Введение к работе
Актуальность проблемы. Тритерпеновые гликозиды голотурий изучаются на протяжении длительного времени. Установлено, что они обладают широким спектром биологической активности. Для этих соединений отмечены такие свойства, как антимикробная, хемопревентивная, иммуномодулирующая, иммуноадьювантная и противовоспалительная, активности. Кроме того, тритерпеновые гликозиды обладают выраженной мембранолитической активностью, проявляющейся в микромолярном диапазоне концентраций. Механизм мембранолитического действия этих соединений хорошо изучен и заключается в способности гликозидов изменять ионную проницаемость мембран клеток посредством взаимодействия со стеринами мембран (главным образом с холестерином) и формирования ионопроводящих структур в липидном матриксе.
В то же время известно, что в низких нецитотоксических концентрациях, некоторые из этих соединений активируют целый ряд внутриклеточных процессов. Ранее было показано, что тритерпеновый гликозид кукумариозид Аг-2, выделенный из дальневосточной голотурии Cucumaria japonica, в наномолярных концентрациях обладает иммуностимулирующим действием, которое выражаются, главным образом, в активации клеточного звена иммунитета: усиливается адгезия, распластывание и подвижность макрофагов, усиливается фагоцитоз и формирование активных форм кислорода, увеличивается скорость пролиферации лимфоцитов, количество антител-образующих клеток селезенки, индуцируется синтез некоторых цитокинов. Введение препарата кумазид экспериментальным животным приводит к существенному увеличению их резистентности к различным патогенным инфекциям, к торможению роста некоторых видов опухолей и увеличению средней продолжительности жизни животных при облучении сублетальными дозами радиации. Результатом успешной работы ТИБОХ ДВО РАН в этом направлении является созданный на основе моносульфатированных тритерпеновых гликозидов голотурии Cucumaria japonica (главным образом, кукумариозида Аг-2) эффективный иммуностимулирующий препарат кумазид, предназначенный для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний человека и прошедший все официальные доклинические испытания.
Однако, несмотря на большое количество работ, связанных с изучением физиологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий, механизм их иммуномодулирующего действия на клеточном и субклеточном уровне изучен недостаточно. Имеющиеся в литературе данные об иммуномодулирующей активности тритерпеновых гликозидов голотурий не дают четкого представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе проявления стимулирующего эффекта. Практически полностью отсутствуют сведения о мембранных и внутриклеточных мишенях действия гликозидов, сигнальных путях и фармакокинетике этих соединений в органах-мишенях.
Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия и изучение фармакокинетического поведения тритерпенового гликозида кукумариозида Аг-2, выделенного из голотурии Cucumaria japonica.
В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:
-
провести сравнительное изучение и установление концентрационных диапазонов цитотоксической и лизосомальной активности кукумариозида Аг-2 in vitro;
-
изучить взаимодействие кукумариозида Аг-2 с мембранами иммунекомпетентных клеток, включая исследование изменения микровязкости и мембранного потенциала под действием гликозида, а также определение мест связывания кукумариозида Аг-2 с биомембранами;
-
исследовать влияние кукумариозида Аг-2 на транспорт ионов кальция в иммунокомпетентных клетках и фармакологически определить природу рецепторов, ионных каналов и переносчиков, принимающих участие в Са ответе клеток на действие гликозида;
-
провести иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов, принимающих участие во взаимодействии с кукумариозидом Аг-2;
-
провести исследование фармакокинетического поведения кукумариозида Аг-2 в органе-мишени (селезенке мыши).
-4-Основные положения, выносимые на защиту.
-
Кукумариозид Аг-2 в наномолярных концентрациях связывается с мембранами иммунокомпетентных клеток мыши и вызывает временное обратимое изменение микровязкости мембран и мембранного потенциала, сопровождающееся резким обратимым входом Са в цитоплазму клеток из внеклеточной среды.
-
На мембранах макрофагов существует два сайта связывания кукумариозида Аг-2 (высокоаффинный и низкоаффинный), характеризующихся различными константами диссоциации.
-
Пуринергические рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типа), обеспечивающие Са2+ проводимость в мембранах макрофагов и активацию иммунных клеток, являются молекулярными мишенями действия кукумариозида Аг-2, который выступает в качестве аллостерического модулятора этих рецепторов.
-
При внутрибрюшинном способе введения мышам кукумариозид Аг-2 быстро достигает максимальной концентрации в органе-мишени (селезенке) и относительно быстро выводится, практически не претерпевая метаболические превращения. Гликозид локализуется, главным образом, в области серозной оболочки селезенки и, в меньшей степени, в центральной части органа.
Научная новизна. В ходе данной работы было впервые изучено взаимодействие тритерпенового гликозида кукумариозида Аг-2 с иммунекомпетентными клетками мыши. Показано, что в основе иммуномодулирующего действия исследуемого природного соединения лежит его способность взаимодействовать, прежде всего, с клеточными мембранами и изменять их физико-химические свойства. Впервые показано, что кукумариозид Аг-2 обратимо увеличивает микровязкость биомембран. Такое взаимодействие приводит к обратимому изменению мембранного потенциала, деполяризации биомембран и резкому обратимому увеличению концентрации ионов Са в цитоплазме за счет его поступления из внеклеточного пространства. Впервые показано, что на мембранах макрофагов мыши существуют как минимум два сайта связывания кукумариозида Аг-2 (высокоаффинный и низкоаффинный), характеризующихся различными константами диссоциации. Впервые установлено, что одними из молекулярных мишеней действия кукумариозида Аг-2 являются мембранные пуринергические рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типа), обеспечивающие Са проводимость в мембранах макрофагов и активацию клеток. Показано, что кукумариозид Аг-2 действует в качестве аллостерического модулятора пуриновых рецепторов. Связываясь с ними, гликозид усиливает ответ клеток на АТФ и частично снимает эффект десенсибилизации рецепторов. Установлено, что в перитонеальной полости мыши присутствует популяция крупных зрелых F4/80+ макрофагов, характеризующихся наличием высокой плотности пуриновых рецепторов Р2Х1 и Р2Х4 типа. Очевидно, именно крупные F4/80+ / Р2Х+ перитонеальные макрофаги принимают участие в Са ответе на аппликацию кукумариозида Аг-2. Методами радиоспектроскопии, MALDI-TOF MS и MALDI-IMS впервые изучены и определены фармакокинетические параметры поведения кукумариозида Аг-2 в селезенке мыши при внутрибрюшинном введении препарата. Обнаружено, что кукумариозид Аг-2 локализуется, главным образом, в области серозной оболочки селезенки и, в меньшей степени, в центральной части органа, где располагается красная и белая пульпа.
Практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия тритерпенового гликозида кукумариозида Аг-2 и углубляют существующие представления о влиянии низкомолекулярных биорегуляторов на клетки иммунной системы. Фундаментальные знания, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, дают фармакодинамическую и фармакокинетическую характеристику кумазида и создают методологическую основу для изучения механизма действия новых лекарственных средств, созданных на основе тритерпеновых гликозидов голотурий.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука - медицине» (Владивосток, 2011), 9 1ST Asia pacific meeting on animal, plant and microbial toxins (Владивосток, 2011), XIII и XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ, 2011, 2012), II Международной конференции "Перспективные направления биомедицинских технологий" (г. Владивосток, 2012), Symposium on marine enzymes and
polysaccarides (Нячанг, Вьетнам, 2012), 2nd Bi-Annual International Practical Cytometry Workshop (Москва, 2011), II Международной конференции "Перспективные направления биомедицинских технологий" (г. Владивосток, 2012), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 2013), 2nd International workshop on marine bioresources of Vietnam (Ханой, Вьетнам, 2013), 38th FEBS Congress "Mechanisms in Biology" (Санкт-Петербург, 2013).
Личный вклад автора. Автором самостоятельно были проведены исследования цитотоксической и иммуномодулирующей активности кукумариозида Аг-2, изучено влияние гликозида на микровязкость биомембран, мембранный потенциал клеток, определены места связывания Н-кукумариозида Аг-2 с биомембранами, с помощью техники флуоресцентных зондов исследовано влияние гликозида на транспорт ионов кальция в иммунокомпетентных клетках и проведено фармакологическое определение природы рецепторов, ионных каналов и переносчиков, принимающих участие в Са ответе клеток на действие гликозида, проведено иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов для определения субпопуляций клеток, принимающих участие в иммунном ответе, осуществлены необходимые расчеты и статистическая обработка данных. Исследование фармакокинетики кукумариозида Аг-2 и его пространственного распределения в селезенке мыши методом MALDI-TOF MS и MALDI-IMS выполнено совместно с к.х.н., зав.лаб. Дмитренком П.С. (лаб. инструментальных и радиоизотопных ТИБОХ ДВО РАН). Электрофизиологические исследования проводили на базе лаборатории клеточной нейробиологии Института биофизики клетки РАН (г. Пущино) совместно с с.н.с, к.б.н. Асташевым М.Е. Компьютерное моделирование осуществлено к.ф.-м.н., с.н.с, Зелепуга Е. А. (лаб. химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН).
Работа выполнена в Лаборатории биоиспытаний и механизма действия биологически активных веществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН при финансовой поддержке ФЦПК Минобрнауки России (№ 14.132.21.1327), грантов РФФИ (№ 12-04-32232 и № 11-04-01084), гранта Дальневосточного отделения РАН № 12-Ш-В-05-022, гранта Дальневосточного и Уральского отделений РАН (№ 09-П-УО-05-002), программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ НШ-546.1012.4.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и 13 тезисов докладов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 262 публикаций. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 5 таблиц и 39 рисунков.
Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю, кандидату биологических наук Дмитрию Львовичу Аминину. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН: кандидату химических наук Александре Сергеевне Сильченко и доктору химических наук Сергею Анатольевичу Авилову за любезное предоставление кукумариозида Аг-2, кандидату химических наук Виктории Николаевне Давыдовой за помощь при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии, кандидату химических наук Павлу Сергеевичу Дмитренку за неоценимую помощь в организации и проведении исследований методом MALDI-TOF MS и MALDI-IMS, научному сотруднику Наталье Юрьевне Ким за помощь при проведении исследований методом флуоресцентной спектроскопии, кандидату физико-математических наук Елене Александровне Зелепуга за осуществление компьютерного моделирования, кандидату биологических наук Екатерине Александровне Юрченко и кандидату биологических наук Татьяне Юрьевне Горпенченко (лаборатория биотехнологии БПИ ДВО РАН) за помощь при проведении иммуноцитохимических исследований и конфокальной микроскопии, кандидату биологических наук Максиму Евгеньевичу Асташеву (лаборатории клеточной нейробиологии, Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино) за помощь в электрофизиологических исследованиях и всем сотрудникам лаборатории биоиспытаний и механизма действия БАВ ТИБОХ ДВО РАН.
