Введение к работе
Актуальность работы. Целлюлозу, наиболее распространенный растительный шсахарид, можно рассматривать как один из потенциальных источников :ргии. При этом важен тот факт, что целлюлоза быстро возобновима: скорость :интеза составляет около 40,000 млн. т. в год.
Деллюлоза может быть использована как субстрат брожения для анаэробных сроорганизмов с целью получения этанола и других химических продуктов. Невысокой стоимости процесс брожения целлюлозы пока не получил широкого імьішленного применения, однако многочисленные исследования, ведущиеся в й области, позволили в общих чертах наметить основные этапы, необходимые улучшения экономики процесса гидролиза целлюлозы. Прежде всего, 'бходимы знания о механизме действия ферментов целлюлазного комплекса, в тности, представление о механизме синергизма между отдельными его шонентами .
Считается, что целлюлазная система (целлюлосома), продуцируемая бактерией ttridium thennocettum, является одной из наиболее эффективных природных гем [Johnson et al., 1982] вследствие ее высокой удельной активности и мостабилыюсти. Ее изучению уделяется большое внимание, однако до авнего времени выделение, а следовательно и изучение отдельных компонентов люлосомы были затруднены из-за ее высокой стабильности. Успехи в этом равлении были достигнуты лишь с использованием методов генной инженерии,
позволило выделить индивидуальные компоненты комплекса из омбинантных клеток. Таким способом были выделены и охарактеризованы гае, но далеко не все компоненты целлюлосом Cthermocellum. I настоящей работе представлены результаты по выделению, очистке и їєнию свойств трех ранее не изученных целлюлолитических ферментов: двух эглиэканаз и целлобиогидролазы Cthermocellum. Чтобы лучше понять механизм иололизиса было проведено изучение синергизма между этими ферментами и цествлен делеционный анализ одного из целлюлазных генов, cell. [ели и объекты работы. I Представленная диссертационная работа хчедовала следующие цели:
Выделение, очистка и характеристика целлюлаз Cthermocellum, купированных в рекомбинантных штаммах Escherichia coli. . Сравнительный анализ субстратной специфичности очищенных ферментов. . Изучение синергизма между эндоглюканазами и целлобиогндролазой на воримых и кристаллических субстратах.
Делеционный анализ гена cell в целях идентификации различных ктурных доменов эндоглюканазы-1 и наблюдения эффекта делеции на вность и секрецию фермента.
ринятые сокращения: EG - эндоглюканаза; BL35 - делеционный вариант EG1; [ - целлобиогидролаза; eel - ген, кодирующий эндоглюканазу; cbh - ген, :рующий целлобиогидролазу; Д- делегированный ген; pi - изоэлектрическая а; КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза; пНФЦ - пара-нитрофенил- ^ -D-обиозид; пНФЛ - пара-нитрофенил- ^-D-лактозид; ПААГ-полиакриламидный ; ДТТ - дитиотрейтол; SDS - додецилсульфат натрия; Mr - молекулярная а; кДа - кило Дальтон.
Новизна работы. Материалы, представленные в диссертации, являются новьи по следующим причинам:
-
Для выделения EG7 был использован эффект ее специфического торможені при гель-фильтрации в условиях повышенной ионной силы среды. Благода] этому при сравнительно простой процедуре очистки получен гомогенный препар эндоглюканазы с высоким выходом (более 80 %).
-
Впервые было показано, что две эндоглюканазы Cthermocellum (EG1 и ЕС/ кодируемые разными генами, имеют общие антигенные детерминанты.
3. Выделение целлобиогидролазы Cthermocellum из рекомбинантных клеті
Exoli и обнаружение синергического эффекта с эндоглюканазами этого )
организма впервые однозначно подтвердило, что целлобиогидролаза являет
компонентом целлюлазной системы Cthermocellum.
4. Было установлено, что уменьшенный размер целлюлаз, продуцированных
гетерогенной системе, возникает как следствие N-терминального и і
терминального протеолиза.
Практическая значимость работы. Разработанный нами метод очистки Е< может быть использован для легкой и быстрой очистки других гидрофобні белков. Высокая лихеназная активность при кислых рН, высок термостабильность, устойчивость к этанолу и отсутствие ингибирования продукті в случае фермента EG7 могут быть полезными при его использовании в процес приготовления пива. Полученные результаты помогут понять механи взаимодействия целлюлаз с субстратом, роль в этом гидрофобных домені изучить оптимальные условия реакции и эффект различных факторов целлюлолизис. Все это вместе взятое внесет несомненный вклад в эффективное промышленного использования клостридиальных целлюлаз.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены "6-ом Международном Симпозиуме по генетике и индустриальні микроорганизмам", который проходил в августе 1990 г., в Страсбурге, Франция, на совместном семинаре лаборатории анаэробных процессов и лаборатор физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы. Две рабо находятся в печати.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах учетне машинописного текста,, содержит 16 таблиц и 36 рисунков, состоит из введені обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения выводов. Список литературы содержит около 200 источников.
Похожие диссертации на Изучение новых целлюлолитических ферментов Clostridium thertnccellum, продуцированных в Escherichia соli.
