Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 11
1.1. Тритерпеновые гликозиды 11
1.1.1. Химическое строение тритерпеновых гликозидов голотурий 11
1.1.2. Распространение тритерпеновых гликозидов в природе 12
1.1.3. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий 12
1.1.3.1. Цитотоксические свойства и противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов 16
1.1.3.2. Влияние на множественную лекарственную устойчивость 24
1.1.3.3. Взаимодействие тритерпеновых гликозидов с биомембранами 26
2. Материалы и методы 32
2.1. Исследуемые соединения 32
2.2. Лабораторные животные 32
2.3. Получение клеток 33
2.3.1. Получение клеток асцитной карциномы Эрлиха 33
2.3.2. Культивирование опухолевых клеток человека 33
2.4. Определение жизнеспособности клеток 33
2.4.1. Определение цитотоксической активности (окрашивание трипановым синим) 33
2.4.2. Измерение активности неспецифической эстеразы 34
2.4.3. Определение цитотоксической активности (МТТ тест) 34
2.5. Определение индукции апоптоза 35
2.5.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина 35
2.5.2. Исследование индукции апоптоза в клетках асцитной карциномы Эрлиха с помощью
флуоресцентных зондов PI и Hoechst 33342 35
2.5.3 Определение каспазы-3 и -9, PARP-1 36
2.5.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии 38
2.5.5. Исследование влияния на активность белка р53 38
2.6. Исследование клеточного цикла 39
2.6.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии 39
2.6.2. Определение включения Н-тимидина в ДНК опухолевых клеток 41
2.7. Исследование колониеобразования опухолевых клеток 41
2.8. Определение множественной устойчивости з
2.8.1. Исследование блокирования множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM 42
2.8.2. Изучение динамики накопления доксорубицина в клетках асцитной карциномы Эрлиха 42
2.8.3. Исследование выброса доксорубицина из опухолевых клеток 42
2.9. Протеомный анализ РСЗ клеток (2D-PAGE) 43
2.10. Верификация белков (2Б-вестерн-блоттинг) 44
2.11. Функциональный анализ белков методами биоинформатики 45
2.12. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида Аг-2
в экспериментах in vivo 45
2.13. Влияние кукумариозида Аг-2 на противоопухолевую активность доксорубицина в экспериментах in vivo 46
2.14. Статистический анализ 47
3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Цитотоксическая активность тритерпеновых гликозидов 48
3.1.1. Определение жизнеспособности с помощью красителя трипановый синий 48
3.1.2. Определение активности неспецифической эстеразы 49
3.1.3. Определение жизнеспособности опухолевых клеток с помощью метода МТТ 50
3.2. Изучение индукции апоптоза 52
3.2.1. Изучение инверсии фосфатидилсерина 52
3.2.2. Исследование конденсации хроматина 55
3.2.3. Исследование активности казпазы-3, -9 HPARP-І 57
3.2.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии 61
3.2.5. Влияние на активность белка р53 63
3.3. Исследование клеточного цикла 64
3.3.1. Определение фаз клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии 64
3.3.2. Определение включения Н-тимидина в ДНК клеток 69
3.4 Влияние тритерпеновых гликозидов на колониеобразование опухолевых клеток 70
3.5. Исследование влияния кукумариозида Аг-2 и фрондозида А на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток 73
3.5.1. Изучение множественной лекарственной устойчивости с помощью флуоресцентного зонда Calcein AM 73
3.5.2. Изучение транспорта доксорубицина в опухолевых клетках 75
3.6. Исследование влияния тритерпеновых гликозидов на протеом опухолевых клеток человека 77
3.6.1. Протеомный анализ белков с помощью 2D-PAGE и MALDI-MS 77
3.6.2. Биоинформационный анализ 96
3.6.3. Верификация экспрессии белков методом вестерн-блоттинг и 2В-вестерн блоттинг 98
3.7. Исследование противоопухолевой активности кукумариозида Аг-2 in vivo 102
3.8. Влияние кукумариозида Аг-2 на противоопухолевую активность доксорубицина in vivo 104
Заключение 107
Выводы по
Список используемых сокращений 112
Список литературы
- Распространение тритерпеновых гликозидов в природе
- Взаимодействие тритерпеновых гликозидов с биомембранами
- Измерение активности неспецифической эстеразы
- Исследование влияния кукумариозида Аг-2 и фрондозида А на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток
Распространение тритерпеновых гликозидов в природе
Тритерпреновые гликозиды широко представлены во многих высших растениях и морских беспозвоночных. Они обладают различными видами биологической активности в отношении животных и человека, а также характеризуются большим разнообразием структур (Mahato et al., 1988). Тритерпеновые гликозиды являются действующим началом, определяющим, физиологические эффекты экстрактов из многих лекарственных растений. Более чем у 500 семейств растений описано содержание этих соединений. К наиболее важным семействам, содержащим тритерпеновые гликозиды, относятся лилейные, гвоздичные, лютиковые, бобовые, аралиевые, сложноцветные и некоторые другие (Деканосидзе и др., 1984).
Кроме источников растительного происхождения, тритерпеновые гликозиды распространены в иглокожих Мирового океана. Тритерпеновые гликозиды были относительно недавно обнаружены в губках (Стоник, 2001). Изучение морских объектов привело к созданию обширной коллекции тритерпеновых гликозидов из голотурий и к установлению их биологической активности.
Ихтиотоксические свойства и токсичность. На начальных этапах исследования биологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий была изучена их общая токсичность, ихтиотоксичность и гемолитическая активность. В 50-60-х гг. XX в. Т. Яманоучи и Р. Нигрелли показали наличие ихтиотоксических веществ в 30 видах голотурий. Гистологический анализ показал, что причиной гибели рыб является повреждение жаберных капилляров гликозидами (Nigrelli, 1952, Yamanouchi, 1955).
Позже было показано, что тритерпеновые гликозиды способны ингибировать рост патогенной грибковой микрофлоры, блокировать деление и последующее развитие эмбрионов морского ежа и подавлять пролиферацию разных типов опухолевых клеток (Kalinin et al., 2008).
Было установлено, что одним из проявлений токсического действия тритерпеновых гликозидов голотурий является их влияние на ранний эмбриогенез морских ежей (Ruggieri, Nigrelli, 1960). Так, было показано, что голотурии и голотурии А из Actinopyga agassizi вызывают остановку дробления или лизис бластомеров эмбрионов морского ежа Arbacia punctilata. Позднее сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН было установлено, что голотоксин Ai из Apostichopus japonicus, кукумариозид С и кукумариозид Gi из Eupentacta fraudatrix, а также гликозиды из Holothuria mexicana оказывают аналогичное действие на оплодотворенные клетки морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Был сделан вывод, что цитотоксическое действие тритерпеновых гликозидов голотурий в отношении эмбрионов морского ежа связано с ингибированием синтеза ДНК, РНК и белков, обусловленным уменьшением в клетках концентрации предшественников этих биополимеров из-за нарушения мембранного транспорта (Anisimov et al., 1979).
Яманоучи определил летальные дозы голотурина из Holothuria leucospilota (=Н. vagabunda) для земляных червей, лягушек и мышей. Так LD50 для мышей равнялась 0,75, 70 и 400 мг/кг при внутривенном, подкожном и пероральном введении соответственно (Yamanouchi, 1955). LD50 фракции кукумариозидов из голотурии Cucumaria japonica для мышей составила 200 мкг/мышь (или 10 мг/кг) при перитонеальном способе введения (Поликарпова и др., 1990). Острая токсичность фрондозида А из голотурии Cucumaria frondosa, определенная методом Кербера, составляла 9,9 мг/кг (LD50) при однократном внутрибрюшинном введении (Aminin et al., 2008).
Гемолитическая активность. Было обнаружено, что многие тритерпеновые гликозиды голотурий, принадлежащих к разным родам и семействам, обладают выраженной гемолитической активностью и эффективно разрушают эритроциты теплокровных животных (Nigrelli, Jakowska, 1960; Yamanouchi, 1955). Было показано, что гемолитический индекс для «голотурина» превышал в 6-7 раз таковой сапонинов (смесь растительных тритерпеновых гликозидов), а холестерин, добавленный в инкубационную среду, значительно понижал гемолитическое действие «голотурина» (Thron, 1964). В ходе изучения гемолитической активности серии тритерпеновых гликозидов и их производных из голотурий отряда Dendrochirotida сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН было установлено, что данный вид активности зависит от структуры, как агликона, так и углеводной цепи. Наибольшие значения были у гликозидов, имеющих линейный тетрасахаридный фрагмент в углеводных цепях и 18 (20)-лактон в агликонной части (Kalinin et al., 1992).
Противогрибковое и антимикробное действие. Отмечено, что тритерпеновые гликозиды голотурий обладают антифунгальным действием. Так, голотоксин, выделенный из Apostichopus japonicus проявлял активность в отношении грибов в концентрации 2,78-16,7 мкг/мл, но был не токсичен для большинства бактерий. Антифунгальные свойства гликозидов голотурий связывают с их взаимодействием со стеринами клеточных мембран грибов (Анисимов и др., 1972). Было показано, что голотоксин Ai оказывает ингибирующее действие на биосинтез РНК в Candida albicans и Saccharomyces carlbergensis, что было зарегистрировано по уменьшению С-уридина в кислотонерастворимой фракции клеток (Баранова и др., 1973). Было установлено, что способность подавлять рост грибков в культуре характерна для гликозидов, выделенных из голотурий родов Bohadshia, Holothuria, Actinopyga, Stichopus, Thelenota и Eupentacta (=Cucumaria) (Анисимов и др., 1972; 1973; Анисимов, Чирва, 1980; Щеглов и др., 1979; Shimada, 1969; Kuznetsovaet al., 1982).
Антипротозойная активность. Было показано, что «голотурии» достаточно эффективно подавляет in vitro жизнедеятельность простейших Amoeba proteus (Nigrelli, Jakowska, 1960), a голотоксины из голотурии Apostichopus japonicus активны против Trichomonas vaginalis (Kitagawa et al., 1976). Антипротозойная активность совпадает с противогрибковой активностью гликозидов (Miyamoto et al., 1990). Показано, что крысы, предварительно инъецированные культурой Tripanosoma lewisi, были менее заражены патогенами после предварительного или одновременного введения голотурина, чем контрольные животные (Styles, 1970). В то же время, если гликозид вводили после инокуляции культуры Trypanosoma duttony, то у инъецированных гликозидом животных наблюдался более высокий уровень заражения (Sen, Lin, 1975; 1977).
Контрацептивный эффект. Было установлено, что подкожная инъекция крысам смеси гликозидов голотурии Apostichopus japonicus в дозах 0,1 и 1 мг/кг вызывала выраженный контрацептивный эффект на 50 и 28% соответственно (Мац и др., 1990).
Митогенная активность. Было показано, что «голотурии» из голотурии A. agasssizi стимулировал гемопоэз в костном мозге лягушек (Nigrelli, Jakowska, 1960). Установлено, что минимальная иммуномодулирующая доза 0,05 мкг/кг суммы кукумариозидов из голотурии Cucumaria japonica вызывала задержку митоза клеток печени крыс в период с 28 по 32 ч после гепатоэктомии, но после 40 ч наблюдалось компенсаторное увеличение митотической активности клеток, что может отражать регулирование процесса пролиферации клеток гликозидами (Турищев и др., 1991). Установлено, что голотурины А, В и Аг из голотурий семейства Holothuriidae и голотоксин Ai из голотурии Apostichopus japonicus в диапазоне концентраций 0,01-0,1 мкг/мл стимулировали включение Hhd в Т- и В-лимфоциты селезенки или усиливали бласт-трансформацию спленоцитов, вызываемую СопА или фитогемагглютинином (Попов и др., 1994). В то же время препарат кумазид в нанограммовых концентрациях не вызывал существенного увеличения пролиферативной активности лимфоцитов крови человека в сравнении с фитогемагглютинином, но усиливал ее в 1,2-2 раза при концентрации 0,1 и 1 мкг/мл (Aminin et al., 2006; Стоник и др., 2004).
Радиозащитное действие. Было изучено радиозащитное действие кукумариозида Аг-2 из голотурии С. japonica и препарата «трепангин» из гликозидов Apostichopus japonicus. Установлено, что наиболее эффективный гликозид, кукумариозид Аг-2, в дозе 1 мкг/кг і -in увеличивал выживаемость мышей на 40% после их радиационного облучения цезием Cs (у-радиация, доза облучения 7,7 Гр, 5-10 мин) и усиливал гемопоэз в красном косном мозге у облученных животных (Поверенный, 1990). Показано, что препарат кумазид, введенный мышам линии CD-I, облученным с использованием гамма-терапевтического аппарата с источником излучения Со (доза облучения составляла 6,5 Гр, мощность дозы 1,14 Гр/мин), обладает умеренными радиозащитными свойствами. Радиопротекторный эффект сопровождался увеличением процента выживаемости и средней продолжительности жизни (СПЖ) радиоактивно облученных животных, увеличением скорости восстановления показателей клеточного состава периферической крови, функции кроветворения, клеточности кроветворных (костный мозг бедренной кости), лимфоидных (тимус, селезенка) органов и количества полипотентных стволовых кроветворных клеток. Наибольшую эффективность препарат проявлял в дозе 1 мкг/кг при профилактическом подкожном введении за 4 дня до облучения животных (Aminin et al., 2011).
Взаимодействие тритерпеновых гликозидов с биомембранами
Для измерения концентрации каспазы-3 в цитоплазме клеток использовали стандартные тест-наборы (EnzChek. Caspase-3 Assay Kit #1, Molecular Probes, США). Процедура измерения проводилась согласно протоколу производителя. Суспензию клеток асцитной карциномы Эрлиха (1x10 клеток/мл) инкубировали в 24-луночных планшетах в среде RPMI 1640, содержащей раствор L-глютамина (2 мМ), гентамицина (50 мкг/мл), и раствор кукумариозида Аг-2 или фрондозида А в концентрациях 0,001-1 мкМ. Клетки инкубировали в СОг-инкубаторе при 37иС на протяжении определенного времени. Затем опухолевые клетки собирали и отмывали методом центрфугирования (1500 об./мин при 4 С, 5 минут) в ФСБР. Для разрушения клеточных мембран готовили лизирующий буферный раствор: добавляли 50 мкл 20х Cell Lysis Buffer (компонент С из набора) к 950 мкл диет. НгО. Затем ресуспендировали каждый клеточный образец и контроли в 50 мкл лизирующего буферного раствора. Для оптимального лизиса клетки инкубировали на льду 30 минут. Лизированные клетки центрифугировали при 5000 об/мин 5 минут для удаления гранул и клеточного дебриса, и 50 мкл супернатанта переносили от каждого образца в лунки 96-луночной планшеты черного цвета (Microtiter) для измерения флуоресценции. В каждую лунку к образцам добавляли по 50 мкл раствора, содержащего заранее приготовленный реакционный буферный раствор и 10 мМ субстрата Z-DEVD-AMC (из набора). Планшеты инкубировали 30-60 минут при комнатной температуре в темноте, а затем проводили измерение флюоресценции образцов при параметрах Хех =355 нм и Xsx = 460нм с использованием флуоресцентного фотометра планшетного формата Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems, Финляндия).
Для определения белков каспазы-3, -9, и PARP-1 методом вестерн-блоттинга клетки различных линий были посеяны на чашках Петри в количестве 1x10 в 5 мл полной ростовой среды и поставлены в СОг инкубатор на 24 ч для адгезии. После чего среда была заменена на свежую с добавлением веществ в исследуемых концентрациях. Через 24 ч или 48 ч клетки обрабатывали раствором Трипсин-ЭДТА (Gibco by Life technologies, США) и отмывались ФСБР три раза. Далее клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл лизирующего буферного раствора (0,88% NaCl, 50 мМ Tris-HCl (рН 7.6), 1% NP-40, 0,25 % NaC102, 1 мМ PFMS, 1 мМ NasVO/i) и инкубировали 40 мин на льду, после чего оставляли на ночь при -20 С. Лизированные клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин, 14000 об/мин и 4иС. Концентрация белков была измерена по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Образцы с белками были нагреты до 99иС в течение 5 мин. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лаэммли (Laemmli, 1970) в 10%-ном ПААГ при напряжении 80 В первые 30 мин и при 120 В оставшееся время.
После электрофоретического разделения белки были перенесены из геля на PVDF мембрану (0,45 urn, Millipore Corporation, США) при 25 В в течение 1 ч с помощью аппарата Trans-blot SD Semi-dry transfer cell (Bio-rad, США). Перед инкубированием с первичными антителами в течение ночи при 4 С мембрана была заблокирована при помощи 5%-ного раствора БСА в 0,05%-ном растворе TBSween 20 в течение 1 ч. Затем мембрану отмывали от первичных антител раствором TBSween 20 три раза по 5 мин и инкубировали в течение 1 ч со вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена при комнатной температуре. После чего к мембранам добавляли по 1 мл растворов Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo scientific, США), прикладывали рентгеновскую пленку CL-XPosureTM Film 5x7 inches (Thermo scientific, США), и сигнал был визуализирован на рентгеновской пленке после ее проявления при помощи проявочной машины (AGFA СР 1000, Германия).
Зоны интересующих белков определяли с использованием первичных поликлональных и моноклональных антител: поликлональные кроличьи антитела против PARP-1, титр 1:1000 (Cell signaling, США); моноклональные кроличьи антитела против каспазы-3, титр 1:1000 (Cell signaling, США); моноклональные мышиные антитела против каспазы-9, титр 1:1000 (Cell signaling, США); поликлональные кроличьи антитела против ГАФД (Abeam, США). Использовали вторичные козьи антитела, меченные пероксидазой хрена, против кролика, титр 1:5000 (Abeam, США) и вторичные кроличьи антитела против мыши, титр 1:10000 (Abeam, США). 2.5.4. Исследование клеточной деструкции методом фазово-контрастной и электронной микроскопии
В экспериментах использовали клетки мышиной асцитной карциномы Эрлиха в конечной концентрации 2-5x10 клеток/мл. 1 мл клеточной суспензии добавляли в лунки 24-луночной пластиковой культуральной планшеты, содержащие 0,1 мл водного раствора тестируемого вещества. Планшеты встряхивали и инкубировали в СОг-инкубаторе при 37 С в течение 24 ч. Для индукции клеточной деструкции клетки инкубировали в культуральной среде DMEM, содержащей L-глютамин (2 мМ), FBS (эмбриональная телячья сыворотка, 10%), гентамицин (100 мкг/мл) и кукумариозид Аг-2 (0,1 мкМ). Через 24 ч суспензию клеток отбирали, переносили в пробирки типа эппендорф и осаждали центрифугированием при 1500 об/мин (400 g) в течение 5 мин.
Для микроскопического анализа клетки фиксировали в 2,5%-ом глютаральдегиде на 0,1 М какодилатном буфере. После фиксации клетки были помещены в ІхФСБР. Для изучения клеточной суспензии методом фазово-контрастной микроскопии использовался микроскоп Axiovert 200М Apotome (Zeiss, Германия). Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии суспензию клеток помещали на поверхность покровных стекол
Thermanox Plastic Coverslips (США), выдерживали до их оседания 30 мин и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне. После этого образцы окончательно высушивали в диоксиде углерода, используя прибор фирмы BALEC (critical point dryer 030, Германия), помещали на поверхность алюминиевых столиков и напыляли углеродом. Анализировали образцы на сканирующем электронном микроскопе EVO 40 (Zeiss, Германия). Для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии клеточная суспензия была дофиксирована в 2%-ом растворе Os04 на 0,1 М какодилатном буфере. После обезвоживания в спиртах и ацетоне материал заключали в Аралдит. Ультратонкие срезы толщиной 80 нм были получены с использованием ультрамикротома Ultracut UC6 (Leica, Германия) и помещены на медные бленды, покрытые формваровой подложкой. Срезы окрашивали растворами уранилацетата и цитрата свинца и изучали в электронном микроскопе Libra 120 (Zeiss, Германия).
Для этой работы использовалась двугибридная дрожжевая тест-система MATCHMAKER Two-Hybrid System 3, сконструированная согласно протоколу фирмы Клонтек (Clontech, США). С этой целью использовали штамм Saccharomyces cerevisiae Y187 (МАТа, игаЗ-52, his3-200, ade2-101, trpl-901, leu2-3, 112, gal4A, met- gal80A, MEL1, URA3:.GAL1UAS -GALlTATA-lacZ) и плазмиды pGBKT7-53 и pGADT7, экспрессирующие мышиный p53 и SV40 large T-antigen, соответственно (Kovalchuk et al., 2006). Трансформацию дрожжевых клеток плазмидами проводилисогласно ранее опубликованной работе с использованием литий-ацетатного метода, а отбор колоний, трансформированных экспрессирующими плазмидами, проводили на чашках с селективными средами, дефицитными по аминокислотам в соответствии с вводимыми плазмидами. Определение активности /?-галактозидазы, экспрессируемой в дрожжевых клетках, трансформированных плазмидами, под действием тестируемых химических соединений с использованием ONPG (0-нитрофенил-/?-О-галактозида) в качестве субстрата проводили согласно протоколу фирмы Клонтек (Clontech, США). Культуру дрожжевых клеток (250 мкл) смешивали с раствором тестируемого соединения (2,5 мкл) и инкубировали 4 ч при 30 С. Затем отбирали 150 мкл суспензии дрожжевых клеток для измерения оптической плотности (O.D.600). Оставшиеся клетки отмывали в Z-буферном растворе (0,1 М фосфат натрия, рН 7.0, 10 мМ КС1, 1 мМ MgS04 и 0,27% /?-меркаптоэтанол) и дезинтегрировали в жидком азоте путем процедуры замораживания-оттаивания. Клеточный лизат смешивали с 4 мг/мл ONPG (40 мкл) и после появления желтого окрашивания раствора (обычно через 30 мин) останавливали реакцию добавлением 1 М Na2C03 (100 мкл). Аливоты (150 мкл) помещали в 96-луночные микропланшеты и измеряли поглощение при 420 и 570 нм с помощью спектрофотометра планшетного формата nQuant (Bioek Instruments, США). Активность /?-галактозидазы подсчитывали по формуле:
U=1000x (O.D.415- 1.75 х O.D.570 / (O.D.600 V t), где t - время реакции, мин; V— объем культуры дрожжей, мл; O.D.600 - плотность суспензии в начале эксперимента; O.D.415 - поглощение О-нитрофенола в конце реакции;
Измерение активности неспецифической эстеразы
Поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP) - ферменты, катализирующие поли-АДФ-рибозилирование, один из видов посттрансляционной модификации белков. Наиболее известным представителем суперсемейства является фермент PARP-1, участвующий в репарации повреждений ДНК и ремоделировании хроматина за счет поли-АДФ-рибозилирования гистонов. Поскольку при апоптозе ДНК подвергается расщеплению, каспазы расщепляют и тем самым инактивируют PARP-1, предотвращая репарацию расщепляемой при апоптозе ДНК (Ruggieri et. al., 1990).
Каспаза-9 - одна из каспаз человека, кодируемая геном CASP9 на 1-й хромосоме. Каспаза-9 играет важную роль в сигнальной цепочке апоптоза, вероятно, представляя наиболее «верхний» узел протеазного каскада этой цепочки после сборки апоптосомы. После активации апоптосомой каспаза-9 в свою очередь активирует ряд других молекул, что в конечном счёте и вызывает запрограммированную клеточную смерть (Li et. al., 1997).
Каспаза-3 активируется другими каспазами. Вместе с каспазами-8 и -9 каспаза-3 отвечает за ключевые события в процессах апоптоза. Установлено, что каспаза-3 усиливает сигналы инициации каспаз-8 и -9 для завершения процесса апоптоза (Мартынова, 2003).
На сегодняшний день известно, что апоптоз может идти разными метаболическим путям: каспазному и в обход активации каспаз. Для того чтобы определить, какой путь апоптоза запускают тритерпеновые гликозиды голотурий, была проведена регистрация наличия каспазы-3 после индукции апоптоза в цитоплазме опухолевых клеток АКЭ. Измерение количества вышедшей в цитоплазму активированной каспазы-3 определялось спектрофлуориметрически путем регистрации расщепления субстрата Z-DEVD-AMC, который специфически расщепляется каспазой-3 с образованием конечного флуоресцентного продукта.
Было установлено, что кукумариозид Аг-2 наиболее эффективно индуцирует выход активированной каспазы-3 в минимальной исследуемой концентрации 0,001 мкМ в первые 1-3 ч; выход каспазы-3 в цитоплазму при этом составлял порядка 20-25% от контроля (Рис. 11 А). При максимальной исследуемой концентрации кукумариозида Аг-2 равной 1 мкМ, выход каспазы-3 в цитоплазму также наблюдался через 1-3 часа инкубирования, однако он был менее выражен при сравнении с концентрацией 0,001 мкМ. В то же время, наблюдалось присутствие активной каспазы-3 в цитоплазме (порядка 15%) через 24 ч инкубирования гликозида с клетками (Рис. 11 Б).
В случае инкубирования опухолевых клеток АКЭ с фрондозидом А, максимальный выход каспазы-3 происходил также при концентрации 0,001 мкМ после 1-3 ч инкубирования и превышал уровень содержания каспазы-3 в цитоплазме интактных клеток на 30%. Инкубирование клеток с фрондозидом А в концентрации 1 мкМ приводило к выраженному увеличению уровня каспазы-3 уже в первый час инкубирования (Рис. 11 В). Кроме того, так же, как и в случае с кукумариозидом Аг-2, наблюдалось присутствие активной каспазы-3 в цитоплазме (порядка 15% по сравнению с контролем) через 24 ч инкубирования гликозида с клетками (Рис. 11 Г).
Была исследована способность гликозидов голотурий инициировать активацию каспаз в опухолевых клетках репродуктивной сферы человека, чувствительных и резистентных к цитостатику цисплатин. На рисунке 12 А, Б и В показано, что при инкубировании опухолевых терминальных клеток линии NT2, чувствительных к цисплатину, с гликозидами в течение 24 ч и 48 ч, наблюдалась индукция апоптоза в клетках, выражающаяся в расщеплении PARP-1. Был установлен дозозависмый эффект влияния исследуемых соединений на появление фрагмента расщепленного белка PARP-1 (89 кДа) в опухолевых клетках линии NT2. Максимальную эффективность препараты проявляли при концентрации 2 мкМ, наименьшую - 0,1 мкМ.
Установлено, что помимо клеток NT2 фрондозид А вызывал появление расщепленного фрагмента PARP-1 в клетках линии NT2-R, устойчивых к цисплатину (Рис.12 Г), а также в клетках рака простаты линии РСЗ. Кукумариозид А2-2 оказался менее эффективным по отношению к этим типам опухолевых клеток. Он вызывал расщепление PARP-1 только в клетках линии NT2 за 24 (Рис. 12 А) и 48 ч инкубирования и был неэффективен в отношении остальных исследуемых опухолевых клеток человека NT2-R и РСЗ. NT2 24ч
Влияние тритерпеновых гликозидов на активацию каспазы-3 и каспазы-9. Иммуноблоттинг лизатов клеток РСЗ, инкубированных с кукумариозидом Аг-2 и фрондозидом А в течение 48 ч. Кук - кукумариозид Аг-2; фрон - фрондозид А. Методом иммуноблоттинга с применением специфических антител было установлено, что кукумариозид Аг-2 и фрондозид А активируют каспазу-3 и каспазу-9 в концентрациях 2 и 1 мкМ после 48 ч инкубирования с опухолевыми клетками репродуктивной сферы человека линии РСЗ. На рисунке 13 стрелками показана увеличенная экспрессия интересующих белков (каспаза-3 и каспаза-9), по сравнению с контролем, что свидетельствует об индукции этих ферментов под воздействием тритерпеновых гликозидов (Рис. 13).
При исследовании клеточной деструкции в клетках АКЭ при их инкубировании с кукумариозидом Аг-2 и последующем применении фазово-контрастной микроскопии, а также трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии, было установлено, что в эксперименте встречаются клетки, разрушающиеся двумя способами: апоптозом и некрозом. В первом случае для разрушающихся клеток характерны такие морфологические особенности, как прогрессирующее сморщивание (Рис. 14 А), фрагментация хроматина (Рис. 14 Б), выраженный "блеббинг" клеточной поверхности, происходящий вследствие формирования апоптотических телец (Рис. 14 В), и, наконец, разъединение этих телец (Рис. 14 В, вставка). Данный способ деструкции соответствует критериям апоптоза (Реунов, Реунов; 2008; Saraste, Pulkki, 2000; Zong, Thomson, 2006; Chaabane et.al., 2013). Кроме того, были обнаружены клетки, разрушающиеся без формирования апоптотических телец и фрагментации хроматина. Для таких клеток характерна рыхлая губчатая поверхность с разрывами клеточной мембраны (Рис. 14 Г) и вакуолизация цитоплазмы при наличии внешне нормального ядра (Рис. 14 Д). На следующем этапе происходит рассеивание остатков цитоплазмы с органоидами, сопровождаемое появлением электронно-светлых литических зон в ядре (Рис. 14 Е). Прогрессирующее формирование литических зон приводит к полному рассеиванию ядерного материала, происходящему вслед за разрушением цитоплазмы. Данный способ разрушения соответствует описанию некроза (Реунов, Реунов; 2008; Zong, Thomson, 2006; Kung et.al., 2011; Chaabane et.al., 2013). Рис. 14. Клетки карциномы Эрлиха, подвергающиеся деструкции под действием кукумариозида Аг-2 (0,1 мкМ). А - апоптоз; сморщивающаяся клетка; фазово-контрастная микроскопия (ФКМ). Масштаб: 5 мкм. Б - апоптоз; звездочками показаны раздельные участки ядерного материала, сформировавшиеся в процессе фрагментации хроматина; трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Масштаб: 1 мкм. В - апоптоз; клетка, фрагментирующаяся на апоптотические тельца (AT); сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Масштаб: 1 мкм. В (вставка) - апоптотические тельца, сохраняющие колокализацию после распада клетки; ФКМ. Масштаб: 5 мкм. Г - некроз; характерная губчатая поверхность разрушающейся клетки; стрелкой показан разрыв клеточной поверхности; СЭМ. Масштаб: 1 мкм. Д - некроз; звездочками показаны вакуоли, возникающие в цитоплазме (Ц); ядро (Я) не имеет явных признаков деструкции; ТЭМ. Масштаб: 1 мкм. Е - некроз; клеточное ядро еще сохраняет форму, но в нем уже видны электронно-светлые литические зоны (обозначены шестилучевыми звездочками); вокруг ядра видны остатки цитоплазмы с органоидами; ТЭМ. Масштаб: 1 мкм. Ж - переход от апоптоза к некрозу, часть поверхности клетки покрыта сформировавшимися апоптотическими тельцами (AT), тогда как другая часть имеет губчатую поверхность (показана наконечниками); СЭМ. Масштаб: 1 мкм. Наряду с двумя описанными выше способами деструкции, выявлен переходный вариант клеточной гибели, морфологически соответствующий комбинированному способу деструкции, включающему в себя как элементы апоптоза, так и некроза. Около половины поверхности таких "гибридных" клеток покрыта сформировавшимися апоптотическими тельцами, тогда как остальная их часть имеет губчатую поверхность, характерную для клеток, подвергающихся некрозу (Рис. 14 Ж). Так как апоптоз происходит при сохранении жизнеспособности клетки, а некроз часто является следствием ее утраты, мы предполагаем, что в клетках АКЭ переход от апоптоза к некрозу происходит вследствие гибели опухолевых клеток, индуцированной применением кукумариозида Аг-2.
Исследование влияния кукумариозида Аг-2 и фрондозида А на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток
После проведенного протеомного исследования опухолевых клеток линии РСЗ с использованием 2Б-электрофореза и последующего MALDI-MS анализа было определено 20 белков, экспрессия которых изменялась после инкубирования с кукумариозидом Аг-2, и 30 белков, экспрессия которых регулировалась под воздействием фрондозида А, в два и более раза. В результате проведенных работ по анализу регулируемых белков, мы отобрали 4 белка для их верификации методом вестерн-блоттинга и 2В-вестерн-блоттинга кератин-81, катепсин В, интерлейкин-1Р и Сгк II, экспрессия которых одинаково регулируется как кукумариозидом Аг-2, так и фрондозидом А.
Экспрессия белка CRK II увеличивалась при инкубировании клеток с кукумариозидом Аг-2 (Рис. 34 Б). Эксперименты по верификации белков методом иммуноблоттинга показали, что кукумариозид Аг-2 достоверно увеличивает экспрессию обеих изоформ интерлейкина-ір, но в то же время экспрессия белка кератин 81 находится на уровне контроля (Рис. 34 А и В). Для подтверждения ап-регуляции кератина 81 был проведен 2В-вестерн-блоттинг. Этот эксперимент показал достоверное увеличение экспрессии данного белка по сравнению с контролем (Рис. 35 А, Б). Методом 2Б-электрофореза и последующего MALDI-MS было установлено, что экспрессия катепсина В снижается после инкубирования опухолевых клеток человека линии РСЗ с гликозидом в течении 48 ч. Эти данные были подтверждены только после выполнения верификации при помощи метода 2В-вестерн-блоттинг (Рис. 35 В, Г), так как при использовании одномерного иммуноблоттинга достоверных различий между контрольными клетками и клетками, инкубированными с кукумариозидом Аг-2, обнаружено не было (Рис. 34 Г). Вероятнее всего это связано с тем, что при одномерном иммуноблоттинге не удается разделить изоформы интересующего белка по их изоэлектрическим точкам. D 2мкМ
С помощью специфических антител методом вестерн-блоттинг был проведен анализ и верификация белков, экспрессия которых увеличивается или снижается под воздействием фрондозида А. Помимо этого, для белков кератин 81 и катепсин В была сделана верификация при помощи 2В-вестерн-блоттинга. На рисунке 36 В показано, что экспрессия интерлейкина-ір значительно повышается при инкубировании клеток РСЗ с тритерпеновым гликозидом фрондозидом А. В тоже время, при использовании одномерного иммуноблотинга не заметна разница в экспрессии белка кератин 81 (Рис. 36 А). Ап-регуляция данного протеина подтверждена двумерным вестерн-блоттингом (Рис. 37 А и Б). На рисунке отчетливо видно увеличение количества кератина 81 под влиянием фрондозида А, по сравнению с контролем. Ап-регуляция наблюдалась также для белка CRK II после инкубирования опухолевых клеток человека линии РСЗ с фрондозидом А в течении 48 ч. Даун-регуляция активной изоформы катепсина В была подтверждена как одномерным, так и двумерным вестерн-блоттингом (Рис. 36 Г и Рис. 37 Г).
Таким образом, впервые был зарегистрирован ответ опухолевых клеток на воздействие тритерпеновых гликозидов на молекулярном уровне с использованием методических подходов, применяемых в протеомике. Было показано, что кукумариозид Аг-2 и фрондозид А вызывают изменение экспрессии ряда белков, играющих ключевую роль в процессах функционирования опухолевых клеток. Эти молекулярные/субмолекулярные процессы участвуют в механизмах развития и деления опухолевых клеток, инвазии опухолей и контролируют процессы программируемой гибели опухолевых клеток. Следовательно, результаты, полученные с помощью методов протеомики, хорошо согласуются с предположениями, что фармакологические принципы противоопухолевого действия тритерпеновых гликозидов связаны со способностью гликозидов тормозить пролиферацию опухолевых клеток, блокировать клеточный цикл и индуцировать апоптоз опухолевых клеток.
Для исследования противоопухолевой активности кукумариозида Аг-2 было проведено два типа экспериментов, в которых были смоделированы поздняя и ранняя стадии заболевания мышей асцитной формой карциномы Эрлиха. Кукумариозид Аг-2 вводили в виде комплекса с холестерином для того, чтобы уменьшить цитотоксическую активность этого тритерпенового гликозида. В первом типе экспериментов по моделированию поздней стадии заболевания мышам внутрибрюшинно инокулировали опухолевые клетки в количестве 20 млн клеток на мышь. Препарат вводили ежедневно внутрибрюшинно в течение 7 дней до и в течение 7 дней после инокуляции опухоли (комбинированная схема). На протяжении последующих 30 дней ежедневно проводился подсчет количества погибших животных. Схема эксперимента и результаты по подсчету средней продолжительности жизни (СПЖ) представлены в таблице 7.
В результате проведенных экспериментов было показано, что в контрольной группе животных последние 2 мыши погибли на 17 день эксперимента. Средняя продолжительность жизни в контрольной группе составила 16 дней. При применении кукумариозида Аг-2 увеличения СПЖ мышей не наблюдалось. В группе с использованием кукумариозида Аг-2 первые 4 животных погибли на 15 день после введения опухоли, а оставшиеся 2 мыши на 16 день, СПЖ в данной группе составило 15,33 дня. Таким образом, в экспериментах с инокуляцией большого количества опухолевых клеток (20 млн клеток на одно животное), которое может соответствовать поздним стадиям развития заболевания, кукумариозид Аг-2, вводимый по комбинированной схеме, не показал достоверного увеличения средней продолжительности жизни животных.
