Введение к работе
Актуальность проблемы.
Данная работа посвящена изучению актуальной проблемы современной биохимии
— механизмам и способам практического применения металл-зависимого спин-
селективного ферментативного катализа. Эта проблема была впервые выявлена и
сформулирована благодаря открытию магнитных изотопных эффектов (МИЭ) ряда
металлов - магния, кальция, ртути — в реакциях АТФ-синтезирующих киназ различного
происхождения [Buchachenko, et al., 2005-2012; Buchachenko, 2009; Kuznetsov, et al., 2011].
Данные эффекты, выражающиеся обычно в гиперактивации фермента в присутствии
изотопа с некомпенсированным ядерным спином ( Mg, Са), привлекли внимание как
химиков [Tulub, 2010; Arkhangelsky, et al., 2011], так и фармакологов [Amirshahi, et al.,
2007-2009; Rezayat, et al., 2009; Bukhvostov, et al., 2012] тем, что наряду с их
фундаментальной ролью в регуляции работы фосфат-переносящих ферментов, эти
эффекты могут составить основу нового подхода к управлению катализом. Так,
установлено, что проявление МИЭ в таком катализе связано с ион-радикальными,
квантово-механическими процессами, что предполагает возможность поиска путей
ядерно-магнитного управления этим катализом [Buchachenko, et al., 2012; Bukhvostov, et
al., 2012; Shatalov, et al., 2013]. Фармакологический и биотехнологический потенциалы
такой возможности еще только предстоит оценить.
Говоря о биологических системах транспорта фосфата, большинство которых (киназы, АТФ-синтазы) являются Mg -зависимыми, следует также указать и на семейство ДНК-полимераз, активность которых также требует присутствия магния и связана с переносом фосфатной группы. Несомненный интерес представляют в этой связи ферменты из группы ДНК-полимераз Р, ответственные за синтез фрагментов, предназаначенных для репарации дефектов ДНК. Ферменты этой группы Mg-зависимы и гиперэкспрессированы во многих злокачественных опухолях, что делает их, по мнению фармакологов, «легитимными мишенями» для воздействия цитостатиков. Попытка исследования возможных проявлений МИЭ в реакциях ферментов этой группы, могла бы не только помочь дополнить современные представления о природе и механизме МИЭ, но и позволить получить данные о роли МИЭ в контроле за динамикой клеточных популяций
— при проведении экспериментов на чистых ферментах и на культурах клеток. В
последнем случае удобной моделью могла бы служить линия клеток острого
миелобластного лейкоза человека HL60, то есть клетки агрессивно растущей злокачественной опухоли, структурно-функциональные особенности ДНК-полимераз Р которых до сих пор специально не исследовались [Bukhvostov, et al., 2013].
Таким образом, исследования параметров квантово-механического (ион-радикального) механизма проявления МИЭ в реакциях ферментативного фосфорилирования представляет собой актуальную научную проблему вследствие сочетания следующих фактов:
высокая эффективность ядерно-магнитного управления скоростью металл-зависимого ферментативного катализа;
возможность такого управления для ферментов транспорта фосфата, к числу которых относятся ключевые ферменты энергетического обмена, репликации и репарации ДНК в клетках эукариот (АТФ-синтазы, киназы, ДНК-полимеразы);
гиперэкспрессия ДНК-полимераз Р в клетках многих злокачественных опухолей, делающая ферменты этой группы «легитимной мишенью» для новых цитостатиков.
Цель исследования.
Целью настоящего исследования является поиск и оценка возможностей ядерно-магнитного управления металл-зависимыми процессами репликации ДНК и киназного синтеза АТФ in vitro с помощью магнитных изотопов магния и цинка, и, связанного с этим, фармакологического потенциала их магнитных изотопных эффектов.
Задачи исследования
1. Изучение влияния магнитных и немагнитных изотопов цинка на каталитическую
активность креатинкиназы яда V. xanthia и пируваткиназы ретикулоцитов кролика.
-
Изучение влияния магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка на каталитическую активность термофильной ДНК-полимеразы в ПНР и ДНК-полимеразы бета из хроматина клеток миелоидного лейкоза человека HL-60.
-
Оценка влияния магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка на пролиферацию и апоптоз клеток HL-60.
-
Создание модели ион-радикального механизма участия магнитных изотопов в ферментативных реакциях транспорта фосфата при синтезе АТФ и ДНК.
Научная новизна.
Обнаружено проявление магнитного изотопного эффекта (МИЭ) Zn в регуляции
каталитической активности креатинкиназы и пируваткиназы.
Обнаружена роль магнитных изотопных эффектов Mg и Zn в регуляции
активности ДНК-полимераз
Выделена, очищена и охарактеризована уникальная Р-подобная ДНК-полимераза
из хроматина клеток HL-60
Предложена схема ион-радикального механизма переноса фосфата в синтезе ДНК
Научно-практическая значимость:
-
Представленная работа вносит вклад в развитие современных представлений о механизмах МИЭ и, следовательно, о перспективах его возможного применения в биохимии и медицине.
-
Обнаруженная и изученная способность магнитных изотопов магния и цинка влиять на ферментативный синтез АТФ и ДНК позволяет использовать эти изотопы в управлении данными процессами.
-
Предложенная в работе методика выделения и очистки ДНК-полимеразы Р из клеток острого миелоидного лейкоза человека HL-60 может быть использована в экспериментах на этих и других лейкемических клетках.
