Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Современные представления о структурно-функциональных свойствах сывороточного альбумина 11
1.1.1 Структура и физико-химические свойства молекулы альбумина 11
1.1.2 Центры связывания лигандов в молекуле альбумина 17
1.2 Изменение структуры центров и связывающая функция аль бумина при действии продуктов метаболизма 20
1.2.1 Влияние лигандов на конформацию сывороточного альбумина. Транспорт жирных кислот. 20
1.2.2 Антиокислителъные свойства сывороточного альбумина 24
1.2.3 Сывороточный альбумин как показатель эндогенной интоксикации 28
1.3 Мембранотропные эндотоксины как показатели эндогенной интоксикации 31
1.4 Циркулирующие иммунные комплексы как показатель состояния иммунной системы 38
1.5. Характеристика/ меры профилактики и лечения неспецифической диареи новорожденных телят 43
Глава 2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Объект исследования 54
2.2. Материал исследования 55
2.3. Методы исследования 56
2.4. Методы статистической обработки результатов 66
Глава 3 Изменение свойств сывороточного альбумина в коррекции биохимических механизмов эндогенной интоксикации 68
3.1 Особенности системы сывороточного альбумина крови телят ... 68
3.2 Уровень свободнорадикального окисления и антиоксидант-ной активности, их взаимосвязь со связывающей способностью альбумина сыворотки крови телят при диарее 81
3.3 Взаимосвязь уровня молекул средней массы и связывающей способности сывороточного альбумина 93
3.4 Изменение уровня циркулирующих иммунных комплексов и связывающей способностью альбумина у телят при диарее 98
Глава 4. Влияние содержания продуктов эндотоксикоза в сыворотке крови, молозиве, молоке коров на жизнеспособность и продолжительность болезни их телят 102
4.1. Уровень продуктов эндотоксикоза в сыворотке крови и связывающая способность альбумина молока коров 102
4.2. Взаимосвязь структурно-функциональных свойств альбумина крови телят и их коров матерей 111
Глава 5. Эффективность применения сывороточного альбумина в лечении и профилактике неспецифической диареи новорожденных телят 115
Заключение 122
Выводы 130
Библиографический список 132
- Структура и физико-химические свойства молекулы альбумина
- Мембранотропные эндотоксины как показатели эндогенной интоксикации
- Особенности системы сывороточного альбумина крови телят
- Уровень продуктов эндотоксикоза в сыворотке крови и связывающая способность альбумина молока коров
Введение к работе
Актуальность исследования. Б современной биологии параллельно с геномными исследованиями принципиальное значение приобретает изучение протеома, как системы белков, прежде всего индивидуальных протеинов.
Альбумины - одна из основных белковых фракций крови. Концентрация альбумина в плазме и сыворотке выше, чем концентрация других белков. Альбумин вносит основной вклад во внутрисосудистое коллоидно-осмотическое давление. Кроме того, он является молекулой-переносчиком биологически важных веществ (Сорокина Д.А., 1990; Доржийн Н., 1993; Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., 1994, 1998; Титов Б.Н., 1999). Б связи с этим альбумин, выступая детоксикантом, является регулятором гомеостаза на стадии транспорта биологически активных низко- и среднемолекулярных субстанций (лигандов) кровью. Он транспортирует эндогенные физиологически активные вещества (гормоны, витамины, жирные кислоты, билирубин, лекарственные препараты и др.), а также эндогенные соединения патогенного характера (эндотоксины) (Бравер-Чернобыльская Б.С, 1993; Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., 1994, 1998; Лопухин Ю.М. и др., 2000; Родо-ман Г.Б. и др., 1999). К последним можно отнести циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), молекулы средней массы (МСМ), продукты пе-рекисного окисления, яды.
Связывающая функция сывороточного альбумина обусловлена особенностями строения этого белка, включающими элементы распознавания, структурной адаптации и обратимой фиксации соединений (Доржийн Н., 1993; Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., 1994,1998).
Нарушение конформации молекулы альбумина, вызванное необратимым связыванием ее с мембранотропными эндотоксинами, перекисное повреждение белка или его гликилирование, приводят к снижению или полному выпадению его функций.
Накопление в русле «загруженного» эндогенного альбумина препятствует выходу токсинов и усугубляет эндогенную интоксикацию.
Для исследования связывающей способности альбумина используются специальные молекулы - флуоресцентные зонды (Добрецов Г.Е., Грызунов Ю.А., 1994). Они занимают в альбумине те места, которые предназначены для связывания метаболитов, и их флуоресценция в результате связывания возрастает в сотни раз. Зонды позволяют легко обнаружить нарушение связывающей способности альбумина. Однако, до последнего времени подобные анализы не стали достоянием ветеринарной клиники. По той же причине исследовательские работы в области патологии транспортной функции альбумина были лишь эпизодическими.
Расстройства пищеварения у новорожденных животных с симптомо-комплексом диареи выделены в самостоятельное заболевание - неспецифическая диарея (dyspepsia neonatorum). Часто в результате технологического стресса болезнь охватывает до 90 % поголовья молодняка неонаталь-ного возраста (Жирков И.Н., 2001). Изучение этиологии и течения данного заболевания переходит на новый - молекулярный уровень (Жирков И.Н., 1998-2001; Фазуллин Х.Б., Чуличкова Т.Б., 2003; Батманов М.А., Терентьева Н.Ю., 2003). Сравнительно недавно появились работы, посвященные изучению свободнорадикальных процессов и активности антиоксидантов в патогенезе незаразных и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных (Томчук Б.А., Мельничук Д.А., 2003; Шахов А.Г., 2004; Жаркой БЛ., Рецкий М.И., 2004; Степанова И.П., 2004, 2005), их коррекции путем применения антиоксидантов (Томчук В.А., Мельничук Д.А., 2003; Каверин Н.Н., Дегтярев Д.В., 2004). Подобные исследования часто разобщены и не дают полной картины. Не заслуженно малое внимание уделяется сывороточному альбумину и его роли в реализации детоксикации организма животного.
Таким образом, изучение связывающей способности СА при диарее, а также динамики изменения уровня мембранотропных эндотоксинов, ха-
7 рактер их влияния на детоксицирующуго функцию СА представляет значительный интерес, как для фундаментальной пауки, так и для практической ветеринарии.
Цель и задачи исследования. Цель исследования - изучить изменение структурно-фушщионалъных свойств сывороточного альбумина под влиянием эндогенной интоксикации, вызванной нарушением обмена веществ при неспецифической диарее у телят.
Задачи исследования:
Изучить связывающую способность сывороточного альбумина, уровень его окислительно модифицированных и гликозилированных форм в сыворотке крови телят в норме и при диарее;
Исследовать уровень мембранотропных эндотоксинов в сыворотке крови телят и их коров-матерей;
Определить взаимосвязь между связывающей, транспортной способностью сывороточного альбумина и содержанием мембранотропных эндотоксинов в сыворотке крови телят и их коров-матерей;
Исследовать эффективность применения экзогенного сывороточного альбумина в лечении и профилактике неспецифической диареи новорожденных телят.
Научная новизна. Впервые исследована связывающая способность альбумина молока, молозива и сыворотки крови коров. Определена связывающая способность альбумина сыворотки крови здоровых телят и телят, больных диареей. Выявлены корреляционные зависимости между накоплением эндотоксинов (продукты свободнорадикального окисления, молекулы средней массы, циркулирующие иммунные комплексы) и альбуминовыми показателями в сыворотке крови телят при диарее, в зависимости от длительности и тяжести заболевания. Использование такой комплексной оценки состояния системы интоксикации/детоксикации на молекулярном уровне позволяет использовать данные показатели как в диагностике заболевания (при оценке степени нарушения биохимических процессов в орга-
8 низме), так и при построении прогнозов исхода болезни.
Научно-практическая ценность. Выявлено, что исследуемые интегральные показатели эндотоксикоза являются критериями объективной оценки состояния телят, больных диареей, в острую фазу заболевания и способны отражать тяжесть патологического процесса.
Снижение под влиянием эндотоксинов связывающей способности альбумина и увеличение индекса токсичности по альбумину зависит от концентрации эндотоксинов в сыворотке крови больных диареей телят связанной с тяжестью заболевания. Показана связь между отдельными эндотоксинами и резервом связывающей способности альбумина.
Предложена краткая схема получения сывороточного альбумина с повышенными детоксицирующими возможностями из крови убойных животных крупного рогатого скота. Использование экзогенного альбумина в смеси с солями позволяет рекомендовать его для лечения и профилактики диареи у телят.
Результаты настоящего исследования позволяют обосновать некоторые аспекты действия сывороточного альбумина, а также расширяют и углубляют представления о механизме действия данного препарата при диарее телят. Таким образом, использование сывороточного альбумина в качестве детоксицирующего препарата позволяет значительно усовершенствовать терапию этого заболевания.
Полученные в данной работе результаты позволили использовать сывороточный альбумин с повышенными детоксицирующими свойствами в терапии диареи телят в ОПХ «Ялта» (г. Саранск, Республика Мордовия). Полученные данные внедрены в учебный процесс на кафедре незаразных болезней и радиологии, на кафедре биохимии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (г. Саранск).
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Оценка показателей бычьего сывороточного альбумина (ОКА, ЭКА, РСА и ИТ) с помощью флуоресцентного метода с зондом К-35, уровня
9 мембранотропных эндотоксинов (СРО, МСМ, ЦИК), продуктов окислительной модификации и гликозилированных форм альбумина в сыворотке крови телят с симптомокомплексом диареи, а также в сыворотке крови, молозиве и молоке коров-матерей носит диагностический и прогаостический характер.
2. Степень влияния эндотоксинов на связывающую способность сыво
роточного альбумина (по показателям ЭКА и РСА) определяется их
концентрацией в сыворотке крови, а также зависит от выраженности
, (глубины) процесса эндогенной интоксикации у телят при диарее. Модификация структурно-функциональных свойств альбумина является одной из причин развития эндогенной интоксикации.
3. Использование экзогенного сывороточного альбумина в качестве не
специфического детоксиканта позволяет компенсировать биохимиче
ские расстройства в системе детоксикационной защиты организма,
тем самым, способствуя снижению в кровяном русле эндогенных ток
синов (продукты пероксидации, циркулирующие иммунные ком
плексы, молекулы средней массы).
Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на VII, VIII Пущинской школе конференции Молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, 2003-2004), в материалах Международной научно-технической конференции «Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство» (г. Воронеж, 2003), в материалах Международной конференции «Инновации 2004» (г. Саранск, 2004). В федеральный институт промышленной собственности поданы заявки № 2005107397/15 «Способ получения ветеринарного альбумина» приоритет от 16.03.2005, № 2005104319/13(005621) «Способ лечения и профилактики токсической формы диспепсии новорожденных телят» приоритет от 17.02.2005.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах
10 машинописного текста, документирована 20 таблицами и иллюстрирована 21 рисунком. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения собственных результатов (главы 3-5), заключения, выводов и библиографического списка, включающего 275 источников, в том числе 228 отечественных.
Структура и физико-химические свойства молекулы альбумина
Сыворотка крови представляет собой сложную многокомпонентную систему, в состав которой входит большое число неорганических и органических соединений. Среди последних особое место занимают белки, благодаря которым кровь является специализированной тканью, где происходит интеграция обменных процессов организма.
Из сыворотки крови выделены и охарактеризованы около 50 белков, общее содержание которых в норме от 57 до 80 г/л. Одним из основных белков сыворотки крови является альбумин. На его долю приходится около 47-63% всех белков, т.е. его концентрация равна 35-50 г/л (5-710-4 М) (Дор-жийн Н., 1993; Сорокина Д.А., 1990).
Сывороточный альбумин синтезируется главным образом в клетках печени в виде предшественника - альбуминопо до бно го белка. Скорость синтеза альбумина составляет около 14,5-21,,0 г в сутки (Сорокина Д.А., 1990; Доржийн Н,, 1993). Около 75% всего альбумина находится в экстраваскуля-торном пространстве в составе интерстициальной жидкости, лимфы, спи-но-мозговой жидкости и т.д. Время полураспада для сывороточного альбумина составляет около 19 дней. Катаболизм альбумина происходит непосредственно в циркуляторном русле, но его механизм, причины и физиологический смысл выяснены довольно мало.
Все основные свойства белковой молекулы зависят от ее первичной структуры. В настоящее время расшифровка первичной структуры бычьего сывороточного альбумина (БСА) полностью завершена (Brown I.R., 1975; Foster J.F., 1993; Bertini I et al., 2001). Необходимо отметить, что структуры человеческого (ЧСА) и бычьего сывороточного альбумина достаточно схожей друг с другом, отличаясь лишь в некоторых незначительных деталях положениями отдельных аминокислот: БСА имеет два триптофановых остатка в положениях 134 и 212, а ЧСА один - в положении 214 (Koch-Wester S., Sellers Е.М., 1986). Молекулярные веса бычьего и человеческого сывороточных альбуминов, определенные различными физико-химическими методами, равны 66700 и 69000, соответственно. Изоэлектрическая точка альбуминов ниже, чем у большинства белков плазмы и располагается между 4,3 и 4,8. При рН 7,4 чистый заряд равен - 18, Б нейтральной или слегка щелочной среде заряд альбумина высок (белок характеризуется значительной электрофоретической подвижностью и растворимостью).
Б составе бычьего сывороточного альбумина (как и человеческого) наблюдается высокое содержание заряженных аминокислот; лизин, аргинин, аспарагиновая, глутаминовая кислоты. Высокое содержание цистеина обеспечивает высокую стабильность альбумина. Почти все полуцистиновые остатки в составе этих белков находятся в окисленном состоянии, обеспечивая образование многочисленных поперечных дисульфидных связей (17 дисульфидных мостиков) в молекулах. Единственный полуцистиновый остаток сохраняет присущую ему активность (в виде SH-группы) лишь в некоторых молекулах нативных альбуминов. Этим обстоятельством объясняется тот факт, что даже после перекристализации альбумина число активных SH-групп в расчете на молекулу белка оказывается меньше единицы (0,5-0,7) (Уверский В.Н., Нарижнева Н.Б., 1998).
Свободная SH-группа цистеина обуславливает образование сывороточным альбумином (СА) молекулярных полимеров посредством тиол-дисульфидного обмена: Альбг Первичная структура сывороточного альбумина представлена одиночной полипептидной цепью, которая является одной из самых длинных белковых цепей, с установленной аминокислотной последовательностью. Общее количество аминокислот у ЧСА - 585, у БСА - 582 (рис. 1.1.1.) (Brown I.R., 1985; Andersson L.O., 1990). Содержание спиральных участков вторичной структуры СА (а - спи 14 раль; р - структура) составляет примерно половину ее длины. Доля а - спиралей в БСА составляет 47%, содержание р - структуры мало и составляет в среднем 10 - 15%. Локализация упорядоченных участков по длине полипептидной цепи СА малоизвестна (Доржийн Н., 1993). Элементы вторичной структуры сохраняются в индивидуальных фрагментах и не разрушаются в процессе расщепления и выделения (Бори-сенко С.Н., 1990; Доржийн Н., 1993; Иванов А.И. и др., 1996; Константине Г.Р. и др., 1998). Однако содержание а-спиралей может увеличиваться или уменьшаться в различных органических растворителях и при тепловой денатурации белка (Багдасарьян С.Н. и др., 1979; Бат-Эрдэнэ О., 1984). Б последнее время наиболее распространена модель трехмерной структуры альбумина (Джафаров Э.С., 1990; Сорокина Д.А., 1990; Доржийн Н., 1993; Poster J.P., 1993; Bertini I. et al., 2001). В этой модели единственная полипептидная цепь альбумина представлена как серия двойных петель. При этом формируется 9 больших и малых двойных петель, образуя структурную единицу из одной малой и двух больших двойных петель. Петли располагаются в линейном порядке. При такой конфигурации большие и малые двойные петли образуют LSL - LSL - LSL повторяющуюся последовательность, где L - большая, S - маленькая петля. Таким образом, молекула БСА разделена на три очень похожие повторяющиеся единицы. Каждая состоит из большой двойной петли, короткого связывающего сегмента, маленькой двойной петли, короткого связывающего сегмента, еще одной большой двойной петли и сегмента, связывающего эту единицу со следующей повторяющейся единицей. Эти три единицы полипептидной цепи плотно свернуты и образуют индивидуальные глобулы - домены. Девять областей двойных больших и малых петель, составляющие домены, называют субдоменами (рис. 1.1.2.) (Сорокина Д.А., 1990).
Мембранотропные эндотоксины как показатели эндогенной интоксикации
В настоящее время интоксикацию организма рассматривают как один их наиболее важных критериев, определяющих тяжесть состояния организма и необходимость назначения различных видов детоксикационнои терапии и профилактических мер.
Эндогенная интоксикация (ЭИ) является неспецифическим синдромом, характерным для многих заболеваний (Аршавский И.А., 1976; Уман-ский М.А., Пинчук Б.Г., 1979; Чаленко В.В., Кутушев Ф.Х., 1989; Первушин Ю.В., 1992; Ерохин Н.А. и др., 1993; Симбирцев С.А., Беляков Н.А., 1994; Малахова М.Я., 1995; Киселева Р.Е. и др., 2001, 2002, 2004). Прогноз течения заболевания, выбор способа дезинтоксикационной терапии и других видов лечения невозможны без объективной оценки степени эндотоксикоза.
Лабораторная диагностика интоксикации организма основана на определении ряда продуктов эндотоксикоза - токсинов, вызывающих генера 32 лизацию патологического процесса. Повышение концентрации билирубина, мочевины и других соединений в плазме крови характеризует начальную фазу эндотоксикоза только при локализации первичного патологического очага воспаления. Универсальными показателями эндогенной интоксикации можно считать уровень активности про-/анти-оксидантной системы (свободиорадикального окисления (СРО), антиокислителъиой активности (АОА)), молекул средней массы (МСМ) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) (Уманский М.А., Пинчук В.Г., 1979; Малахова М.Я., 1995; Киселева Р.Е. и др., 2002, 2004).
Переход к новому типу дыхания и питания новорожденного организма приводит к усилению свободиорадикального перекисного окисления липидов в организме животного. Высокий уровень пероксидации обуславливает инактивацию большей части биоантиокислителей, уменьшение их защитного действия, окончание латентного периода воспаления, накопление активных продуктов СРО и их взаимодействие с белками Кармолиев Р.Х., 2002).
Особое значение для оценки гомеостаза организма животных имеет свободнорадикальное перекисное окисление липидов, что обусловлено решающей ролью биомембран в обеспечении жизнедеятельности живых существ. Важное место в структуре биомембран занимают липиды с высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот (Dirks R.C. et al., 1982; Кожевников Ю.Н., 1985; Журавлев А.И., Пантюшенко В.Т., 1989; Владимиров Ю.А. и др., 1992; Кармолиев Р.Х., 1997, 2000,2002).
Неферментативное свободнорадикальное окисление липидов в нерегулируемых условиях носит цепной, автокаталический характер, причем разветвленные радикальные реакции сопровождаются образованием разнообразных по реакционной способности соединений, участвующих в дальнейших превращениях. Субстратами этих реакций служат аминокислоты, белки, углеводы, нуклеиновые кислоты и липиды. Для организма животных жизненно важное значение имеют свободнорадикальные реакции, повреждающие лтатидный компонент липопротеидов в составе мембран клеток и субклеточных структур (особенно фосфолипидов), что приводит к различным видам нарушений (уменьшение проницаемости мембранных структур клеток, изменение клеточного электропотенциала и нарушение ферментативных функций) и гибели клеток (Кармолиев Р.Х., 1997,2002).
В качестве наиболее реактивных факторов, инициирующих свободно-радикальное окисление, выступают активные формы кислорода: суперок-СИДБЫЙ (О;), гидроперекисный (НО:;) и гидроксидный (ОН") радикалы, перекись водорода (Н2О2"), синглетная форма кислорода О . Основные механизмы образования активных форм кислорода в организме животных связаны с нарушением функционирования электронно-транспортных цепей митохондрий, микросом, а также свойствами дегидрогеназ.
Образованием АФК обычно сопровождается инактивация ксенобиотиков, усиливающая повреждающий эффект последних (Осипов А.Н. и др., 1990; Пескин А.Б., 1997). Активные формы кислорода выполняют важную роль в защитных механизмах неспецифического иммунитета организма животных. Вследствие взаимодействия природных частиц (опсонизирован-ных бактерий, механических частиц, латекса) с поверхностью фагоцитов происходит перестройка метаболизма клеток (увеличение ионной проницаемости клеточных мембран, усиление окисления глюкозы, возрастание более чем в 10 раз потребления кислорода, сопровождающееся интенсивным образованием супероксида О") и выделяются биоцидные кислородные радикалы, например при инфекционных и других воспалительных процессах. Это явление называется «дыхательным взрывом».
Именно генерализацией супероксидного радикала обеспечивается не только микробоцидное и цитотоксическое, но и в немалой степени имму-норегуляторное действие активированных фагоцитов (Жаркой Б.Л., Рец-кий М.И., 2004). Процесс активации фагоцитов сначала приводит к образованию О , а затем и более сильных окислителей — ОН", НОСГ, которые могут вызывать модификацию тканевых и сывороточных белков и липи 34 дов.
Действие внешних прооксидантов, повышенное потребление кислорода, ионизирующее и ультрафиолетовое облучение, загрязнение воздуха, воды и продуктов питания, недостаток естественных антиоксидантов (витамины Е, К, А, селен и др.), врожденная недостаточность ферментов антиоксидантной защиты и другие факторы могут приводить к напряжению системы антиоксидантной защиты организма и вызывать так называемый «оксидативный стресс», проявляющийся на молекулярном, клеточном и организменном уровнях (Гуляева Н.В., 1989; Барабой В.А. и др., 1992; Storey К.В., 1996; Wong H.R., Wispe J.R., 1997; Лысенко Н.И., 2000; Зен-ков Н.К., 2001; Robles R. Et al., 2001). Подобный стресс, видимо, является патогенетическим при развитии воспалительных и бронхолегочных заболеваний (Аматуни В.Г., Карагезян К.Г., 1988; Горбунов Н.В. и др., 1992; Архипенко Ю.В., Сазантова ТТ., 1996; Киселева Р.Е, и др., 2002, 2004; GuteridgeJ.C, 1995).
Особенности системы сывороточного альбумина крови телят
На основании данных исследования рационов кормления коров-матерей в ОПХ «Ялта» (г. Саранск,, республика Мордовия) установлено/ что наряду с недостаточным, однообразным кормлением, в нем недостает большого количества таких основных компонентов, как кальций, каротин, низкое содержание витаминов, макро- и микроэлементов, минеральных веществ и углеводов, что явилось причиной заболеваемости и падежа телят в хозяйстве.
Кормление стельных коров в зимний период кормами, бедными витаминами и богатыми кислотами (силос) приводило к неполному усвоению организмом минеральных веществ, связанных с кислотами силоса. Это обуславливает смещение кислотно-щелочного равновесия в сторону ацидоза, понижение щелочного резерва крови и увеличению в ней кетоновых тел, что приводит к заболеванию стельных коров кетозами, а новорожденных телят - к заболеванию токсической диареей (Чернышев А.И., 1989; Фазул-лин Х.Б., Чуличкова Т.В., 2003).
Анализ обстоятельств, предшествующих появлению заболевания, позволяет сделать вывод, что одной из основных причин массового заболевания новорожденных телят диареей явились допущенные погрешности в их выращивании. Поэтому, в кормлении телят важно соблюдать строгий режим в отношении норм и времени кормления, (выпойки). Б данном хозяйстве установлено запаздывание на 3-6, а то и на 10-14 часов с дачей первой порции молозива. Это чаще бывает, когда растелы проходят в ночное время. Кроме того, в хозяйстве зафиксировано выпаивание молозива (молока) от коров, больных маститом. Допускались и другие погрешности в кормлении телят молозивного периода.
Одним из основных белков сыворотки крови является альбумин. Кроме поддержания осмотического давления крови и белкового резерва организма, альбумин обладает способностью связывать и транспортировать различные виды соединений, органической и неорганической природы. Находящийся в сыворотке альбумин способен переносить и депонировать слаборастворимые в крови вещества эндогенного и экзогенного происхождения (Джафаров Э.С., 1990; Коткина Т.И. и др., 1991; Доржийн Н„ 1993; Колышев Б.А., 1993; Иванов А.И. и др., 1996).
Вещества, связывающиеся с альбумином, в основном гидрофобны или амфифилъны (Шимановский Н.Л. 1984; Сорокина Д.А., 1990; Пентюк А.А. и др., 1995; Уверский Б.Н., Нарижнева Н.Б., 1998; Титов Б.Н., 1999).
При различных видах патологии нарушается связывающая способность альбумина (Луйк А.И. и др., 1983; Луйк А.И., Лукъянчук Б.Д., 1984; Миллер Ю.И., 1993; Лопухин Ю.М. и др., 2000), что может быть причиной интоксикации и отравлений, так как альбумин связывает вещества, в свободном виде в больших количествах токсичные для организма. С другой стороны, загруженность альбумина ксенобиотиками или метаболитами дает информацию об эффективности функционирования печени и почек — основных детоксицирующих органов. Следовательно, определение степени нарушения связывающей способности альбумина важно для оценки уровня интоксикации.
Традиционные методы анализа концентрации свободных веществ в сыворотке крови способны обнаружить только часть токсинов, относящихся к классу водорастворимых (билирубин, мочевина и др.). Другая часть, обладающая гидрофобными свойствами, практически полностью находится в связанном состоянии в виде комплексов с транспортными белками (в частности, с альбумином) и липопротеинами низкой плотности. Именно такие токсины как продукты свободнорадикального окисления, протеолиза и деградации белков считаются наиболее токсичными поскольку легко связываются с клеточными мембранами и внутриклеточными белками, модифицируя структуру последних, приводя к изменению мембранной проницаемости и снижению ферментативной активности (Залевская И.Н., Сорокина Д.А., 1986; Гаврилов В.Б. и др., 1999; Жукова Л.И. и др., 1999).
На сегодняшний день можно выделить целый ряд показателей, характеризующих разные стороны процесса развития эндогенной интоксикации организма: с одной стороны это содержание продуктов свободнорадикаль-ного окисления, молекул средней массы, циркулирующих иммунных комплексов, отражающее накопление водорастворимых токсинов в сыворотке крови, с другой - альбуминовые показатели (ОКА и ЭКА, РСА), характеризующие основную систему элиминации гидрофобных токсинов из кровяного русла. Таким образом, величину эндогенной интоксикации следует принять как степень дисбаланса между накоплением токсинов в крови и их детоксикацией, а именно путем сорбции на молекуле сывороточного альбумина.
В задачу данной работы входило определение альбуминовых показателей (ОКА, ЭКА, РСА, ИТ по альбумину), характеризующих систему деток-сикации организма.
Альбуминовые показатели ЭКА и ОКА легко реагируют на различные нарушения функций организма. Особенно чувствительным параметром является ЭКА, вследствие чего часто используют соотношение более чувствительной ЭКА к менее чувствительной ОКА либо как ЭКА/ОКА, либо как ИТ (ОКА/ЭКА)-1. В связи с высокой чувствительностью метода, а также отсутствием литературных данных по изучению ЭКА и ОКА у животных перед нами встала задача определить систематические популяционные данные об изменении величин ЭКА и ОКА в контрольной группе (здоровые) животных.
Концентрацию альбумина - общую и эффективную - определяли флуоресцентным методом (Добрецов Г.Е., Грызунов Ю.А., 1994) со стан 71 дартными наборами реактивов «Зонд-Альбумин» (НИМБЦ «ЗОНД», Москва, Россия) на флуориметре АКЛ-01. Прибор калибровали с помощью флуоресцентных имитаторов состава сыворотки крови человека, устанавливающих нормальные величины ЭКА несколько ниже, чем ОКА. Средние величины ОКА сыворотки крови телят и коров, измеренные флуоресцентным методом, оказались такими же (около 45 т/я), как по известным биохимическим данным (Моин Б.М., 1994; Коплик Е.Б. и др., 2002).
Б таблице 3.1.1. представлены результаты измерений и статистические данные по группе обследованных здоровых животных (телят). Среднее значение ОКА составило 45,93±1,50 г/л, ЭКА - 42,73±1,38 г/л, РСА=93,05±0,64%, а ИТ=0,07±0,008. Близость значений медианы и среднего арифметического для ЭКА, ОКА и РСА свидетельствуют о нормальности распределений этих показателей. Данные значения были приняты нами за норму.
В общей структуре заболеваемости и падежа животных, диарея занимает одно из первых мест (Беротченко М.А., 1975; Жирков И.Н., 1998; Фа-зуллин Х.В., Чуличкова Т.В., 2003; Кондрахин И.П., 2003). Однако, не смотря, на значительные результаты в изучении этиологии и лечения диареи, многие вопросы остаются не выясненными.
Уровень продуктов эндотоксикоза в сыворотке крови и связывающая способность альбумина молока коров
Уровень МСМ также повышает в группах в зависимости от длительности заболевания телят. Количество молекул средней массы, не содержащих ароматические аминокислоты, изменялось в І-ІІІ группах не значительно и превышало контрольный уровень в среднем на 3-18 %. В группе животных, телята которых больны 10-е сутки уровень МСМ254 превышал контроль на 40 %. Уровень МСМ, содержащих ароматические остатки аминокислот (МСМ280) во II и III группах был выше контрольного на 7 и 10 %, соответственно. В III и IV группах отмечалось значительное повышение этого показателя на 67 и 77 % соответственно (рис.4.1.1).
Изменения уровня ЦИК носили сглаженный характер во всех группах животных. Отмечены незначительные колебания этого показателя (на 5-7 %) между группами и повышение относительно контроля на 12-23 % в зависимости от группы животных (рис.4.1.1).
У коров, телята которых больны токсической формой диареи, отмечалось увеличение уровня СРО более, чем в 2 раза, снижение АОА на 47 %. На фоне усиления процессов пероксидации отмечался высокий уровень сред-немолекулярных пептидов. Уровень средних молекул, содержащих ароматические аминокислоты составил 0,56±0,01 усл.ед. (р 0,05), не содержащих ароматические остатки - 0,57±0,004 усл.ед. (р 0,05), что выше контрольного уровня на 87 и 73 % соответственно (рис.4.1.2). 107 вышение уровня СРО в 1,7 раза, снижение уровня антиоксидантной защиты на 33 % по отношению к контрольной группе (животные/ родившие клинически здоровых телят). Уровень среднемолекулярных пептидов превышал контрольный уровень на 37 % соответственно для МСМгво и на 42 % - для МСМ254 (рис. 4.1.2). Количество ЦИК сыворотки крови коров-матерей/ телята которых больны токсической формой диареи составило в среднем 150,7118/20 усл.ед. (р 0,05), простой формой диареи - 131,25±4,60 усл.ед. (р 0,05). Данные величины превысили контрольный уровень на 38 и 20 % соответственно. Нами изучены альбуминовые показатели молозива и молока коров-матерей, у телят которых диагностировались признаки симптомокомплекса диарея. Анализировались молозиво и молоко коров черно-пестрой породы 2-3 отела (п - 35) с аналогичными показателями живой массы и молочной продуктивности, которых содержали в условиях поточно-цеховой системы. Средне годовой удой одной коровы 5300 л. Анализ проводили в осенне-зимний и весенний стойловый периоды. Молозиво, благодаря повышенному содержанию белков, жиров и минеральных веществ, является полноценной высококалорийной пищей для новорожденного теленка. Оно содержит в себе защитные вещества - антитела против возбудителей инфекционных заболеваний. С молозивом в организм новорожденного теленка поступает благоприятная молочно-кислая флора, которая препятствует развитию гнилостной условно-патогенной микрофлоры. Встречались такие факторы, как выпойка загрязненного и холодного молозива. Для въшойки использовалась грязная посуда, резиновые соски с нестандартным отверстием. Выпаивали телят через разные промежутки времени. На основании вышеизложенного видно, что все эти факторы способствуют возникновению диареи новорожденных телят. Чем быстрее с момента рождения напоен теленок, тем лучше, так как бактерицидные свойства молозива после его выдаивания быстро понижаются и через 2-3 часа исчезают. Особенно важной является выпойка телят теплым молоком сразу же после доения, пока оно не остыло. Подогревание молока, а также несоблюдение санитарно- гигиенического режима при доении ведет к его загрязнению. Известно, что при выпаивании телятам загрязненного молозива (молока), как правило, возникает алиментарная форма диареи. С другой стороны, выпойка телят холодным молоком (ниже 35 С) оказывает вредное воздействие на функцию желудочно-кишечного тракта, в частности,, на секреторную функцию сычуга, понижает его кислотность. С понижением кислотности нарушается расщепление молочного сахара до молочной кислоты, вследствие этого в кишечнике размножаются гнилостные микробы, извращается реакция переваривания молозива (молока) (Тарасов И.И., 1987). Гнилостные процессы в кишечнике тормозят заселение его бактериями, которые превращают молочный сахар в молочную кислоту. Результаты бактериологического исследования кишечной микрофлоры больных диареей телят показали преобладание гнилостной грамотри-цательной микрофлоры в 20 и более раз над грамположительной (по данным Денисова В.Г., г. Саранск). Быстрая выпойка молозива приводит к расстройству пищеварения, а, следовательно, и к понижению устойчивости организма. Только при медленном поении телят молоком оно поступает в сычуг и там постепенно створаживается в рыхлый сгусток, легко расщепляется ферментами. При быстром - оно поступает в рубец, где подвергается брожению и создается благоприятная среда для развития микрофлоры. Молоко, поступающее в сычуг, быстро створаживается в неплотный сгусток, который попадает в кишечник, раздражает слизистую оболочку, усиливает перистальтику и вызывает понос с последующим обезвоживанием организма (Садовская Т.А., 2001). Вышеперечисленные факторы, а также нарушение зоогигиены в помещениях ведут к ослаблению сопротивляемости организма против различных заболеваний, в том числе и неспецифической диареи. Из приведенной таблицы 4.1.2 видно, что содержание альбумина (общее содержание альбумина или ОКА) не меняется или изменяется незначительно в группах животных. ЭКА в молоке коров-матерей снижается в группах с увеличением длительности заболевания новорожденных телят (рис. 4.1.3). Так, во II и III группах животных значение ЭКА ниже контрольного (I группа) на 8 и 19 % соответственно, в IV и V группах - на 40 %.
