозид-З -монофосфаты.
Фермент экзонуклеаза А5 применялась также для получения 5 -мононуклеотидов из предварительно деградированных ДНК и РНК [83, 84]. Детально изучены также две ДНКазы актиномицетов, а именно, ДНКаза 1 и ДНКаза 2 из Actinomyces levoris [85]. Оба фермента являются типичными эндонуклеазамщ действующими на 3 -фосфодиэфирные связи нуклеиновых кислот ив результате чего, получаются 5 -концевые фрагменты различной длины: моно - 5%, ди - 10%, три — 17%, тетра - 28%, пента - 21%, остальные нуклеотиды -19%.
Наиболее перспективным на роль фермента, пригодного для получения нуклеозид-З -монофосфатов в препаративных масштабах может стать фермент 3!-нуклеаза из Aspergillus oryzae (К.Ф. 3.1.4.21). Фермент S -нуклеаза впервые был выделен Андо с соавторами из такаамилазы - промышленного препарата Aspergillus oryzae, содержащего большое разнообразие различных нуклеаз [86], однако до настоящего времени ещё продолжаются работы по очистки этого фермента от нежелательных примесей [87, 88, 89-91]. Фогт разработал способ очистки индивидуального препарата S -нуклеазы и детально изучил его свойства [87]. Фермент $ -нуклеаза - эндонуклеаза, специфичная к однонитевым нуклеиновым кислотам, способная гидролизовать как денатурированную тепловой обработкой ДНК, так и РНК. Продуктами гидролиза однонитевых нуклеиновых кислот являются соответственно дезоксирибонуклеозид-З -монофосфаты при гидролизе ДНК и рибонуклеозид-5 -монофосфаты при гидролизе РНК. S -нуклеаза - металлофермент с молекулярной массой 32 кДа, Максимальную гидролитическую активность фермент проявляет при рН 4,6 и температуре +45С.
Получение "грубых" экстрактов ферментов: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы
Необходимо отметить, что при фракционировании ферментов солями сульфата аммония из сернокислого экстракта возникает ряд сложностей, а именно: присутствие в сернокислом экстракте жироподобных и слизеобразных веществ снижает четкость дробного фракционирования при высаливании, затрудняет фильтрацию и увеличивает вязкость суспензии. Эти сложности снимаются увеличением объемов серной кислоты, используемой для экстракции из спиртового осадка белков поджелудочной железы. Экспериментально нами установлено, что оптимальным соотношением компонентов при экстракции спиртового осадка является 8 весовых частей серной кислоты к 1 весовой части осадка после экстракции спиртом. Фракционирование ферментов экстракта поджелудочной железы сульфатом аммония.
При осаждении ферментов из сложной смеси разнообразных белков имеет место явление соосаждения. После дегидратации белковых молекул в растворе солей, молекулы белка агрегируют не с идентичными, а с любыми другими "клейкими" молекулами, находящимися поблизости. Это приводит к получению препаратов, обогащенных различными сопутствующими балластными веществами. Однако при высаливании можно добиться не только осаждения всего комплекса ферментов, но и его фракционирования.
Высаливание белков связано с растворением солей в растворе, содержащем белки. Следует рассмотреть некоторые особенности этого процесса. Очень важна природа соли. Помимо ее эффективности, в смысле осаждения белков, необходимо учитывать такие физические характеристики соли, как растворимость. Наиболее эффективные те соли, анионы которых имеют большой заряд (например, сульфат, фосфат и цитрат). Катионы в этом отношении сравнительно менее важны. По способности к высаливанию анионы располагаются в ряд Гофмейстера, который выглядит следующим образом: SCN", Г, CIO ", N03", Br", СІ", СНзСОО", S042 , Р043". Хотя, судя по положению в этом ряду, фосфат более эффективен, чем сульфат, на практике при нейтральном значении рН фосфат состоит из смеси ионов НР042" и Н2Р04\ которые менее эффективны, чем Р04 \ Что касается эффективности действия катионов на осаждение белков, то моновалентные ионы можно расположить в следующий ряд: NH4 K Na. Из обычных недорогих солей эффективными осадителями белков являются сульфаты, фосфаты и цитраты натрия, калия и аммония.
Соли калия в большинстве своем не подчиняются общим правилам растворимости, хотя фосфаты калия можно вполне использовать. Цитрат натрия очень хорошо растворим, но редко дает какие-либо преимущества при осаждении белков, за исключением того, что его можно использовать при рН выше 8. Что же касается солей аммония, то с ними невозможно работать при высоких значениях рН вследствие их буферного действия. По той же причине цитрат нельзя эффективно использовать при рН ниже 7. Сульфат натрия образует несколько гидратов и имеет сложную фазовую диаграмму растворимости. При низкой температуре его растворимость невысока. Он был использован для очистки яичного альбумина, причем температуру поддерживали около +30С, чтобы соль имела достаточную растворимость. Только одна соль обладает всеми преимуществами и не имеет недостатков при работе с типичным белком - это сульфат аммония [39, 172]. Исключение составляют те случаи, когда нужно работать при высоких значениях рН.
После того, как было решено использовать сульфат аммония для фракционирования ферментов, предстояло определить, каким должен быть процент насыщения. При насыщении сульфатом аммония до концентрации 30 % происходит осаждение или агрегирование взвешенных частиц и высокомолекулярных белков. Таким образом, первое насыщение сульфатом аммония может служить способом отделения балластных белков.
Для выяснения уровня насыщения сульфатом аммония необходимого для осаждения РНКазЫу ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы из сернокислого экстракта, мы провели ряд экспериментов, результат которых отражен на рисунке 3.
Для этого мы постепенно (градиент 5%) увеличивали концентрацию сульфата аммония в сернокислом экстракте спиртового осадка поджелудочной железы [173]. После каждого добавления соли в сернокислый экстракт определяли активность ферментов в супернатанте, а после центрифугирования и в осадке (после его растворения в соответствующем буфере) [171, 174-177]. Затем сравнивали с удельной активностью того или иного фермента в сернокислом экстракте спиртового осадка поджелудочной железы.
Из рисунка видно, что при насыщении экстракта сульфатом аммония до 45% в осадок переходят основные количества холестеролэстеразы, дальнейшее насыщение экстракта до 60% приводит к осаждению трипсина. При насыщении экстракта сульфатом аммония до 80%, в осадок переходит основное количество ДНКазы, а РНКаза остается в надосадочнои жидкости. Таким образом, используя простую процедуру фракционирования можно полностью разделить четыре фермента холестеролэстеразу, ДНКазу, РНКазу и трипсин.
Эти результаты определили выбор принципиальной схемы выделения целевых ферментов из сернокислотного раствора, полученного экстракцией поджелудочной железы, предварительно обработанной для отделения инсулина холодным этанолом. Как видно из рис. 4 она предусматривает постадийную обработку сернокислотного раствора ферментов. Нумерация стадий, показанная на рис. 4 римскими цифрами, соответствует постепенному повышению концентрации сульфата аммония с выделением осадков и супернатантов. Как видно из рис. 4, насыщение сернокислотного раствора ферментов сульфатом аммония до концентрации 30% позволяет отделить балластные белки и получить супернатант-1 - основной исходный материал. Эта операция составляет основу первого этапа разделения ферментов. Далее последовало доведение концентрации сульфата аммония в супернатанте-1 до 45%, т.е. создание условий для осаждения холестеролэстеразы. Выход очищенной холестеролэстеразы составлял 3 грамма из одного килограмма поджелудочной железы крупного рогатого скота. В таблице 3 представлены результаты выделения холестеролэстеразы.
Очистка ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы
Для анализа активности фермента рибонуклеази, был апробирован новый способ получения из пекарских дрожжей суммарной РНК [199]. Ниже приводится последовательность стадий её получения: 1 стадия. Активация пекарских дрожжей. 500 г влажных дрожжей (содержание воды 70%) и 500 г сахарозы суспендировали в 500 мл воды. Суспензию выдерживали при температуре +30С в течение 20 ч. Клеточную массу отделяли центрифугированием (12000 g, в течение 20 мин, при +4С) и промывали трижды дистиллированной водой. Отмытую массу взвешивали (из 500 г дрожжей получалось 400 г активированной биомассы). 2 стадия. Экстракция суммарной РНК. 400 г активированной биомассы дрожжей, полученной на стадии 1, суспендировали в 800 мл дистиллированной воды, содержащей 30 г додецилсульфата натрия (SDS). Суспензию инкубировали в течение 1 ч на водяной бане при температуре +92-94С при непрерывном перемешивании, затем быстро охлаждали до +5С, а осадок удаляли центрифугированием при 12000 g. Супернатант, содержащий суммарную РНК, подвергали очистке. 3 стадия. Очистка суммарной РНК. Все операции, по очистке суммарной РНК, проводили при +4С. К супернатанту, полученному на предыдущей стадии, добавляли NaCI до концентрации 2 М. Раствор выдерживали в течение 1 ч для формирования осадка, который отделяли центрифугированием при 12000 g, в течение 10 мин. Осадок промывали двумя порциями по 400 мл 2 М NaCI, суспендировали в 200 мл 96% этанола и оставляли на ночь в холодильнике при температуре не выше +4С. На следующий день суспензию центрифугировали (13000 g, 10 мин, +4С) и полученный осадок растворяли в 300 мл дистиллированной воды до концентрации РНК 200 ОЕ /мл. Концентрацию- РНК в растворе определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Раствор, содержащий РНК, осветляли центрифугированием при 13000 g, в течение 10 мин, после чего из супернатанта осаждали РНК, добавлением NaCI до концентрации 0,15 Ми равное объему супернатанта количество 96%-ного этанола ( 350 мл). Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием при 13000 g, в течение 10 мин и высушивали в вакуумном эксикаторе над СаСЬ. 4 стадия. Анализ РНК. Содержание высокополимерной фракции в полученной на предыдущей стадии РНК анализировали методом гель-фильтрации на сефарозе 4В. Гель-фильтрацию РНК на сефарозе 4В проводили по методу [200]. Колонку с сефарозой (1,6Х31 см) уравновешивали раствором NaCI (С=9г/л). Раствор РНК объемом 1 мл с концентрацией -10-20 ОЕ2бо/мл (от 0,5 до 1 мг на мл) наносили па колонку и элюировали раствором NaCI (С=9 г/л) со скоростью -30 мл/ч. Оптическую плотность элеата регистрировали на Uvicord SII (шкала 1). Результаты представлены на рисунке 11. Используя данную методика, нами было получено 2,5 грамма суммарной РНК обогащенной высокополимерной фракцией из 500 г дрожжей. 4.1.2. Очистка ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстераз ь/. Стадия 1. Получение грубых экстрактов целевых ферментов. Для получения ферментов предлагаемым методом, поджелудочную железу экстрагировали охлажденным этанолом, следующим образом: 1 кг измельченной до состояния фарша поджелудочной железы крупного рогатого скота экстрагировали 1,2 л охлажденным до -18С этанолом в течение 50 мин при постоянном перемешивании, при этом белки переходили в осадок. Осадок с целевыми ферментами, отделяли от спиртового раствора, содержащего спирторастворимые компоненты (основной компонент инсулин) центрифугированием при 13000 g. в течение 20 мин при +5С. Осадок, полученный после обработки поджелудочной железы этанолом, экстрагировали при перемешивании в течение 60 мин при +5С 2,5 мМ серной кислотой (рН 3), содержащей 5 мМ Mg , в соотношении 1:8, соответственно. Экстракт центрифугировали при 13000 g в течение 20 мин при +5С и в полученном экстракте определяли активность РНК-азы спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм. Для экстракции поджелудочной железы этанолом, нагретым до кипения, использовали метод, описанный в работе [201]: 1 кг измельченной до состояния фарша поджелудочной железы крупного рогатого скота экстрагировали 1,2 л нагретым до кипения этанолом в течение 50 мин при постоянном перемешивании. Остальные операции проводили, как описано выше для экстракции охлаждённым этанолом. Исходя из полученных результатов, мы остановились на более эффективном методе с использованием охлажденного этанола. Как известно, при создании любого технологичного процесса важно время протекания стадий. В рассмотренных нами литературных источниках время стадий экстракции поджелудочной железы этанолом и серной кислотой сильно варьирует [39, 167-170]. Поэтому, для создания экономичного технологического процесса получения вышеперечисленных ферментов, нам было необходимо установить оптимальное время экстракции на обеих стадиях. Определения оптимального времени осаждения белков охлажденным этиловым спиртом проводили следующим образом: 1 кг измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота делили на 8 равных частей. Каждую часть экстрагировали равным объемом охлажденного до -18С этанола при +5С в течение определенных промежутков времени (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 мин.). Осадок, полученный в ходе экстракции этанолом, отделяли центрифугированием при 13000 g. в течение 20 мин при +5С. Каждую пробу осадка экстрагировали при перемешивании при +5С 2,5 мМ серной кислотой (рН 3), содержащей 5 мМ MgS04 (весовые соотношения 1:8). Оптимальное время экстракции 50 мин. Сернокислый экстракт отделяли от нерастворимых примесей центрифугированием при 13000 g. в течение 20 мин при +5С. В экстракте определяли концентрацию белка спектрофотометрическим методом при длинах волн 260 нм и 280 нм. Оптимальное время экстракции спиртового осадка серной кислотой определяли следующим образом: 1 кг влажного осадка, полученного после 50 мин обработки (оптимальное время) охлажденным этанолом, экстрагировали 2,5 мМ серной кислотой (рН 3) (весовые соотношения 1:8), содержащей 5 мМ MgS04 при постоянном перемешивании при +5С в течение 60 мин. Через каждые 10 мин отбирали пробы по 10 мл. Пробы центрифугировали при 13000 g и температуре +5С в течение 20 мин. Полученные после центрифугирования супернатанты анализировали на содержание белка спектрофотометрическим методом при длинах волн 260 нм и 280 нм. Таким образом, из 1 кг спиртового осадка, содержащего целевые ферменты, удалось экстрагировать 130 г белков за 50 мин.
