Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Биологическая роль трансферрина и строение его молекулы 9
Глава 2. Биосинтез трансферрина и его регуляция 20
Глава 3. Молекулярная организация гена трансферрина птиц 29
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Выделение и характеристика трансферрина 47
4.2. Получение нехарактеристика моноспецифических антител против трансферрина 49
4.3. Получение радиоактивных-иммуноглобулинов 50
4.4. Выделение и фракционирование полирибосом из печени крысы ТЭТ
4.5. Связывание хлиантител с полирибосомами 51
4.6. Анализ полирибосом, синтезирующих трансферрин 51
4.7. Выделение выеокоочищенной мРНК трансферрина 52
4.7.1. Выделение суммарных полирибосом печени крысы 53
4.7.2. Непрямая иммунопреципитация Тф-синтезирующих полирибосом 54
4.7.3. Выделение суммарной РНК из Тф-синтезирующих полисом 55
4.7.4. Выделение поли/А/-содержащей РНК 56
4.8. Мечение препаратов Тф-мРНК изотопом -в 56
4.9. Определение молекулярного веса Тф-мРНК 57
Глава 6. Характеристика полирибосом печени, синтезирующих трансферрин 82
6.1. Общая характеристика полирибосом крысы 82
6.2. Идентификация Тф~ синтезирующих полирибосом печени крысы 87
Глава 7. Информационная РНК трансферрина 96
7.1. Выделение мРНК трансферрина 96
7.2. Гомогенность и размеры молекулы Тф-мРНК . 98
7.3. Размеры поли/А/-последовательностей в мРНК трансферрина 102
7.4. Вторичная структура трансферриновой мРНК 104
7.5. функциональная характеристика мРНК трансферрина 106
7.5.1. Характеристика продукта бесклеточной трансляции Тф-мРНК 106
7.5.2. Влияние pm'G на трансляцию мРНК трансферрина 106
7.5.3. Синтез и характеристика ДНК, комплементарной мРНК трансферрина 109
7.6. Кинетика гибридизации кДНК с различными фракциями РНК III
Глава 8. Клонирование кДНК трансферрина крысы 115
8.1. Синтез рекомбинантных ДНК, содержащих последовательности Тф-кДНК 115
8.2. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид
8.3. Идентификация Тф-мРНК блотинг-гибридизацией с ник-транслированной ДНК плазмид pRTf 125
8.4. Трансляция Тф-мРНК, выделенной гибридизацией с рекомбинантными ДНК 128
Обсуждение результатов 131
- Биосинтез трансферрина и его регуляция
- Общая характеристика полирибосом крысы
- Размеры поли/А/-последовательностей в мРНК трансферрина
- Синтез рекомбинантных ДНК, содержащих последовательности Тф-кДНК
Введение к работе
Трансферрин /Тф/ - это белок плазмы крови позвоночных животных, играющий исключительно важную физиологическую роль. Способность Тф к обратимому связыванию железа лежит в основе его функций в транспорте железа в организме. Тф является донором железа для таких важных внутриклеточных гемопротеидов как гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза и др. Тф синтезируется, в основном, в печени млекопитающих, а у птиц белок, идентичный Тф по первичной структуре, кональбумин, синтезируется в эпителиальных клетках яйцевода и играет роль одного из преобладающих структурных компонентов яйца. Недостаточность Тф наследственной природы имеет следствием тяжелые нарушения кроветворения, функций печени и других внутренних органов.
Изучение молекулярной организации гена, кодирующего Тф, и механизмов его экспрессии до сих пор производилось, в основном, на яйцеводе птиц /125,43,93/. Лишь единичные работы, выполненные на млекопитающих, касаются биосинтеза Тф в интактной и перфузируемой печени /111,113/ и в бесклеточной системе /148/. В то же время детальные сведения о структуре гена Тф, его экспрессии и свойствах Тф-мРНК необходимы для понимания механизмов регуляции синтеза Тф в нормальном организме и недостаточности этого процесса при наследственных заболеваниях человека. Цели и задачи исследования:
Основной целью работы было изучение биосинтеза Тф в печени крысы. Предполагалось исследовать внутриклеточную топографию Тф-синтезирующих полирибосом, предпринять попытку препаративного выделения Тф-мРНК, исследовать ее физико-химические и функциональные свойства и использовать Тф-мРНК как матрицу для синте- за комплементарной ДНК /кДННУ в реакции обратной транскрипции.
В конкретные задачи работы входило:
I/ выделить и охарактеризовать Тф из плазмы крови крыс и получить к нему моноспецифические антитела;
2/ произвести радиоиммунохимический анализ Тф-синтезирующих полирибосом печени крысы;
3/ выделить препаративно очищенную Тф-мРНК с использованием метода непрямой иммунопреципитации полирибосом с антителами к ТФ;
4/ охарактеризовать физико-химические свойства Тф-мРНК /степень гомогенности препарата, молекулярный вес, вторичную структуру, концевые группы/ и исследовать ее матричную активность в бесклеточном синтезе Тф и в реакции обратной, транскрипции; 5/ синтезировать однонитевую кДНК - обратный транскрипт Тф-мРНК и применить, ее как гибридизационный зонд для количественного определения стационарной концентрации Тф-мРНК в> печени крысы; 6/ произвести ферментативный синтез двухцёпочечной Тф-кДНК, интегрировать ее в плазмиду pBR 322 и получить коллекцию трансформированных клонов E*coli,. несущих рекомбинантные плазмиды со вставками различных сегментов синтетического структурного гена Тф. Научная новизна работы;
В работе впервые охарактеризованы Тф-синтезирующие полирибосомы печени крысы и показано, что Тф синтезируется на мембра-носвязанных полирибосомах. Впервые выделена гомогенная Тф-мРНК млекопитающих, охарактеризован первичный продукт ее бесклеточной трансляции, определены ее молекулярная масса, размеры 3»- _ 7 -концевых поли/А/-трактов и получена общая характеристика ее вторичной структуры. В реакции обратной транскрипции Тф-мРНК синтезирована одноцепочечная Тф-кДНК. Определена стационарная концентрация Тф-мРНК в печени крысы /6000-7000 молекул на клетку/. Произведен двухступенчатый синтез двухцепочечных Тф-кДНК путем обратной транскрипции Тф-мРНК и достройки второй нити ДНК с ДНК-полимеразой I. Получена коллекция клонов Е*соіі, несущих рекомбинантные плазмиды - дериваты РВН 322 со вставками, соответствующими различным сегментам структурного гена Тф. Научно-практическое значение полученных результатов:
Основным итогом работы является препаративное выделение препарата Тф-мРНК, гомогенной по ряду независимых критериев, а также - синтез кДНК - обратного транскрипта Тф-мРНК, и клонирование двухцепочечной кДНК в бактериальных клетках. Препарат высокоочищенной и (функционально активной Тф-мРНК может быть использован для изучения реакций посттрансляционного созревания Тф в реконструированных бесклеточных системах. Наличие коллекции клонированных фрагментов структурного гена Тф является необходимой предпосылкой для дальнейшей работы по изучению молекулярной структуры и механизмов экспрессии гена
Тф в нормальных клетках печени и при наследственных заболеваниях, связанных с недостаточностью синтеза Тф. Структура диссертации:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы /главы 1-3/, материалов и методов исследования /глава 4/, собственных исследований /главы 5-8/, обсуждения результатов и выводов. Иллюстрирована 30 рисунками и 8 таблицами. Список литературы содержит 184 наименования /20 - отечественных и 164 ~ 8 -иностранных авторов/.
Положения, которые выносятся на защиту:
Биосинтез трансферрина (Тф) локализован на полирибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума печени крысы* Размер Тф-синтезирующих полисом равен 11-13 рибосомнмо-номеров на I молекулу Тф-мРНК.
Из печени крыс методами непрямой иммунопреципитации и хроматографии РНК на поли (и )-оефарозе выделена электрофорети.-чески гомогенная Тф-мРНК, имеющая молекулярную массу 0,86-
0,925 МД и программирующая бесклеточный синтез предшественника Тф с молекулярной массой 80 кД.
Тф-мРНК содержит последовательность поли(А), гетерогенную по длине (96, 45> и 26 нуклеотидов). Тф-мРНК содержит на 5>'~ков> це структуру типа кепаг играющую существенную роль в трансляции Тф-мРНК»
По данным гибридизации суммарной полисомной РНК печени крысы с кДНК-обратным транскриптом Тф-мРНК, концентрация последовательностей Тф-мРНК составляет 6000 молекул на I клетку печени, т.е. Тф-мРНК относится к группе преобладающих мРНК гепатоцитов.
Апробация диссертации
Апробация диссертации состоялась на заседании Ученого совета Института биоорганической химии Ш УзССР' (1983 г.) и на научной конференции Лаборатории, биохимической генетики НИЙЭЖ АМН СССР' (15 апреля 1983 г*}. Результаты работы доложена на Всесоюзной конференции по программе "Ген" (Москва,1983 г.).
Биосинтез трансферрина и его регуляция
Трансферрин является белком плазмы крови. Его содержание в крови человека равно 2,3 мг/мл, а у крыс эта величина достигает 4,8 мг/мл /ИЗ/. Трансферрин, как и многие сывороточные белки, синтезируется в печени. Этот факт доказан многочисленными экспериментами, среди которых следует отметить работу Моргана на крысах, где место синтеза Тф определяли по включению С -лейцина в этот белок /III/. Через 20 минут после введения метки, радиоактивность обнаруживается только в Тф печени. Через 2 часа С -Тф появляется и в других органах. В небольших количествах Тф синтезируется также в селезенке, почках, легких и костном мозге. У птиц, кроме печени, трансферрин /кональбумин/ синтезируется в яйцеводе.
McKnight с соавторами изучали распределение последовательностей мРНК трансферрина в различных тканях птиц методом гибридизации РНК с трансферриновой кДНК /104,105/. Показано, что только печень и яйцевод содержат существенное количество молекул Тф-мРНК на клетку /700 и 65 молекул соответственно/. Некоторое количество Тф-мРНК /45 молекул на клетку/ содержится в костном мозге. В других органах авторы не обнаружили последовательностей мРНК трансферрина. Трансферрин относится к белкам, которые после биосинтеза экспортируются из клетки в кровоток. В данный момент существует огромное количество работ, посвященных биосинтезу и посттрансляционному созреванию экспортных белков. Анализируя эти работы, можно указать на следующие особенности биосинтеза секреторных белков /3/. Существует длинный путь реакций, ведущих от растущей полипептидной цепи до зрелого белка. Это реакции ограниченного протеолиза, гликозилирования, ацетшіирования, фосфорилирования и др. Кроме этого, новообразованные белки претерпевают сложный путь внутриклеточного транспорта. Трансферрин вместе с альбумином представляют удобную модель для детального изучения механизмов биосинтеза и посттрансляционной модификации секреторных белков в печени; В 1971 г. вышла работа Моргана и Иетерса, в которой авторы изучали биосинтез и секрецию этих основных сывороточных белков /ИЗ/. В данной работе крысам вводили С -лейцин и измеряли включение метки в Тф и альбумин различных фракций клеток и сыворотки. Результаты показывают, что альбумин и трансферрин в процессе синтеза связаны с эндоплазматическими мембранами. Однако, секреция Тф идет медленнее, чем секреция альбумина. Трансферрин появляется в крови через 30 минут после введения метки, а альбумин - через 16 минут. Время транзита синтезиро- -ванного Тф и альбумина равно 80 и 23 минуты соответственно. За эти периоды времени синтезируется 173 мкг Тф и 270 мкг альбумина. Авторы работы предположили, что процесс секреции транс-феррина сопровождается реакциями ограниченного протеолиза и гликозилирования. В работе также делается вывод, что альбумин и трансферрин имеют секреторный путь: шероховатый ретикулум -гладкий ретикулум - аппарат Гольджи - кровоток.
Более детальное исследование биосинтеза и секреции альбу-, мина и трансферрина у крыс провели Schrei.beг с С0Тр, /148/. Они показали, что внутриклеточный трансферррш представлен тремя молекулярными формами, которые различаются по содержанию стало вых кислот, причем динамика появления этих форм в различных субклеточных фракциях неодинакова. Кроме того, в данной работе изучили влияние ингибиторов протеаз и ингибиторов гликозилирования на секрецию трансферрина. Оказалось, что ингибитор протеаз почти полностью подавляет секрецию Тф в кровоток, а ингибитор гликозилирования не влияет на секрецию трансферрина. Эти данные позволяют сделать вывод, что протеолитическое созревание обязательно для секреции трансферрина, в то время как гли-козилирование не является столь необходимым для данного процесса. В более поздней работе /149/ Schreiber et al исследовали особенности биосинтеза ряда секреторных белков, в том числе и трансферрина, в печени человека. Авторы использовали разделение внутриклеточных форм белков на колонке ДЭАЭ-целлюлозы по заряду с последующим определением молекулярной массы. Показано, что для трансферрина, / -кислого гликопротеина, d, -антитрипсина и альбумина существуют внутриклеточные предшественники, а внутриклеточные формы антихимотрипсина, антитромбина, антитрипсина, церулоплазмина, фибриногена, р-гликопроте-ина, гаптоглобина и гемопексина не отличаются от сывороточных. Относительно трансферрина установлено, что в печени существуют две формы этого белка, которые имеют одинаковую молекулярную массу /76500/ и одинаковый N -конец: Вал-Про-Асп-Лиз-Три-Вал Отличаются они тем, что одна форма, подобно Тф из сыворотки, содержит в С-концевой области 4,4 остатка сиаловых кислот на молекулу белка, а другая не содержит их вообще. Отличия по количеству сиаловых кислот найдены и для внутриклеточных форм. других секреторных белков. Учитывая тот факт, что последовательность аминокислот на -конце внутриклеточных форм и сывороточного трансферрина одинаковы, авторы приходят к выводу, что трансферрин подвергается внутриклеточному процессингу с С-конца. Суммируя вышеизложенные данные, можно сказать, что биосинтез и созревание Тф имеют сложный характер, но в общих чертах они мало отличаются у человека и у крыс. Механизмы созревания и секреции Тф изучены пока недостаточно.
Известно, что секреторные белки синтезируются на полирибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума. Долгое время было неизвестно, каким образом программируется такая топография биосинтеза белков. Анализируя данные по аминокислотной последовательности избыточных пептидов, которые появляются в условиях бесклеточной трансляции, Блобел сформулировал "сигнальную" гипотезу, которая объясняла специфичность синтеза секреторных белков в клетке и механизм их векториального трансмембранного переноса в ходе синтеза /30/.
Согласно этой гипотезе трансляция мРНК начинается на свободных полирибосомах, но НН2-конец растущей цепи приобретает гидрофобные свойства и связывается с белками-рецепторами в составе мембран. В мембране формируется канал, через который полипептидная цепь попадает в цистерны эндоплазматического ретикулума. После этого "сигнальный" пептид отщепляется "сигна-лазой". "Сигнальная" гипотеза подтверждена рядом экспериментов /3/. Для всех секреторных белков, кроме овальбумина /61/, найдены "сигнальные" пептиды /88,119,160/. При трансляции мРНК трансферрина крыс в бесклеточной системе из зародышей пшеницы обнаружили продукт с избытком в 20 аминокислотных остатков /148/. Также найдена "сигнальная" последовательность для трансферрина птиц /163/.
Общая характеристика полирибосом крысы
Высокоочищенную і ЛРНК трансферрина выделяли из полирибосом печени крысы, как это описано в "Материалах и методах". В основу схемы выделения Тф-мРНК была положена процедура выделения минорных мРНК из печени, разработанная в Лаборатории биохимической генетики ЙЭМ АМН СССР и примененная ранее для препаративного получения мРНК церулоплазмина /6,63,115/. Основные стадии выделения: I/ получение тотального препарата полирибосом печени; 2/ непрямая иммунопреципитация Тф-синтезирующих полирибосом; 3/ депротеинизация суммарной РНК из шлмунопреци-питированных полисом, содержащих насцентные цепи Тф; 4/ выделение поли/А/-содержащей мРНК аффинной хроматографией на по-ли(и) -сефарозе. На всех стадиях выделения Тф-мРНК был использован гепарин как ингибитор нуклеаз. В литературе тлеются указания, что выход мРНК существенно возрастает при ее выделении в присутствии очень высоких 1-2 мг/мл концентраций гепарина /123/. Однако, при этом наблюдается также выход ДНК из ядер, что затрудняет последующие этапы очистки РНК. Освобождение от ДНК путем обработки препарата ДНКазой требует идеальной чистоты ДНКазы от примесей РНКазы, почти всегда присутствующих в коммерческих образцах ДНКазы. Исходя из этих соображений, мы в опытах по препаративному выделению Тф-мРНК использовали не такую высокую концентрацию гепарина /300-500 мкг/мл/, при которой выход ДНК из ядер не имеет места, а полисомы и мРНК выделяются в нативном виде. В некоторых опытах после удаления ядер и митохондрий дифференциальным центрифугированием концентрацию гепарина повыйали до I мг/мл. Кроме того, для предотвращения деградации РНК все стадии выделения проводили на холоду. Результаты опытов по выделению Тф-мРНК суммированы в табл.4.
Из таблицы видно, что Тф-синтезирующие полисомы, выделяемые непрямой иммунопреципитацией, составляют 0,8-І,Во суммарной иммунопреципитата. По-видимому, эта величина может быть несколько завышенной вследствие наличия в иммунопреципитате значительного количества белков /"первых" и "вторых" антител/, дающих свой вклад в измеряемую AOCQ. Действительно, выход Тф-синтезирующих полисом оказывается ниже /0,4-0,5 /, если определять его по выходу РНК при депротеинизации иммунопреципитата и относить к исходному содержанию РЖ в суспензии полисом. Доля поли/А/-содержащей РНК в Тф-синтезирующих полисомах варьировала незначительно и составляла 1,5-1,8$ суммарной РНК, выделенной из иммунопреципитата. Следует отметить, что при выделении Тф-мРНК мы не стремились получить максимальный выход мРНК и проводили инкубацию с "первьми" антителаїш 60 минут, а со "вторыми" - 90 минут. В этих условиях, по-видимому, происходит неполное высаждение полисом, участвующих в синтезе Тф, однако существенно возрастает специфичность реакции иммунопре-ципитации и гомогенность выделенных препаратов Тф-мРНК. Это позволяет ограничиться хроматографией на поли(п) -сефарозе и не производить дальнейшей очистки мРНК электрофорезом или седиментацией.
Критерием структурной гомогенности мРНК является ее гомогенное распределение по молекулярной массе /I/. При этом молекулярная масса нативной мРНК должна быть не ниже теоретической величины, рассчитанной на основании молекулярной массы кодируемого белка. Как правило, оказывается, что размеры мРНК существенно выше теоретически ожидаемых. Например, при определении молекулярной массы мРНК, кодирующих основные белки яйцевода птиц, выяснилось, что размеры овальбуминовой мРНК превышают почти в два раза теоретически ожидаемую величину. Экспериментально установленные размеры мРНК лизоцима, овомукоида и кональбумина значительно превышают длину нуклеотидной последовательности, необходимой для кодирования соответствующего белка /39/. Такая разница может быть обусловлена: а/ неточностью определения молекулярной массы, поскольку информационные РНК . содержат большое количество участков вторичной структуры и б/ наличием в составе мРШ существенном доли нетранслируемых последовательностей, к которым можно отнести 3»-концевую нетранс-лируемую последовательность, 5»-концевую нетранслируемую последовательность и поли/А/ /2,3/.
Для определения степени гомогенности поли/А/-содержащей мРНК из Тф-синтезирующих полисом был использован метод электроток фореза в денатурирующих условиях; Оказалось, что 1-Тф-мРНК представлена на электрофореграмме дискретным гомогенным компонентом, который по электрофоретической подвижности занимает промежуточное положение между маркерными рРНК / 28S и 18S / /рис.18/.
Обнаруживаются незначительные примеси рибосомальных РНК, доля которых не превышает 10-20% от общей радиоактивности препаратов 1-Тф-мРНК. Кроме того, на старте обнаруживается некоторое количество радиоактивного материала, который, по-видимому, представляет собой агрегаты молекул РНК. Следует отметить, что мРНК кональбумина /трансферрина птиц/ тоже обладает большой склонностью к агрегации /123/. Молекулярная масса Тф-мРНК, определенная по положению пика на электрофореграмме, равна 0,925 ВД, что соответствует длине ее цепи 2800 нуклеотидов /если принять, что молекулярная масса среднего нуклеотидного остатка в Тф-мРНК равна 330/. Такой размер молекул Тф-мРНК из печени крыс близок к молекулярной массе мРНК кональбумина из яйцевода птиц по данным электрофореза /92,44/. Седиментацион-ный анализ препаратов 1-Тф-РНК подтверждает результаты электрофореза. Как видно на рис.19, Тф-мРНК седиментирует в денатурирующем сахарозном градиенте в виде гомогенного пика, который соответствует зоне 20S /молекулярная масса 0,8-0,9 ВД/. На дне пробирок после градиентного центрифугирования обнаруживается в небольших количествах агрегированный радиоактивный материал. В опытах по седиментационному анализу 1-Тф-мРНК, выделенной препаративно, в параллельных градиентах производилось фракционирование суммарной полисомной РНК.
Размеры поли/А/-последовательностей в мРНК трансферрина
В опытах по седиментационному анализу Тф-синтезирующих полисом печени выяснилось, что одна молекула Тй-мРЖ транслируется одновременно 11-13 монорибосомами. Сходные размеры тлеют полисомы яйцевода птиц, синтезирующие кональбумин /78/. Экспериментально найденные размеры Тф-синтезирующих полисом существенно ниже максимально возможной загрузки Тф-мРНК транслирующими рибосомами /2.1-1-12 рибосомы/мРНК/. после введения животным циклогексимида, замедляющего перемещение рибосом по цепи мРБК, наблюдалось некоторое "утяжеление" Тсл-срштезирую-щих полисом, размер которых возрастал до 15-16 рибосом-мономеров на I молекулу мРЕК, но не достигал предельной величины, характеризующей максимальную загрузку мННК транслирующими рибосомами. Сам по себе .эффект циклогексимида указывает на наличие корреляции между скоростью элонгации in vivo и размерами изолированных полисом, определяемыми in vitro, т.е. может рассматриваться как аргумент против деградации полисом при выделении. Недостаточная /по сравнению с предельной/ загрузка Тф-мігШ рибосомами даже при циклогенсимидном блоке элонгации отражает скорее всего то обстоятельство, что потенциальная трансляционная активность Тф-мРШ in vivo реализуется не полностью. Если это так, то можно предположить, что существует механизм трансляционного контроля, ограничивающий эффективность трансляции ТгИдРНН; в физиологических условиях и обеспечивающий увеличение этого параметра при необходимости быстрой активации синтеза Тф. В литературе такого рода механизм регуляции синтеза Тф не описан. Более того, как в яйцеводе птиц при действии гормонов, так и в печени птиц под влиянием нарушений баланса железа изменения скорости синтеза ТФ имеют в своей основе соответствующие сдвиги стационарных концентраций 1 -мРЖ, а не изменения эффективности ее трансляции /IU4,I05/.
В сложной цепи реакций экспрессии индивидуальных генов, кодирующих белки, центральное место занимает информационная РНК.
Как правило, препаративное выделение индгшщтуальных мРШ, изучение их молекулярной организации, матричной активности в бесклеточной системе и получение кДШ-обратных транскриптов являются необходимыми и важнейшими этапами в изучении молекулярной организации хромосомных генов и механизмов их экспрессии, а также - нарушений структуры и активности генов при наследственных заболеваниях. Методы выявления и очистки индивидуальных мРНК разработаны, в основном, для преобладающих классов мРНК, содержание которых составляет 50-60?ь и более в суммарной популяции мРНК клетки /I/. Имейся лишь единичные примеры успешного выделения вые о ко очищенных минорных РШ, кодирующих белки, доля которых не превышает 1- " от суммарного продукта белкового синтеза. К таким мРНК относится, например, мРЕК церулоплазмина, выделенная из печени крысы в высокоочищенном виде /6,63,115/. Для препаративного выделения Гй-мРНК мы использовали принципиальную схему, которая была разработана в Лаборатории биохимической генетики ША АМН СССР для получения мРНК церулоплазмина.
Выделенная в наших опытах Т т-мРНК оказалась гомогенной при электрофорезе в денатурирующих условиях /полиакриламндньтй гель с мочевиной/ и при седиментации в сахарозных градиентах. Существенно отметить, что в седиментационных опытах пик радиоак-тивности 1-Тф-мРШ совпадал с пиком матричной активности фракций суммарной полисомной РШ печени в бесклеточном программировании синтеза Тгп. при бесклеточной трансляции очищенной TWMPHK наблюдалось программирование синтеза единственного полипептида с молекулярной массой биосинтетического предшественника Тй, что указывает на функциональную гомогенность Тф-мННК. Наконец, в опытах по гибридизации гШ-мРНК с кДнК - ее обратным транскриптом была определена кинетическая сложность Тф-мРНК, которая совпадает с ее аналитической сложностью, по данным денатурирующего гель-электрофореза. Совокупность этих результатов, полученных независимыми методами, указывает на то, что выделенная нами ТгУгмРНК гомогенна и не содержит примесей . других мРНК, которые можно было бы определить методами электрофореза и седиментации, бесклеточной трансляции или гибридизацией с кДНК.
Но данным электрофореза в полиакриламидном геле с 7м мочевиной, молекулярная масса Тф-мРНК составляет 0,925 МД. Для определения этой величины был использован и другой метод, не требующий предварительного препаративного выделения ТсУгмРНК. Суммарную полисомную РНК печени крысы в этих опытах фракционировали электрофорезом в агарозном геле с бХ формальдегидом, переносили блотингом на нитроцеллюлозный фильтр /165/ и гибри-дизовали с клонированной Тй-кДНК /ДНК плазмид PRTf 1 4 и pRTf 27 /f которую предварительно метили Н в реакции ник-трансляции. При этом оказалось, что последовательности ТсЬ-мРШ содержатся в электрофоретически гомогенной фракции полисомной РНК с. молекулярной массой 0,86 ЦЦ. Следует отметить, что расхождение величин молекулярных масс, определенных электрофорезом в двух различных системах с разными денатурирующими агентами, представляется не очень существенным. Эти различия могут быть связаны с более жестким денатурирующим действием формаль дегида по сравненшо с мочевиной и с вкладом остаточной вторичной структуры в определяемые размеры Тп-мРШ при гель-электрофорезе в присутствии мочевины. В целом, молекулярная масса Тго-мРНК из печени крысы близка к молекулярным размерам мРШ кональбумина из яйцевода птиц, которые были определены наиболее точным методом - полным анализом первичной структуры и подсчетом количества нуклеотидов в цепи мРШ. /ЄО/.
Синтез рекомбинантных ДНК, содержащих последовательности Тф-кДНК
На первом этапе работы было предпринято выделение гомогенных препаратов Тй из сыворотки крови крыс, причем гомогенность Тф была доказана электрофорезом в денатурирующих условиях и другими тестами. Выделенные препараты Тф характеризовались высоким отношением А дт/Ад , что указывает на их способность к связыванию ионов Fe +, т.е. на сохранение функциональной активности при выделении, молекулярная масса полипептидных цепей Тф, определенная гель-электрофорезом в денатурирующих условиях, согласуется с приведенными в литературе данными /178,80/.
Высокая степень чистоты препаратов Тй крысы позволила использовать их для иммунизации кроликов и для получения моноспецифических антител. Были получены антитела с высоким титром, моноспецифичность которых была доказана методом радиальной им-мунодиффузии.
Следующим этапом работы было применение моноспецифических анти-Тф-иммуноглобулинов для иммунохимической идентификации Тй-синтезирующих полисом и для их препаративного выделения, которое является первым этапом выделения индивидуальных мРШ /I/. синтезирующие полисомы печени крысы были идентифицированы по их способности к связыванию иІ-анти-їф-иммуноглобулинов. Для выделения недеградированных полисом, пригодных для последующего ііммунохимичєского анализа и получения интактных молекул Тсо-мРБК, все стадии препаративного получения полисом из печени крысы проводились в присутствии высоких концентраций гепарина /200-300 мкг/мл/ как активного ингибитора нуклеаз и циклогексимида /20 мкг/мл/ как агента, подавляющего элонгацию и терминацию и обеспечивающего функциональное "замораживание" полирибосом при их выделении. Седиментационный анализ изолированных мембраносвязанных и свободных полисом печени не обнаружил наличия в препаратах существенных количеств деградированного материала и 80s- -монорибосом, после обработки полисом ЇМ КСІ- Імї/Ї пуромицином происходило их превращение в 80S -мономеры. Изолированные полисомные фракции обладали высокой белоксинтезирующей активностью в бееклеточной системе из1зародышей пшеницы и в реконструированной системе в присутствии цитозола печени и синтезировали полипептиды, пре-инициирован НЬіе in viVO.
Для изучения внутриклеточной топографии Т синтезирующих полисом и их размеров была использована реакция связывания -анти-Тф-иммуноглобулинов с растущими цепями Tfi в составе полисом. В предварительных опытах были определены оптшяальньте стехиометрические отношения антитела-полисомы в инкубационной среде, причем оказалось, что насыщающая концентрация :г51-анти-Тф-иш%шоглобулинов составляет b мкг на 100 мг полисом /т.е. на одну единицу А2б0/# Эти результаты близки к данным, полученным другими авторами при изучении полисом яйцевода птиц синтезирующих кональбумин /92/. Было также установлено, что связывание - I-антител с полисомами носит характер специфической иммунной реакции антиген-антитело, т.к. преинкубация полисом с немечеными антителами к То- предотвращала последующее связывание 51-антител, тогда как преинкубация с антителами к церулоплазмину не влияла на последующее связывание с полисомами і2оІ-анти-Тф-иммуноглобулинов. Установленные в этом разделе работы оптимальные условия связывания анти-Т гиммуногло-булинов с полисомами были использованы в- дальнейшей работе по препаративному выделению Т#-синтезирующих полисом методом непрямой июлунопреципитации.
Существенным аспектом биосинтеза индивидуального белка является внутриклеточная топография соответствующих полирибосом и их связь с структурными элементами цитоплазмы. Интерес к топографии синтеза Тф обусловлен еще и тем обстоятельством, что некоторые наследственные дефекты синтеза белков связаны с нарушением нормальной топографии синтеза и последующего транспорта белков в клетке и их посттрансляционного процессин-га /11,13/. Для выяснения внутриклеточной локализации полисом, синтезирующих Тсб, были применены два метода: I/ изучение Святуюзывания л" 1-анти-Тф-иммуноглобулинов с полисомными фракциями и 2/ изучение способности полисомных фракций к. бесклеточному синтезу иммунопреципитируемого Гф в условиях достройки полипептидных цепей, преинициированных in vivo., при этом были получены согласующиеся результаты, показывающие, что Ти синтезируется только на мембраносвдзанных полисомах, а свободные полисомы не содержат насцентных цепей Щ и не синтезируют этого белка в бесклеточной системе..Таким образом, Тгб подобно другим секреторным белкам печени /сывороточному альбумину /154/, церулоплазмину /б 5/ и др./, синтезируется на мембраносвязанных полисомах этого органа.
В опытах по седиментационному анализу Тф-синтезирующих полисом печени выяснилось, что одна молекула Тй-мРЖ транслируется одновременно 11-13 монорибосомами. Сходные размеры тлеют полисомы яйцевода птиц, синтезирующие кональбумин /78/. Экспериментально найденные размеры Тф-синтезирующих полисом существенно ниже максимально возможной загрузки Тф-мРНК транслирующими рибосомами /2.1-1-12 рибосомы/мРНК/. после введения животным циклогексимида, замедляющего перемещение рибосом по цепи мРБК, наблюдалось некоторое "утяжеление" Тсл-срштезирую-щих полисом, размер которых возрастал до 15-16 рибосом-мономеров на I молекулу мРЕК, но не достигал предельной величины, характеризующей максимальную загрузку мННК транслирующими рибосомами. Сам по себе .эффект циклогексимида указывает на наличие корреляции между скоростью элонгации in vivo и размерами изолированных полисом, определяемыми in vitro, т.е. может рассматриваться как аргумент против деградации полисом при выделении. Недостаточная /по сравнению с предельной/ загрузка Тф-мігШ рибосомами даже при циклогенсимидном блоке элонгации отражает скорее всего то обстоятельство, что потенциальная трансляционная активность Тф-мРШ in vivo реализуется не полностью. Если это так, то можно предположить, что существует механизм трансляционного контроля, ограничивающий эффективность трансляции ТгИдРНН; в физиологических условиях и обеспечивающий увеличение этого параметра при необходимости быстрой активации синтеза Тф.
