Введение к работе
Актуальность исследования
Инсульт занимает первое место как причина инвалидизации и второе место в структуре общей смертности населения [Е.И. Гусев, В.И. Скворцова, Л.В. Стаховская, 2007], что указывает на его высокую социально-медицинскую значимость. Благодаря изучению свойств нейрогенных стволовых клеток (НСК) открылись новые перспективы в разработке средств лечения инсульта. В многочисленных доклинических исследованиях продемонстрировано, что имплантация НСК оказывает терапевтическое действие при экспериментальном инсульте. Среди гипотез, объясняющих этот феномен, наибольшее внимание уделяется рассмотрению роли НСК в качестве продуцентов и индукторов выделения факторов роста в окружающих тканях. Экспрессия СК терапевтических количеств факторов роста (в частности, мозгового нейротрофического фактора, BDNF) продемонстрирована in vitro [Garca R et al., 2004; Harms K.M.et al., 2010]. Вместе с тем нет исчерпывающих доказательств, подтверждающих подобные свойства НСК in vivo. Исходя из этого, особую актуальность имеет вопрос, в какой мере имплантация НСК может изменить уровень экспрессии BDNF в мозге и отразится ли это на течении нейродегенеративного процесса и функциональном состоянии ЦНС крыс после моделирования ишемических инсультов?
Цель работы
Исследовать влияние имплантации нейрогенных стволовых (прогениторных) клеток на функциональное состояние ЦНС, биохимические показатели дегенеративных и репаративных процессов в ЦНС (нейроспецифические белки и факторы роста) после моделирования у крыс распространенного корково-подкоркового и локального коркового ишемических инсультов.
Задачи исследования:
-
Осуществить иммуногистохимическую верификацию клеточных препаратов эмбриональной нервной ткани крысы (ЭНТкр), нейрогенных стволовых клеток из обонятельной выстилки человека (НСКовч) и фибробластов крысы (Фкр) и исследовать жизнеспособность имплантированных клеток.
-
Воспроизвести модель распространённого корово-подкоркового ишемического инсульта путём односторонней окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) у крыс и осуществить мониторинг состояния двигательных и когнитивных функций после трансфузии им клеток ЭНТкр и Фкр (клеточный контроль) в большую цистерну мозга.
-
Определить уровни экспрессии факторов роста (мРНК NGF, BDNF, NT-3) в клеточных препаратах (ЭНТкр, Фкр, НСКовч), использованных в работе для экспериментальной клеточной терапии ишемического инсульта.
-
Определить концентрации нейроспецифических белков (NSE, GFAP) и NGF в цереброспинальной жидкости и сыворотке крови у крыс с ОСМА после трансфузии им клеток ЭНТкр и Фкр (клеточный контроль) в большую цистерну мозга.
-
Воспроизвести у крыс односторонний локальный ишемический инсульт в сенсомоторной зоне коры головного мозга по методу [Kolb et al., 2007] в доминантном и недоминантном полушариях головного мозга (по показателю преимущественного использования лапы при захвате пищи) и осуществить в течение двух месяцев еженедельный мониторинг функций контралатеральной передней лапы.
-
У крыс с ишемическим инсультом в сенсомоторной зоне коры мозга исследовать влияние имплантации НСК (ЭНТкр и НСКовч) и Фкр (клеточный контроль) в периинфарктную корковую зону на восстановление функций ЦНС и экспрессию BDNF в зонах имплантации клеточных препаратов.
Научная новизна
Впервые показано, что имплантации крысам в большую цистерну головного мозга или в периинфарктную область препаратов клеток без стволовых (прогенитоных) свойств в качестве клеточного контроля (Фкр) в остром периоде моделирования обширного фокального и коркового локального ишемических инсультов не оказывает положительного терапевтического эффекта по показателям состояния интегральных функций ЦНС и экспрессии BDNF.
Впервые установлен терапевтический эффект имплантации клеточного препарата ЭНТкр в остром периоде моделирования обширного фокального и коркового локального ишемических инсультов. Показана специфичность действия клеток ЭНТкр в сравнении с «клеточным контролем» (Фкр).
Впервые применен метод анализа уровней нейроспецифических белков (НСБ) в ликворе и крови для прижизненной верификации нейропротективного эффекта клеточной терапии ишемического инсульта у крыс.
Впервые установлено, что восстановление функций контралатеральной передней лапы крыс после моделирования одностороннего инсульта в зоне ее представительства в коре головного мозга крыс по методу Колб и соавт. [Kolb et al., 2007] происходит существенно лучше при моделировании упомянутого инсульта в «доминантном» (тест захвата пищи) полушарии головного мозга, чем при операциях на «субдоминантном» полушарии.
Теоретическая значимость работы:
-
Обобщен обширный литературный материал в сфере изучения роли стволовых клеток при ишемическом инсульте и выделены основные нерешенные проблемы изучения механизмов лечебного действия НСК и перспективы экспериментального исследования эффективности клеточной терапии
-
Экспериментальные данные о влиянии имплантации ЭНТкр на интегральные и «парциальные» функции ЦНС на моделях обширного и локального ишемического инсульта в сочетании с результатами биохимических исследований свидетельствуют о системных и паракринных механизмах терапевтического эффекта НСК.
-
В исследовании продемонстрировано значение функциональной асимметрии полушарий мозга крыс в восстановлении после инсульта в сенсомоторной коре в доминантном и субдоминантном полушариях головного мозга.
Научно-практическое значение работы:
-
Предложен методологический подход с использованием клеточного контроля и оценки функциональной асимметрии головного мозга, позволяющий повысить достоверность доклинических исследований стволовых клеток на моделях ишемического инсульта.
-
Экспериментально апробирован способ диагностики повреждения клеток нервной ткани с помощью анализа НСБ в крови и ликворе для прижизненной верификации нейропротективного эффекта клеточной терапии инсульта у крыс.
-
Полученные в работе данные могут использоваться для планирования дизайна доклинических исследований в сфере клеточной терапии инсульта.
Основные положения, выносимые на защиту
-
В механизмах нейрорепаративного действия СК у крыс с ишемическим инсультом присутствуют системные и паракринные эффекты, поскольку:
- трансфузия в большую цистерну головного мозга клеток ЭНТкр в острой стадии ишемическом инсульта после ОСМА у крыс приводит к существенному восстановлению нарушенных двигательных и когнитивных функций ЦНС, а также снижению концентраций в ликворе и сыворотке крови маркёров нейродегенеративного процесса - NSE и GFAP.
- имплантация ЭНТкр в периинфарктную зону крысам с экспериментальным ишемическим фокальным инсультом в сенсомоторной коре мозга оказывает стойкий положительный эффект на восстановление нарушенных функций контралатеральной передней лапы, что сопровождается 4-х кратным повышением экспрессии мРНК BDNF в местах имплантации клеток ЭНТкр в сравнении с местами имплантации Фкр (клеточный контроль) и более чем 20-кратным повышением – по сравнению с периинфарктной областью без имплантации клеток.
-
Имеются существенные различия влияния имплантации аллогенных (ЭНТкр) и ксеногенных (НСКовч) на восстановление функций ЦНС после ишемического повреждения мозга и активацию экспрессии BDNF в местах их имплантации в мозг.
-
При доклинических исследованиях клеточных препаратов (новых средств лечения) с использованием моделей одностороннего инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга у крыс объективные данные об эффективности испытуемых средств могут быть получены при условии учёта доминантности полушария головного мозга, определяемой с помощью теста захвата пищи передней лапой.
-
В дизайн экспериментальных исследований in vivo по изучению биохимических механизмов биологического действия препаратов стволовых (прогениторных) клеток и их эффективности на организменном уровне должны быть включены исследования с использованием препаратов клеток без стволовых (прогениторных) свойств (клеточный контроль).
Апробация работы проведена на совместном заседании Проблемного учёного совета по Фундаментальной и прикладной нейробиологии, с участием сотрудников отдела Фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП» Минздравсоцразвития, кафедры Неврологии и нейрохирургии с курсом ФУВ, кафедры Нано- и биомедицинских технологий и кафедры Патологической физиологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Основные положения работы представлены в периодической научной печати и докладах на научных конференциях: Всероссийские научные школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2009, 2010); 14 Международный конгресс по психофизиологии “The Olympics of the brain”(Санкт-Петербург, 2008); Всероссийская школа-конференция «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); 8 Международный конгресс Европейской Коллегии по нейропсихофармакологии - 8th ECNP Regional Meeting (Москва, 2005).
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 6 статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация написана на русском языке, изложена на 134 страницах и состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения) выводов, практических рекомендаций и списка публикаций по теме диссертации.
Диссертация содержит 22 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает 32 источника отечественной и 205 – зарубежной литературы.
