Введение к работе
Актуальность проблемы. Транскетолаза относится к группе тиаминовых ферментов, катализирует взаимопревращение фосфэсаха-ров путем переноса двууглеродного фрагмента (остатка гликолевого альдегида) с кетосахаров на альдосахара. В результате ее функционирования в пентозном пути превращения углеводов образуются, в частности, рибозо-5-фэсфат и восстановленный НАДФ. Этим определяется роль транскетолазы. в процессах синтеза нуклеиновых кислот, восстановительного синтеза жирных кислот- и стероидов.
Фосфоглицериновый альдегид является одним из субстратов транскетолазы (а также и продуктом реакции) и в то же время -субстратом глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, ключевого фермента гликолитического пути превращения углеводов. Более того, показано непосредственное взаимодействие (с образованием достаточно стабильного комплекса) транскетолазы с глицеральдегидфосфатде-гидрогеназой (Чернов, 1971).
Таким образом осуществляется тесная взаимосвязь пентозного пути превращения углеводов и гликолиза, и возможность переключения процесса обмена углеводов с одного пути на другой.
Транскетолаза широко распространена в природе. Она обнаружена во всех исследованных органах и тканях животных и растений, а также у микроорганизмов. В настоящее время из многих источников фермент выделен в гомогенном виде.
Наиболее изученной является транскетолаза пекарских дрожжей. Известна ее олигомерная структура, в достаточной степени хорошо изучены функциональные группы апобелка и кофермента, структура активного центра, химизм катализируемой ею реакции. До сих пор , однако, ничего не известно относительно механизма ре-
4 і
гуляции данного фермента. Одним из возможных путей решения этой проблемы могло бы стать изучение множественных форм транскетолазы. В литературе этому вопросу посвящено достаточно много работ. Все они проводились, в основном, на гемолизатах эритроцитов и касались идентификации (электрофоретически) белковых полос, обладающих транскетолазной активностью. Однако, для решения проблемы множественных форм, в связи с их возможным участием в процессах регуляции, необходимо не только идентифицировать множественные формы, но и выделить их в высокоочищенном состоянии и подробно изучить свойства".
Ранее, в высокоочищенных препаратах пекарских дрожжей было показано наличие двух форм фермента, разделяемых хроматографи-чески на ионообменных колонках (Чернов, 1971). Подробно, однако, они не исследовались, т.к. тогда такая задача не ставилась.
Целью настоящей работы являлась идентификация множественных форм транскетолазы в дрожжевом экстракте, их выделение и очистка до гомогенного состояния, и исследование их свойств.
Научная новизна. В результате работы в экстрактах пекарских дрожжей и ряда животных тканей были обнаружены и идентифицированы три формы транскетолазы, отличающиеся по термостабильности и обозначенные нами как А, В и С. Все три формы фермента из пекарских дрожжей были выделены в гомогенном виде и закристаллизованы; морфология их кристаллов различна. Проведено сравнительное изучение физико-химических и кинетических свойств транскетолазы А и С. В частности показано, что в транскетолазе формы С, в отличие от транскетолазы А, субъеденицы связаны между собой ди-сульфидными связями.
Практическое значение. Полученные результаты расширяют наши представления о транскетолазе с точки зрения наличия множествен-
пых форм формоита. Разработан простой, быстрый и эффективный метод идентификации множественных форм транскетолазы в тканевых экстрактах, который может быть взят за основу при разработке клинического метода определения количественного соотношения форм фермента в норме и при патологии с целью диагноза различных заболеваний. Разработан метод выделения и очистки до гомогенного состояния множественных форм транскетолазы пекарских дрожжей, что являлось необходимым условием для дальнейшего изучения свойств этих форм и их отношения к проблемме регуляции данного фермента.
Апробация. Результаты работы доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ.
Публикации. Результаты исследования изложены в 3 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит страниц машинописного текста, таблиц и рисунков. Список литературы включает источников.
