Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы ...10
1.1. Механизмы регенерации тканей 10
1.1.1. Особенности заживления кожных ран 13
1.1.2. Особенности заживления язвы желудка 15
1.2. Покрытия для терапии ран 17
1.3. Биологически активные вещества, ускоряющие репарацию тканей 20
1.3.1. Факторы роста 21
1.3.2. Тромбин 22
1.3.3. Пептиды, имитирующие действие тромбина 25
1.4. Системы доставки БАВ и методы их получения 27
1.4.1. Микрочастицы и микрокапсулы 28
1.4.2. Методы капсулирования БАВ в биосовместимые полимерные микрочастицы и микрокапсулы 30
1.4.2.1. Метод простой эмульсии (В/М) 31
1.4.2.2. Метод двойной эмульсии (ТВ/М/В) 33
1.4.2.3. Метод двойной эмульсии (Ві/МУВ2) 33
1.4.3. Полимерные материалы для капсулирования БАВ 35
1.4.3.1. Сополимеры молочной и гликолевой кислот 35
1.4.3.1.1. Основные характеристики PLGA 37
1.4.3.1.2. Механизм и особенности деструкции PLGA 38
1.4.3.1.3. Механизм выделения БАБ из PLGA микрочастиц 40
1.5. Заключение 42
Глава 2. Экспериментальая часть 43
2.1. Материалы 43
2.1.1. Реагенты 43
2.1.2. Буферные растворы 43
2.1.3. Растворители 43
2.2. Лабораторное оборудование 44
2.3. Методы 1 45
2.3.1. Капсулирование пептидов методом двойной эмульсии (Bi/M/B2) 45
2.3.2. Капсулирование пептидов методом простой эмульсиии (В/М) 47
2.3.3. Исследование стабильности двойной эмульсии и
распределения микрочастиц по размерам 47
2.3.4. Получение образцов для исследований 48
2.3.4.1. Получение образцов для исследования скорости деструкции PLGA микрочастиц 48
2.3.4.2. Получение образцов для исследования кинетики выхода пептидов и их адсорбции/десорбции на/с поверхности PLGA микрочастиц 48
2.3.4.3. Получение образцов для исследования биологической активности пептидов 49
2.3.4.4. Получение образцов для исследования влияния межфазной поверхности вода/органический растворитель на биологическую активность TRAP-6 50
2.3.4.5. Получение образцов для исследования влияния межфазной поверхности вода/органический растворитель на адсорбцию TRAP-6 на твердых поверхностях 52
2.3.5. Исследование скорости деструкции PLGA микрочастиц 53
2.3.6. Исследование кинетики выхода пептидов и их адсорбции/десорбции на/с поверхности PLGA микрочастиц...53
2.3.7. Исследование биологической активности пептидов 54
2.3.8. Исследование эффектов инкапсулированных пептидов на процесс заживления кожных ран у мышей 55
2.3.9. Исследование эффектов инкапсулированных пептидов на процесс заживления язвы желудка у крыс 56
Глава 3. Обсуждение результатов 57
3.1. Выбор биологически активных пептидов 57
3.1.1. Исследование биологической активности пептидов методом агрегации тромбоцитов 60
3.1.1.1. Оптимизация метода 61
3.1.1.2. Исследование биологической активности TRAP-6 и TRAP-6(M) 65
3.2. Выбор биосовместимого полимера для капсулирования пептидов 66
3.3. Капсулирование пептидов методом двойной эмульсии (Ві/М/Вз) 67
3.3.1 Оптимизация метода 67
3.3.2. Исследование стабильности двойной эмульсии 70
3.3.3. Исследование физико-химических свойств PLGA микрочастиц 72
3.3.3.1. Исследование морфологии поверхности PLGA микрочастиц 72
3.3.3.2. Исследование распределения по размерам PLGA микрочастиц 75
3.3.4. Исследование скорости деструкции PLGA микрочастиц 76
3.3.5. Исследование пептидов методом ВЭЖХ 78
3.3.5.1. Оптимизация метода 78
3.3.5.2. Исследование кинетики выхода пептидов из PLGA микрочастиц 86
3.3.5.3. Исследование адсорбции/десорбции пептидов на/с поверхности PLGA микрочастиц 88
3.3.6. Исследование некоторых факторов, влияющих на потери пептидов в процессе микрокапсулирования 90
3.3.6.1. Исследование влияния межфазной поверхности вода/органический растворитель на биологическую активность TRAP-6 91
3.3.6.2. Исследование влияния межфазной поверхности вода/органический растворитель на адсорбцию TRAP-6 93
3.4. Капсулирование пептидов методом простой эмульсии (В/М) 96
3.5. Исследование эффектов инкапсулированных пептидов на процесс репарации тканей in vivo 97
3.5.1. Исследование эффектов инкапсулированных пептидов на процесс заживления кожных ран у мышей 98
3.5.2. Исследование эффектов инкапсулированных пептидов на процесс заживления язвы желудка у крыс 101
Выводы 106
Благодарности 107
Литература 108
- Покрытия для терапии ран
- Механизм и особенности деструкции PLGA
- Исследование морфологии поверхности PLGA микрочастиц
- Исследование адсорбции/десорбции пептидов на/с поверхности PLGA микрочастиц
Введение к работе
Одной из сложнейших задач современной биомедицины, а также одной из центральных проблем фундаментальной биохимии, является репарация тканей после повреждения. В настоящее время известно большое число биологически активных веществ (БАВ), влияющих на эффективность регенерации животных тканей. Например, компоненты матрикса раны (фибронектин [1], гиалуроновая кислота [2], различные факторы роста [3] глокозаминогликаны [4] и т.д.), БАВ растительного происхождения (подорожник [5], алоэ [6] и т.д.). Под влиянием различных БАВ происходит улучшение обменных процессов, ускорение регенерации тканей, стимуляция неспецифического иммунитета. Препараты на основе БАВ, используемые в фазах регенерации и рассасывания рубца с эпителизацией, должны обладать определенными свойствами: стимулировать регенеративные процессы, способствуя росту грануляций и ускорению эпителизации, защищать грануляционную ткань от вторичной инфекции и подавлять рост микрофлоры в ране.
Среди прочих биологически активных веществ, способных ускорить процесс заживления ран, повышенное внимание в последнее время уделяется белкам и пептидам (гормонам, различным факторам роста др.). Особое место среди них занимает тромбин (сериновая протеаза семейства трипсина), который, являясь фактором роста, не только регулирует свертывающие и противосвертывающие механизмы и ангиогенез, но также включается в воспалительную и пролиферативную фазы ранозаживления, стимулируя при этом пролиферацию клеток эндотелия, фибробластов и продукцию последними коллагена. Однако применение тромбина ограничено его высокой лабильностью и высокой стоимостью. Ранее в ИБХ РАН для стабилизации тромбина был разработан метод его инкапсулирования в пленки биосовместимого гидрогеля и продемонстрировано ускорение процесса заживление наружных ран под этими покрытиями в моделях in vivo. Кроме того, возможно еще одно решение данной проблемы. Некоторые синтетические пептиды могут имитировать действие тромбина в процессе регенерации ткани. Являясь более дешевыми по сравнению с тромбином, пептиды, однако, очень быстро расщепляются пептидазами в организме.
Разработка транспортных форм с контролируемым выделением пептидов, а именно, их капсулирование в биосовместимые полимерные матрицы позволит, как защитить пептиды от разрушения, так и направленно регулировать скорость их выхода in vivo. В связи с этим особую значимость приобретает правильный выбор полимерной матрицы.
Использование полиэфиров на основе молочной и гликолевой кислот позволяет получать матрицы, которые являются не только биосовместимыми, но и биодеградируемыми, а, следовательно, могут быть предложены для лечения как внешних, так и внутренних ран (раны после хирургических вмешательств, язвы и др.). Варьируя состав полимерной матрицы, размеры микрочастиц, количество капсулированных пептидов, можно контролировать скорость их выхода. Период выхода может варьироваться от нескольких часов до нескольких недель, в зависимости от свойств используемого полимера. Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось капсулирование биологически активных веществ, в частности, пептида-агониста тромбинового рецептора TRAP-6 (thrombin receptor agonist peptide) и его аналога TRAP-6(M) в биосовместимые биодеградируемые микрочастицы на основе сополимера (d,l)-молочной и гликолевой кислот (PLGA) и исследование возможности применения этих пептидов для репарации тканей. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
1. Изучить биологическую активность пептидов in vitro.
2. Разработать и оптимизировать метод инкапсулирования TRAP-6 и TRAP-6(М) в PLGA микрочастицы. 3. Исследовать некоторые физико-химические свойства микрочастиц с инкапсулированными пептидами (распределение микрочастиц по размерам, морфологию поверхности и скорость их деструкции in vitro).
4. Исследовать кинетику выхода пептидов из микрочастиц, а также их адсорбцию на поверхность микрочастиц in vitro.
5. Исследовать ранозаживляющие эффекты инкапсулированных пептидов на процесс репарации тканей как в случае наружных резаных ран, так и для модели язвы желудка (мыши, крысы).
Покрытия для терапии ран
Целью лечения любой раны является восстановление в кратчайшие сроки первоначальной формы и функций поврежденного органа и ткани. Основные мероприятия, направленные на достижение этой цели, состоят в следующем: в оценке раны с точки зрения ее происхождения, локализации, возраста и состояния пациента; в остановке капиллярного кровотечения; в очищении раны от гнойно-некротического содержимого и устранении обсеменения микроорганизмами; в закрытии раны с помощью швов или различных покрытий. Сегодня для лечения наружных ран и раневой инфекции предлагается большое количество различных покрытий.
В отличие от терапии наружных ран, лечение язвы желудка требует иных подходов. Однако, помимо проведения терапии, направленной на подавление бактериальной инфекции, на сегодняшний день не существует способов стимулирования заживления язвы как раневого дефекта.
Существует несколько распространенных классификаций раневых покрытий. По механизму действия покрытий представляется возможным разделить их следующим образом [16]: 1. Пассивные материалы. Традиционные материалы, такие как марлевые и тканевые повязки. 2. Интерактивные материалы. Этот вид материалов представлен полимерными покрытиями, прозрачными и проницаемыми для воды и газов, но непроницаемыми для бактерий, такими как пленки [17], губки [18], гидроколлоидные и гидрогелевые покрытия [19, 20]. 3. Биоактивные материалы. Биологически активными считаются материалы, которые выделяют БАВ в рану, и/или обладают собственной эндогенной активностью, такие как протеогликаны, коллаген [21], альгинаты [22] и хитозаны [23,24]. По физико-химическим свойствам покрытия можно разделить на биодеградируемые (рассасывающиеся) и биоинертные. Как правило, биодеградируемые покрытия изготавливают из природных полимеров (желатина, коллагена, хитозана). Всем раневым покрытиям в той или иной степени присущи следующие свойства: - изолирующие (предотвращение проникновения инфекции извне, защита от механического травмирования раны); - сорбционные (способность поглощать выделяющийся из раны экссудат и препятствовать его скоплению под покрытием); - предотвращающие испарение экссудата; - рассасывающиеся покрытия. По форме изготовления покрытия классифицируют следующим образом: - Прозрачные пленки. Такие покрытия на основе полиуретана, полиэтилена или силикона используются для поверхностных ран (порезы, царапины), в которых практически отсутствует экссудат (жидкость) (например, Tegaderm, ЗМ Ltd., США). Прозрачные пленки непроницаемы для микроорганизмов, т.е. выполняют барьерную функцию [25]. - Губки. Губки характеризуются различной абсорбционной способностью и применяются обычно для покрытия ран в стадиях грануляции и эпителизации с умеренной или незначительной экссудацией (например, CollaGUARD, Innocoll Inc., США). Для губок характерно наличие развитой пористой структуры, что обеспечивает им высокую абсорбирующую способность и высокую проницаемость для газов и паров кислорода [26]. - Гидроколлоиды. Гидроколлоидные покрытия изготавливают из целлюлозы, желатина или пектина на полиуретановой пленке, и применяются, в основном, для лечения хронических экссудативных ран (например, Granuflex, Cova Tec Ltd., Великобритания). Гидроколлоидные компоненты повязки способны поглощать умеренное количество раневого экссудата, формируя увлажняющую среду, что благоприятствует процессу заживления, абсорбции раневого экссудата и помогает в аутолитическом очищении раны [27]. Основным свойством гидроколлоидных покрытий на основе альгинатов (например, Kaltostat ConvaTec Ltd.) является свойство абсорбировать большое количество экссудата, в 15-20 раз превышающего вес сухого вещества. Кроме того, альгинаты обладают гемостатическими свойствами [28]. - Гидрогели. В отличие от гидроколлоидных покрытий, гидрогели накладываются на рану уже в виде "мокрого" геля (например, Intrasite Gel, Smith & Nephew Healthcare Ltd., США). Основу практически всех современных гидрогелей составляют различные синтетические, искусственные и природные полимеры, например карбоксиметилцеллюлоза и полиэтилен оксид с содержанием воды до 90% веса покрытия. Гидрогели способны поглощать и сохранять существенные объемы экссудата, а также способствовать автолизу омертвевших клеток [29]. Тем не менее, большинство известных на сегодняшний день раневых покрытий не влияет на скорость процесса заживления ран, так как не обладает выраженным терапевтическим эффектом. Таким образом, речь может идти не об истинном процессе заживления, а только о способности этих препаратов помочь возвратить течение раневого процесса в его естественное биологическое русло. За последнее десятилетие широкое распространение получила идея создания материалов с контролируемым выделением БАВ для стимулирования процесса заживления сложных ран, таких как ожоговые, язвенные и т.д. Из огромного числа биологически активных веществ, используемых в системах контролируемой доставки, можно выделить несколько групп по их определенному действию на рану: антимикробное, противовоспалительное, стимулирующее, высушивающее (гипертонические растворы). Активные вещества, применяемые в фазе воспаления, должны оказывать антимикробный, дегидратирующий и некролитический эффекты. Препараты, используемые в фазах регенерации и реорганизации рубца с эпителизацией, должны обладать иными свойствами: стимулировать регенеративные процессы, способствуя росту грануляций и ускорению эпителизации, защищать грануляционную ткань от вторичной инфекции и подавлять рост вегетирующей в ране микрофлоры.
Механизм и особенности деструкции PLGA
Образцы для данного эксперимента получали, как было описано ранее (гл. 2.3.4.4.). TRAP-6 в твердом виде (лиофилизат исходного водного раствора) и в виде водного раствора смешивали в полипропиленовых пробирках (5 мл) с толуолом, ацетоном, метиленхлоридом и смесью метиленхлорид/ацетон (90/10).
Было приготовлено по 2 партии каждого образца для исследования концентрации пептида методом агрегации тромбоцитов и ВЭЖХ. В лиофилизаты, предназначенные для исследования методом ВЭЖХ добавляли 1 мл буфера HEPES (рН 7,5), а в образцы для исследования методом агрегации тромбоцитов - 1 мл буфера PBS (рН 7,2).
Наблюдение морфологии поверхности и скорости деструкции микрочастиц, полученных, как было описано ранее (см. главу Экспериментальная часть, п/п 2.3.4.1.), проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа (JEOL-840M, A Technics, Со, Ltd, Tokyo). Микрочастицы закрепляли на металлических пластинах и металлизировали напылением двойного Au-Pd слоя на установке SCP-20 (Sputtering Balzer).
Кинетику выхода пептидов и их адсорбцию/десорбцию с/на поверхности микрочастиц изучали с помощью хроматографа Beckman «System Gold», оснащенной градиентным насосом 126, UV детектором 166, автосамплером (Hitachi/Merck: L7200) и программным обеспечением «Beckman Gold». Исследование пептидов проводили в обращено-фазовом режиме на колонке С18 длиной 125 мм, диаметром 4 мм (Lichrosphere 100, Merck) Хроматографические измерения проводили при фиксированной длине волны 210 нм и постоянной скорости элюирования 0,75 мл/мин с использованием градиента бинарной смеси следующих растворителей: А (вода - 0,1% трифторуксусная кислота (TFA)) и В (ацетонитрил - 0,1% TFA). Объем пробы -20 мкл. Получение образцов для исследования описано в разделе Материалы и методы, подразделе 2.3.4.2.
Биологическую активность пептидов in vitro изучали методом агрегации тромбоцитов с помощью счетчика и анализатора размеров частиц Coulter Multisizer II (Beckman) в изотоническом растворе (Isoton II) в режиме Narrow (область анализа 1,3-7 мкм). Калибровку прибора предварительно проводили с помощью стандартного набора латексных частиц (Coulter СС Size standards Kit Latex PN 6601329). Фиксированное время счета тромбоцитов - 25 сек, а число тромбоцитов - как минимум 70000/счет. Данные счетчика переносили на компьютер и обрабатывали в программе Ехеї для определения числового и объемного распределения частиц.
Получение обрацов для исследования методом агрегации тромбоцитов описано в главе Экспериментальная часть, п/п 2.3.4.(3-5).
Для каждого эксперимента пробирки с человеческой кровью, стабилизированной цитратом Na, использовали в день взятия крови у донора. Не позднее, чем через час после получения пробирки с кровью выделяли фракцию ОТП на центрифуге Beckman (600 об/мин; 25С). В процессе эксперимента выделенную фракцию ОТП сохраняли в стеклянной пробирке объемом 5 мл при 37С. Активация тромбоцитов достигалась смешиванием 15 мкл раствора пептида в PBS буфере (рН 7,2) и 45 мкл ОТП. Полученную суспензию инкубировали в течение 15 мин на термостатируемой качалке SW 20С (Julabo) (37С, 37 об/мин). Поскольку тромбоциты имеют тенденцию к осаждению, фракцию ОТП готогенизировали троекратным переворачиванием. Затем 30 мкл суспензии перемещали в пробирку типа Falcon (50 мл), содержащую 25 мл изотонического раствора (Isoton II ) для исследования степени агрегации тромбоцитов. Каждое измерение повторяли трижды.
Эксперименты по заживлению ран проводили на 12 мышах-самках линии (C57Bl/6/CBA)Fi. Животным (п=4) под нембуталовым наркозом непосредственно после операции апплицировали на рану (1x1 см2) микрочастицы с пептидами и контрольные микрочастицы. У мышей контрольных групп рану или покрывали контрольными микрочастицами (п=4) или оставляли открытой (п=4). После операции животных помещали в отдельные клетки. Динамику заживления ран анализировали на 3-й и 7-е сутки после ранения с помощью светового микроскопа. Для проведения гистологических исследований использовали образцы грануляционной ткани из области раны. Экспресс-диагностику процесса заживления проводили по анализу отпечатков. Отпечатки фиксировали метиловым спиртом, высушивали и окрашивали азур-эозином по Гимзе [57]. Кроме отпечатков, готовили срезы грануляционной ткани, которые фиксировали смесью спирта, формалина и уксусной кислоты, после чего окрашивали гематоксилином и эозином согласно общепринятому методу. Интенсивность репаративного процесса оценивали по количеству макрофагов (маркер воспаления) и фибробластов (маркер пролиферации). Площадь ран определяли непосредственно после ранения, на 3 и и на 7-е сутки заживления. Для проведения гистологических исследований использовали образцы грануляционной ткани из области раны. Экспресс-диагностику процесса заживления проводили по анализу отпечатков. Достоверность различий показателей между сравниваемыми группами оценивали по t-критерию Стьюдента (р 0,05).
Исследование морфологии поверхности PLGA микрочастиц
Концентрацию TRAP-6 после взаимодействия в виде водного раствора с толуолом и смесыо метиленхлорид/ацетон (90/10 % масс.) определяли методами ВЭЖХ и агрегации тромбоцитов (см. таблицу 8). Толуол был выбран по результатам предыдущего эксперимента, поскольку снижает биологическую активность TRAP-6 как в твердом виде, так и в виде водного раствора. Смесь метиленхлорид/ацетон, как было показано ранее, может способствовать снижению межфазного натяжения между водой и органическим растворителем [148 Ghaderi, 1997].
Подобную адсорбцию коротких амфифильных пептидов на поверхности стеклянной пробирки могут определять электростатические взаимодействия. При рН 7,5 положительно заряженные группы молекул TRAP-6 (pi 11,05) в некоторой степени взаимодействуют с поверхностью SiC 2, несущей слабый отрицательный заряд.
Вместе с тем, очевидно, что, при контакте водного раствора TRAP-6 с органическими растворителями, помимо адсорбции, происходит существенное снижение его биологической активности, поскольку концентрации пептида в образцах, определенные методом агрегации тромбоцитов, существенно ниже концентраций, определенных ВЭЖХ. В данном случае, взаимосвязь изменения конформации молекул пептидов и снижения их биологической активности нуждается в дополнительном исследовании, например, методом кругового дихроизма.
Известно, что на границе раздела фаз вода/органический растворитель, образующаяся в процессе микрокапсулирования, может снижаться биологическую активность белков за счет изменения их конформации [149, 150]. Было показано, что снижение биологической активности белков происходит именно в процессе формирования первичной эмульсии [151]. Ранее также упоминалось, что молекулы белков в органических растворителях становятся менее гибкими, чем в смесях воды и органических растворителей, что позволяет предотвратить изменение вторичной структуры белка [152]. Однако проблема снижения биологической активности коротких пептидов в данных условиях мало изучена. Хотя пептиды обычно менее подвержены влиянию органических растворителей, тем не менее, несколько исследований показали изменение конформации, растворимости и биоактивности пептидов при взаимодействии с органическими растворителями [153]. Так, для коротких пептидов (менее 10 аминокислотных остатков), в случае существования динамического равновесия между несколькими конформациями нельзя исключить необратимые изменения коформации пептидов при их взаимодействии с растворителями. В частности, ранее была показана возможность необратимых изменений конформации различных производных энкефалина при взаимодействии с органическими растворителями [154]. Таким образом, можно заключить, что при диспергировании TRAP-6 в виде водного раствора в большинстве растворителей имела место незначительная адсорбция пептида к поверхности стекла, в то же время наблюдали довольно значительное снижение биологической активности пептида в условиях определения последней методом агрегации тромбоцитов. Поскольку было установлено, что биологическая активность пептида снижается при взаимодействии TRAP-6 в виде раствора с органическими растворителями, а также имеет место его адсорбция при использовании стеклянных пробирок, было решено изучить поведение пептида при взаимодействии с растворителями в полипропиленовых пробирках. Было показано, что контакт пептида в виде водного раствора с ацетоном и смесью метиленхлорид/ацетон приводил к увеличению адсорбции пептида на поверхности полипропиленовой пробирки. В остальных образцах адсорбция пептида не зависела от его физического состояния (рис. 32). Контакт пептида со всеми растворителями в виде водного раствора приводил к снижению биологической активности TRAP-6 в полипропиленовых пробирках. Необходимо отметить, что метод агрегации тромбоцитов может рассматриваться как оценочный метод из-за его низкой точности. Разница между результатами экспериментов может быть обусловлена различной чувствительностью к TRAP-6 образцов плазмы крови, полученных от различных доноров. Тем не менее, очевидно, что диспергирование TRAP-6 в твердом виде в большинстве органических растворителей позволяет существенно уменьшить адсорбцию пептида к поверхности лабораторной посуды и, таким образом, уменьшить потери пептида в процессе микрокапсулирования. TRAP-6 в твердом виде непосредственно в органическом растворителе для получения микрочастиц. Как показано ранее, растворение TRAP-6 в твердом виде в органическом растворителе (без его предварительного растворения в воде), позволяет избежать снижения его биологической активности. С учетом ранее полученных результатов, было предложено заменить метод двойной эмульсии методом простой эмульсии. Капсулирование проводили в стеклянной пробирке с использованием в качестве растворителей этилацетата либо смеси метиленхлорид/ацетон (90/10% масс.) (см. главу Экспериментальная часть, п/п 2.3.2.). Ранозаживляющие свойства пептидов, инкапсулированных методами В/М и Bi/M/B2, исследовали в моделях кожных резаных ран (мыши) и язвы желудка (крысы). Для исследования ранозаживляющих эффектов инкапсулированных пептидов были проведены эксперименты in vivo, в частности в моделях на мышах (кожные резаные раны) и на крысах (модель ацетатной язва желудка). Все эксперименты были выполнены совместно с группой проф.С.М.Струковой (Кафедра физиологии человека и животных Биофака МГУ). Степень заживления ран определяли: по изменению площади раны; с помощью гистологического анализа срезов образцов грануляционной ткани, взятой в области раны/язвы на 3 и 7 сутки после ранения. Как упоминалось ранее (см. главу Обзор литературы, п/п 1.1.) процесс репарации тканей и, в частности, заживления ран, включает три фазы: воспаление, пролиферацию, и реорганизацию рубца. Фаза воспаления, которая обычно длится около трех дней, характеризуется присутствием большого количества макрофагов и других клеток в зоне раны, принимающих участие в остром адаптивном ответе организма. Для фазы пролиферации характерно резкое увеличение количества пролиферирующих фибробластов, продуцирующих коллаген и другие структурные компоненты, участвующие в процессе репарации ткани, а также образование сосудов (ангиогенез). Фибробласты можно наблюдать в ране уже на 3-ий день после ранения; однако, на 7-ой день их количество достигает максимального значения.
Исследование адсорбции/десорбции пептидов на/с поверхности PLGA микрочастиц
Эксперименты по заживлению язвы проводили на 25 самцах беспородных крыс. Животным под эфирным наркозом апплицировали ледяную уксусную кислоту на серозную оболочку желудка (1x1 см ). Через 2 часа после операции опытным животным в желудок через зонд вводили микрочастицы, содержащие TRAP-6, в 0,5% растворе альгината Na. Контрольным животным 1-ой группы вводили физиологический раствор, а 2-ой группе - частицы без пептида. Образцы ткани желудка в области язвы, взятые на 3 и 7 сутки опыта, исследовали морфометрическим анализом.
Картина эксудативного слоя язвы желудка у опытных животных на 3 сутки существенно отличалась от контрольных групп. У животных контрольных групп среди клеточных элементов преобладали нейтрофилы (более 70%) и макрофаги, процентное содержание которых составило у 1-й контрольной группы животных (введение физиологического раствора) - 24,9%, а у 2-й (введение частиц без пептида) - 23%. На фоне массивной инфильтрации нейтрофилов и моноцитов/макрофагов, отека, неравномерного полнокровия сосудов, в обеих контрольных группах были выявлены единичные фибробласты (рис. 36 (А)). Достоверных различий показателей клеточного состава подслизистого слоя желудка в этих контрольных группах выявлено не было.
Вместе с тем у животных опытной группы, которым вводили микрочастицы с TRAP-6, уже на 3-й сутки заживления воспалительная реакция и отек были менее выражены по сравнению с контрольными животными. Мы наблюдали существенное увеличение (по сравнению с обоими контролями) клеток с типичными признаками фибробластической дифференцировки, что может свидетельствовать об ускоренном созревании предшественников фибробластов, мигрирующих в раневую зону (рис. 36 (Б)). Известно, что нейтрофилы являются маркерами воспаления, а фибробласты - маркерами пролиферации. В опытной группе содержание нейтрофилов было в 5-6 раз ниже, а макрофагов в 3 раза выше, чем в контрольных. Процентное содержание фибробластов составило 23,9%, что было более чем в 10 раз выше по сравнению с контрольными группами (рис. 36 (В)). Таким образом, у животных, получавших микрочастицы с TRAP-6, отмечено ускорение ранней фазы заживления вследствие усиленной концентрации фибробластов в область регенерации и их пролиферации.
На 7-й день картины восстановительного процесса в подслизистом слое желудка у крыс опытной и контрольных групп также различаются. Так, в грануляционной ткани опытных животных преобладают четко ориентированные фибробластические элементы, около которых выявляется рыхлая сеть межклеточного матрикса. Кроме того, наблюдали обогащение зоны язвы (по сравнению с контролем) оформленными тонкостенными капиллярами. В опытной группе мы отмечали статистически достоверное (по сравнению с контрольными группами) снижение количества макрофагов ( 20%) и увеличение количества фибробластов ( 10%) (рис. 37). Из рисунка 38 следует, что TRAP-6(M), инкапсулированный в PLGA микрочастицы, также ускоряет заживление ран. У животных контрольной группы на 3 день язвообразования среди клеточных элементов преобладали нейтрофилы (-70%) и макрофаги (-25%), а у животных опытной группы 104 макрофаги (-35%) и фибробласты (-55%). На 7 день заживления в опытной группе (микрочастицы с TRAP-6(M)) количество макрофагов уменьшилось, а фибробластов увеличилось. Таким образом, полученные данные исследования клеточного состава подслизистого слоя желудка крыс свидетельствуют о том, что использование микрочастиц с TRAP-6 и TRAP-6(M) на модели экспериментальной язвы активирует миграцию и пролиферацию фибробластов и клеток эндотелия. При этом происходило сокращение фазы воспаления и сдвиг фазы пролиферации на более ранние сроки, что приводило к ускорению процесса заживления экспериментальных язв желудка у крыс. Мы полагаем, что на основе инкапсулированных пептидов могут быть созданы новые эффективные препараты с контролируемым выходом пептидов для терапии наружных и внутренних ран. 1. Синтезирован новый пептид TRAP-6(M) и изучена его биологическая активность методом агрегации тромбоцитов. Показано, что замещение одной аминокислоты в агонисте тромбинового рецептора TRAP-6 (agonist PAR-1) позволяет сохранить способностью TRAP-6 (М) активировать рецептор PAR-1. 2. Разработаны и оптимизированы методы (двойной и простой эмульсии) инкапсулирования TRAP-6 и TRAP-6(M) в биодеградируемые биосовместимые PLGA микрочастицы. 3. Исследованы некоторые физико-химические свойства микрочастиц с инкапсулированными пептидами (в частности, распределение их по размерам, морфология поверхности и скорость деструкции in vitro). 4. Исследована кинетика выхода пептидов из микрочастиц. Показано, что параллельно с выходом пептидов происходят процессы адсорбции/десорбции на/с поверхности PLGA микрочастиц, причем характер этой адсорбции зависит от типа пептида. 5. Впервые продемонстрирован положительный эффект TRAP-6(M) на процесс репарации тканей. 6. Показано, что инкапсулированные пептиды TRAP-6 и TRAP-6(M) ускоряют заживление кожных резаных ран и язвы желудка в моделях на мышах и крысах.
