Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Гликопротеины сыворотки крови .
1.1.1. Современные представления 13
1.1.2. Роль белков острой фазы при воспалении и повреждении тканей 18
1.2. Лектины: современные представления, характеристика, использование для определения гликопротеинов сыворотки крови 21
1.3. Негоспитальная пневмония.
1.3.1. Современный взгляд на проблему 32
1.3.2. Изменения гликопротеинов сыворотки крови при пневмониях ..39
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Общая характеристика наблюдаемых больных... 42
2.2. Основные методы лабораторной диагностики при негоспитальной пневмонии ...46
2.3. Методы определения показателей обмена гликопротеинов 47
2.4. Методы статистического анализа 54
Глава 3. Анализ показателей лабораторных исследований у больных негоспитальной пневмонией 55
Глава 4. Изучение показателей обмена гликопротеинов сыворотки крови у здоровых и больных негоспитальной пневмонией.
4.1. Исследование содержания белоксвязанных гексоз, белок-, олиго-мерсвязанных и свободных сиаловых кислот, белок- и олигомер-связанной фукозы, гексозаминов, активности сиалидазы и фукозидазы в сыворотке крови здоровых и больных негоспитальной пневмонией 69
4.2. Исследование гликопротеинов сыворотки крови у практически здоровых и больных негоспитальной пневмонией с применением
лектина конканавалина А 84
Обсуждение полученных результатов 95
Выводы 112
Практические рекомендации 113
Список литературы
- Гликопротеины сыворотки крови
- Лектины: современные представления, характеристика, использование для определения гликопротеинов сыворотки крови
- Основные методы лабораторной диагностики при негоспитальной пневмонии
- Исследование содержания белоксвязанных гексоз, белок-, олиго-мерсвязанных и свободных сиаловых кислот, белок- и олигомер-связанной фукозы, гексозаминов, активности сиалидазы и фукозидазы в сыворотке крови здоровых и больных негоспитальной пневмонией
Введение к работе
В структуре заболеваемости негоспитальная пневмония занимает одно из ведущих мест, частота этого заболевания в последние годы имеет тенденцию к росту, несмотря на большие достижения в разработке и применении новых методов лечения (Мартынова А.В. с соавт., 2002; Воробьев П.А. с соавт., 2003; Bartlett J.G., 2000). Заболеваемость негоспитальной пневмонией по Российской Федерации в настоящее время составляет 5-8 человек на 1000 населения (Чуча-лин А.Г. с соавт., 2003). В последние годы выросла также летальность от пневмонии: при крупозной форме до 4-5%, а при очаговой до 0,9-1% (Чучалин А.Г. с соавт., 2003). В Удмуртской Республике общая заболеваемость негоспитальной пневмонией составляет 4,9 - 5,1 человек на 1000 населения, и в последние годы неуклонно увеличивается количество больных, умерших от пневмонии. Так, в 2000 году в Удмуртской Республике от пневмоний умерло 339 человек, в 2001 -459, а в 2002 - 554 человека (Шадрин С.Г., 2003).
Диагностика пневмонии складывается из совокупности клинических критериев (лихорадка, температура выше 38С, интоксикация, кашель сухой или с мокротой, кровохарканье, боль в грудной клетке), физикальных данных (притупление перкуторного звука, усиление голосового дрожания, ограничение подвижности легочного края, изменение дыхания - ослабленное, жесткое, бронхиальное, крепитация, мелкопузырчатые хрипы), объективных критериев (появление новых очагово-инфильтративных изменений в легких при рентгенографии грудной клетки в 2-х проекциях, микробиологическое исследование с окраской мазка мокроты по Граму и посевом, клинический анализ крови — лейкоцитоз >10х109/л и/или палочкоядерный сдвиг >10%) (Чучалин А.Г., 2003). Типичными лабораторными признаками являются также токсигенная зернистость нейтро-филов, анэозинофилия, гиперфибриногенемия, протеинурия, уробилинурия, ци-линдрурия (Сильвестров В.П., 1987; Чиркин А.А., 1992; Синопальников А.И., 2003).
Ошибки в диагностике пневмоний достигают 20%, диагноз пневмонии в первые три дня болезни ставится у 35% заболевших (Чучалин А.Г., 2003). У 30 -40% больных острая пневмония приобретает затяжное течение (Сильвестров В.П., 1987), что связано с запоздалой диагностикой, а, следовательно, несвоевременным началом лечения.
В последнее время в пульмонологии все чаще описываются случаи так называемой атипичной пневмонии. Это пневмонии у ослабленных и пожилых людей на фоне снижения общей резистентности организма, характеризующиеся вялым малосимптомным течением без повышения температуры и изменений гемограммы (Сильвестров В.П., Федотов П.И., 1987).
Атипично протекают пневмонии редкой локализации (верхнедолевая, прикорневая), а так же микоплазменные, хламидиозные, легионеллезные пневмонии (Синопальников А.И., 2001; Турьянов М.Х., Чернакова Г.М., 2003).
Необходимо отметить, что стето-акустические признаки поражения органов дыхания, которым раньше отводлось одно из ведущих мест в диагностике заболеваний легких, в настоящее время несколько утратили свою клиническую ценность (Синопальников А.И., 2001).
Одним из основных методов диагностики пневмонии является рентгенологический, но в последнее время появился термин «рентгенонегативная пневмония» (Чучалин А.Г., 2003). Некоторые авторы считают, что рентгенологические изменения отсутствуют у 26,5% больных пневмонией (Палеев P.M. с соавт., 1985), другие же утверждают, что рентгенонегативная пневмония является следствием ограниченных технических возможностей традиционных методов исследования (Федченко Г.Г., 2002).
Диагностика пневмонии в настоящее время затруднена у 1/3 больных ввиду стертой клинико-рентгенологической симптоматики и из-за отсутствия характерных прежде для ее течения гематологических изменений (Провоторов В.М., Семенкова Г.Г., 1991). Все это приводит к необходимости поиска новых объективных методов исследования при этом заболевании.
Вместе с тем, при пневмонии, как и при многих других патологических состояниях, в организме формируется неспецифическая воспалительная реакция. функцией которой является обезвреживание, связывание и удаление из организма инфекционных агентов, их токсинов и восстановление поврежденных тканей. Совокупность системных и местных реакций организма на повреждение была названа острофазовым ответом (Алешкин В.А. с соавт., 1988).
Одним из ведущих признаков острофазовой реакции организма, в том числе и при пневмонии, является изменение белков плазмы крови, названных соответственно белками острой фазы.
Концентрация многих БОФ повышается уже через несколько часов от начала альтерации, что может быть использовано в ранней диагностике пневмонии и для характеристики состояния больного в динамике (Алешкин В.А. с соавт., 1988; Шевченко О.П., 1996).
Важнейшей особенностью БОФ является принадлежность большинства из них к классу гликопротеинов, а именно к N-гликопротеинам, так как их углеводная цепочка присоединена к NHo-группам аспарагиновых остатков полипептидной цепи (Новикова Л.И., Алешкин В .А., 1991; Koolman J., 1998).
В литературе имеются данные по определению как суммарных гликопротеинов сыворотки крови, так и отдельных их представителей при негоспитальной пневмонии (Анасашвили А.Ц. с соавт., 1968; Шелег В.А., Мизин И.И., 1980; Лутошкин С.Ф., 1983; Комар СИ., Коробейникова Э.Н., 1987; Арсентьев Ф.В. с соавт., 1990; Комар СИ., Провоторов В.М., Семенкова Г.Г., 1991; Камышников B.C., 2000).
Предложено много методов для определения гликопротеинов сыворотки крови. Так, можно оценивать их количество по углеводному (гексозы, сиаловые кислоты, гексозамины, фукоза) или белковому компоненту. Существуют методы определения гликопротеинов сыворотки крови с помощью электрофореза с последующей специфической окраской и денситометрией, взвешиванием или элюцией электрофореграмм (Хъюз Р., 1985). Однако, перечисленные методы определения гликопротеинов сыворотки крови не всегда доступны для клинико - диагностических лабораторий из-за большой трудоемкости, длительности выполнения, необходимости использования высокотоксичных реактивов и специ- ального оборудования.
Таким образом, с научной и практической точки зрения оправданным является поиск новых методов определения гликопротеинов сыворотки крови.
В литературе много исследований по дифференцировке гликопротеинов с использованием лектинов (Королев Н.П., 1984; Луцик М.Д., 1984; Лахтин В.М., 1987; Кильдибекова А.Р. с соавт., 2003), которых в чистом виде было получено более 600.
Определенный интерес представляет лектин, выделенный из канавалии мечевидной - конканавалин А. Это простой белок, одна молекула которого имеет 4 центра связывания углеводов. Он обладает сродством к а-аномерам маннозы, глюкозы, М-ацетил-О-глюкозамина в соотношении 100:22:1. В сыворотке крови конканавалин А в различном процентном соотношении связывает значительное количество белков, гликопротеинов по структуре, большинство из которых относятся к белкам острой фазы воспаления. Это oti-антитрипсин, а.\-антихимотрипсин, церулоплазмин, гаптоглобин, аг-макроглобулин, гемопексин, трансферрин, С-3 компонент комплемента, иммуноглобулины G, А, М и некоторые другие (Луцик М.Д. с соавт., 1981).
Комплексная оценка содержания и состава гликопротеинов у больных пневмонией может быть полезна для понимания патогенетических особенностей заболевания, а также использоваться в качестве дополнительного критерия для диагностики, оценки степени тяжести и раннего прогнозирования затяжного течения негоспитальной пневмонии.
Цель исследования: оценить изменения показателей обмена гликопротеинов в сыворотке крови больных негоспитальной пневмонией в зависимости от формы, степени тяжести и характера течения заболевания и сопоставить их с общепринятыми лабораторными данными.
Задачи исследования:
1. Выделить суммарные препараты гликопротеинов сыворотки крови у практически здоровых лиц и больных внебольничной пневмонией, определить в них количество и соотношение углеводных компонентов (гексоз, гексозаминов, фукозы и сиаловых кислот).
Выделить суммарные препараты гликопротеинов сыворотки крови у практически здоровых лиц и больных внебольничной пневмонией с использованием лектина конканавалина А и определить в них количество углеводных компонентов.
Изучить динамику изменения гликопротеинов сыворотки крови по соотношению их углеводных компонентов у практически здоровых лиц и больных внебольничной пневмонией в зависимости от формы, степени тяжести и характера течения заболевания.
Исследовать изменение активности лизосомальных ферментов сиалидазы (КФ 3.2.1.18) и a-L-фукозидазы (КФ 3.2.1.51) у больных с различной степенью тяжести негоспитальной пневмонии.
Провести корреляционный анализ результатов исследования гликопротеинов сыворотки крови с использованием лектина конканавалина А с известными методами определения гликопротеинов и общепринятыми для пневмонии лабораторными тестами.
Научная новизна.
Впервые получены комплексные данные об изменениях количественного и качественного состава сывороточных гликопротеинов у практически здоровых лиц и больных внебольничной пневмонией с определением содержания ССК, ОССК, БССК, ОСФ, БСФ, БСГ, гексозаминов, активности сиалидазы и фукози-дазы сыворотки крови.
При анализе соотношений БССК/ССК, ОССК/ОСФ, БССКУБСФ, БСГ/БССК и гексозамины/БССК, установлен относительный рост остатков сиаловых кислот в выделенных препаратах гликопротеинов сыворотки крови больных негоспитальной пневмонией и преобладание ССК при тяжелой степени тяжести заболевания, что свидетельствует об увеличении катаболических процессов по мере утяжеления пневмонии.
Впервые разработан экспресс - метод количественного определения гликопротеинов сыворотки крови у здоровых и больных негоспитальной пневмонией с использованием лектина конканавалина А, доказана возможность использования данного метода для оценки общего количества сывороточных гликопротеинов, а следовательно, и степени острофазового ответа организма при пневмонии.
Установлена зависимость исследуемых показателей от степени тяжести, площади поражения легочной ткани, формы и характера течения негоспитальной пневмонии, доказана возможность использования данных исследований для раннего прогнозирования затяжного течения заболевания.
Представлены результаты корреляционного анализа исследуемых показателей и основных гематологических и биохимических тестов, широко используемых для диагностики негоспитальной пневмонии, выявлено изменение диагностической значимости некоторых общепринятых методов лабораторной диагностики пневмоний.
Практическая значимость.
Результаты проведенных исследований расширяют имеющиеся представления о патохимии гликопротеинов при негоспитальной пневмонии, позволяют обосновать анализ компонентов гликопротеинов сыворотки крови в ходе клинического наблюдения за больными.
Установлено, что показатели обмена гликопротеинов являются маркерами нарастания тяжести патологического процесса и позволяют прогнозировать затяжное течение пневмонии на ранних этапах диагностики с целью своевременной коррекции схемы лечения.
В целях экономии времени на исследование и уменьшения расходования реактивов модифицированы существующие методы анализа гликопротеинов сыворотки крови. Разработан новый метод выделения и характеристики гликопротеинов сыворотки крови с использованием лектина конканавалина А, обос- новано его использование для оценки степени тяжести, площади поражения легочной ткани и раннего прогнозирования затяжного течения пневмонии. Основные положения, выносимые на защиту:
В сыворотке крови больных негоспитальной пневмонией обнаруживаются изменения количественного и качественного состава гликопротеинов. Повышение общего количества гликопротеинов проявляется статистически достоверным увеличением уровня БСГ, БССК, БСФ и гексозаминов в сыворотке крови больных. Изменения качественного состава гликопротеинов происходят вследствие отщепления терминально расположенных остатков сиаловых кислот и фу-козы под действием ферментов сиалидазы и фукозидазы, активность которых увеличивается в сыворотке крови больных, что сопровождается нарастанием концентрации продуктов катаболизма гликопротеинов — ССК, ОССК, ОСФ.
В результате анализа корреляционных связей между исследуемыми показателями, обнаружено наличие прямых сильных связей между содержанием в сыворотке крови БСГ, БССК, БСФ и гексозаминов с одной стороны, и оптической плотностью раствора конканавалин А — гликопротеины, что позволяет предложить турбидиметрический метод исследования гликопротеинов с использованием лектина конканавалина А для оценки общего количества гликопротеинов в сыворотке крови здоровых и больных негоспитальной пневмонией.
Содержание отдельных компонентов обмена гликопротеинов закономерно изменяется в зависимости от степени тяжести, площади поражения легочной ткани, формы и характера течения заболевания, что может быть использовано в качестве дополнительного биохимического критерия при лабораторном мониторинге негоспитальной пневмонии.
Внедрение результатов в практику.
В клинико - диагностических лабораториях ГУЗ РКБ № 1 и МУЗ МСЧ № 3 г. Ижевска Удмуртской Республики внедрено информационное письмо «Методы исследования показателей обмена сиаловых кислот в биологических жидкостях» (Ижевск, 2001).
Модифицированные лабораторные методы исследования гликопротеинов сыворотки крови используются в качестве дополнительного теста в оценке состояния больных, а также в учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПК и ГШ Ижевской государственной медицинской академии.
На основании полученных результатов в лечебно - профилактических учреждениях Удмуртской Республики рекомендовано к внедрению рационализаторское предложение «Экспресс - метод определения гликопротеинов сыворотки крови» (2002, № 09.02).
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы доложены на научно — практической конференции «Молодые ученые на рубеже веков (Ижевск, 2000), конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири (Ижевск, 2001), на научно - практических конференциях «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2000, 2001, 2002, 2003).
Окончательный вариант работы обсужден на межкафедральном заседании Ижевской государственной медицинской академии. (Ижевск, 2004).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 167 отечественных и ПО зарубежных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 10 диаграммами и 1 рисунком.
Гликопротеины сыворотки крови
Гликопротеины - это углеводсодержащие белки, к полипептидной цепи которых в разных участках ковалентно присоединены олигосахариды, состоящие из: гексозаминов (глюкозамин, галактозамин, маннозамин), гексоз (глюкоза, манноза, галактоза), пентоз (ксилоза, арабиноза), дезоксисахаров (фукоза, рамноза) и производных нейраминовой кислоты (сиаловых кислот) (Готтшалк А., 1969; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981). Общее содержание углеводов, сиаловых кислот и количество точек гликозилирования в молекулах отдельных гликопротеинов различно, в частности, для серомукоида эти параметры составляют соответственно 44, 12 и 5%. В составе одной углеводной цепочки гликопротеина содержится от 2 до 15-20 моносахаридных остатков, а общее число олигосахарид-ных цепей в молекулах гликопротеинов может доходить до 300-800 (Видершайн Г.Я., 1980).
По своему строению углеводный компонент гликопротеинов состоит из относительно однообразной центральной части - кора, и гетерогенных периферических цепей различной степени разветвленности (микрогетерогенность) (Новикова Л.И., Алешкин В.А., 1991).
Многие авторы неоднозначно оценивают роль олигосахаридов в жизнедеятельности целой молекулы гликопротеина. Так, по мнению Р. Хьюз (1985) и J. Montreuil (1982) углеводная цепь несущественна для гликопротеинов, что в настоящее время опровергнуто экспериментальными данными.
A.G. Morell е. а. (1971) доказали, что углеводный компонент играет важную роль в катаболизме гликопротеинов. В частности, при отщеплении от них сиаловых кислот обнажаются концевые галактозные остатки, и гликолротеин поглощается печенью посредством gal-специфичных рецепторов, что приводит к уменьшению времени полужизни гликопротеина в крови (Koolman J., 1998). При различных патологических состояниях, в частности при раке, повышается активность ферментов гликозил - и сиалилтрансфераз, а также 3 - галактозидаз в сыворотке крови, что приводит к изменению углеводной части гликопротеина (1р С, Dao T.L., 1977).
Количество углеводных остатков и их качественный состав влияют на кон-формацию белковой части молекулы, определяют антигенную специфичность белков, их сродство к биомембранам (Baenziger J.U., 1985). По мнению ряда авторов, углеводный компонент играет важную роль и в функционировании гли-копротеинов. Так, P.N. Bories е. а. (1987) обнаружили, что различающийся по углеводным цепям серомукоид в различной степени подавляет активность ин-терлейкина-1. А при отщеплении концевых сиаловых кислот и галактоз от молекулы серомукоида усиливается его иммуносупрессивная активность (Bennett М., Schmid К., 1980).
Гликопротеины широко распространены в природе и входят в состав клеточных мембран, межклеточного вещества, группоспецифических белков крови, секретов желез, гормонов (гонадотропин, эритропоэтин, фолликулостимули-рующий гормон), ферментов (холинэстераза, церулоплазмин), факторов свертывания и т.д. (Анасашвили А.Ц., 1968; Варбанец Л.Д., 1981).
Первые данные о составе гликопротеинов сыворотки крови были получены в конце XIX - начале XX века. Их неочищенный препарат назвали орозомукои-дом, или серомукоидом. В 1953 году K.Schmid препарат серомукоида очистил до гомогенного состояния и назвал его сц-кислым гликопротеином. В дальнейшем этот препарат удалось разделить еще на ряд фракций с молекулярной массой от 40000 до 44100 дальтон (Готтшалк А., 1969; Карпищенко А.И., 1999; Камышников B.C., 2000).
Углеводы в составе серомукоида находятся в виде 1-8 олигосахаридных цепей, связанных с белковым компонентом через остатки аспарагина (Видершайн Г.Я., 1980; Jeanloz R.W., 1963). Моносахаридные остатки в составе серомукоида представлены гексозаминами, галактозой, маннозой, сиаловыми кислотами и фукозой (Гуляев К.Г. с соавт., 1983). Количество гексозаминов, сиаловых кислот и общее содержание углеводов в сц-кислых гликопротеинах плазмы крови чело
века составляет соответственно 14,7, 12 и 44 % (Новикова Л.И., Алешкин В.А., 1991).
Углеводный компонент, особенно сиаловые кислоты, участвуют в стабилизации молекул этих сложных белков. Частичная потеря углеводного компонента ведет к уменьшению времени полураспада оц-кислых гликопротеинов (Morell A.G., 1971).
Концентрация серомукоида в плазме крови составляет от 0,2-0,4 г/л (Кар-пищенко А.И., 1999), до 0,4-1,3 г/л (Шевченко О.П., 1996).
Что касается функциональной роли серомукоида, то по данным различных авторов, он выполняет функцию транспортного белка (Peters Т., 1983), иммуно-модулятора (Лютов А.Г. с соавт., 1992; Costeilo M.G. е. а., 1984), регулятора воспалительного процесса (Алешкин В.А. с соавт., 1988), митоза (Watanabe М., е. а., 1986), клеточных функций (Schreiber G., 1987), обладает антигепариновой активностью, ингибирует агрегацию тромбоцитов (Шевченко О.П., 1996).
Серомукоиды плазмы крови синтезируются в печени, их уровень резко увеличивается при опухолях, воспалительных заболеваниях, нарушениях функций желёз внутренней секреции. Снижение уровня этого белка наблюдается при патологии печени (Карпищенко А.И., 1999).
Одним из основных ингибиторов протеиназ сыворотки крови является сц-антитрипсин - гликопротеин с молекулярной массой 45-55 кДа, содержащий 12-14% углеводов. Концентрация его в плазме крови составляет 0,78-2,5 г/л (Карпищенко А.И., 1999), а по данным Шевченко О.П. (1996) - 1,4-3,2 г/л.
Этот гликопротеин быстро и необратимо ингибирует нейтрофильную эла-стазу, специфически связывает нейтральные протеазы из лизосом лейкоцитов, коллагеназу (Алешкин В.А. с соавт., 1988; Gadek J.F. е. а., 1981).
В физиологических условиях система протеиназы - ингибиторы протеиназ находится на минимальном стационарном уровне с незначительным преобладанием ингибиторного потенциала (Пилипчук В.Н., Бутейн С J-L, 1987; Кубышкин А.В., 1988).
Лектины: современные представления, характеристика, использование для определения гликопротеинов сыворотки крови
Лектины - это группа белков неиммунного происхождения, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры (Луцик М.Д. с соавт., 1981; Лахтин В.М., 1987; Horejsi V., 1974; Brown L е. а., 1978; Etzler М.Е., 1985).
Термин «лектин» (от латинского legere - выбирать), предложенный в 1954 году У. Бойдом, пришел на смену употреблявшемуся ранее термину «фитоге-магглютинин». Традиционно в сокращенных названиях многих лектинов используется также термин «агглютинин», Несостоятельность этих терминов вскрылась в связи с обнаружением лектиноподобных молекул, помимо растений, также в составе вирусов, бактерий, в тканях животных и человека. Кроме того, не все лектины агглютинируют эритроциты, т. е. соответствуют термину «гемагтлютинин». X. Франц и др. (1979) предложил объединить лектины с угле-водсвязывающими иммуноглобулинами и ферментами - гликозидазами в единую группу белков — аффинитинов, общим и определяющим свойством которых является способность к узнаванию углеводов и обеспечению специфического углевод белкового взаимодействия (Лахтин В.М., 1987).
Начало исследования лектинов было положено в 1888 году работами Г. Штильмарка, который установил, что токсическое вещество бобов клещевины вызывает агглютинацию эритроцитов и их гемолиз. Первое научное сообщение о наличии токсических экстрактивных веществ в семенах клещевины обыкновенной Ricinus communis было сделано в 1879 году Г. Риттхаузеном. П. Эрлих, иммунизируя мышей токсином клещевины и абруса, открыл феномен нейтрализации токсина антителами и предложил метод количественного определения антител. Дальнейшие исследования в области лектинов продолжались школой К. Ландштейнера. Новый интерес к лектинам привлекли работы У. Бойда (1949) который при систематическом поиске обнаружил агглютинины, специфичные к группам крови (Луцик М.Д. с соавт., 1981). За истекшие 100 лет с момента открытия рицина представления о распространении лектинов в живой природе, их строении и роли в жизнедеятельности, аспектах практического применения в биологии и медицине значительно расширились. Так, если с 1888 по 1965 годы в чистом виде было получено только три лектина, то к концу 1980 года было очищено уже 104 лектина, а к 1987 году - более 500 (Луцик М.Д. с соавт., 1981; Лахтин В.М., 1987). Мощным стимулом в развитии лектинологии послужили работы М. Брюгера с соавт. (1968), вскрывшие важную роль лектиновых рецепторов в механизмах межклеточного узнавания.
Важнейшей характеристикой лектинов является специфичность взаимодействия с углеводами. Представления об углеводной специфичности лектинов постоянно углубляются и претерпевают изменения: от представлений о лектинах как специфичных к моно- и дисахаридам белках (Луцик М.Д. с соавт., 1981; Лахтин В.М., 1987; Goldstein I.J., Poretz R.D., 1986; Salahuddin А., 1992), к представлениям о лектинах как олигосахарид/гликопептид - специфичных реагентах (Gallagher J.Т., 1984; Wu A.M. е. а., 1988; Debray Н., Montreuil J., 1991).
Классификация лектинов по углеводной специфичности предполагает выделение групп лектинов, специфичных к D- галактозе (лектин клещевины, лектин арахиса и др.), D-маннозе, М-ацетил-О-галактозамину ( лектин сои и др.), N-ацетил-О-глюкозамину, L-фукозе (лектин бобовника, лектин утесника и др.), N-ацетилнейраминовой ( сиаловой ) кислоте ( лектин камбала, лектин омара ), а также со смешанной специфичностью ( лектин чечевицы, лектин завязей пшеницы, конканавалин А и др. ) (Лахтин В.М., 1987; Franz Н., 1982).
По структуре лектины - это сложные белки, содержащие в качестве небелковых компонентов углеводы и ионы металлов (кальция, марганца, в меньших количествах — цинка, магния и др.). Их всех известных лектинов только конканавалин А и лектин гороха не содержат углеводов, а следовательно являются простыми белками (Луцик М.Д. с соавт., 1981; Mandal D.K., 1994).
Длина аминокислотной последовательности, качественный и количественный состав доменов различных лектинов сильно варьируют. Однако в любом случае в составе лектинов есть углеводсвязывающий домен или домены, которые являются ключевым признаком принадлежности белка к лектинам, и при этом отличают лектины от ферментов углеводного обмена, которые способны изменять химическую структуру углеводсодержащих лигандов в результате действия каталитического центра фермента. Обратимое взаимодействие лектина с моно-, ди-, олиго- или полисахаридами не приводит к нарушению их кова-лентной структуры (Лахтин В.М., 1994; Mandal D.K., 1994).
Конканавалин А был первым лектином, для которого полностью установлена последовательность аминокислот и пространственная структура молекулы (Reecke G. е. а., 1975).
Молекула конканавалина А построена из четырех идентичных субъединиц с молекулярной массой 25500 Да. При рН среды ниже 6,0 молекула находится в димерной форме, а при рН выше 6,0 — в тетрамерной. Диссоциация тетрамерной молекулы на димеры обусловлена изменением ионизации остатков гистидина, обеспечивающих контакт между димерами конканавалина А. В тетрамерной молекуле конканавалина А имеется 4 центра связывания углеводов (Луцик А.Д., 1989).
Первичная структура субъединицы конканавалина А представлена последовательностью 237 остатков аминокислот. Некоторые полипептидные цепи расщеплены в локусе асп-118-сер-119. Здесь полипептидная цепь выходит за пределы пептидного клубка и легко атакуется протеолитическими ферментами, поэтому при выделении конканавалина А часть цепей может расщепляться (Etzler М.Е., 1985; Mandal D.K., 1994).
Субъединица конканавалина А представляет собой куполообразную белковую глобулу, размером 42x40x39 ангстрем. Особенность вторичной структуры полипептидной цепи заключается в том, что более половины остатков аминокислот образуют цепи с 3 - складчатой структурой. На наружной поверхности молекулы находится шесть антипараллельных J3 - цепей, образованных 64 остатками.
Основные методы лабораторной диагностики при негоспитальной пневмонии
Исходя из поставленных цели и задач, в работе, помимо изучения обмена гликопротеинов, проведен общеклинический и биохимический анализ крови совместно с сотрудниками клинико — диагностической лаборатории МСЧ № 3 г. Ижевска (зав. клинико — диагностической лабораторией И.Н.Меньшикова). Особое внимание было уделено типичным для пневмонии признакам в виде лейкоцитоза, палочкоядерного сдвига, повышения СОЭ, появления токсикоген-ной зернистости в нейтрофилах, снижения количества лимфоцитов, повышение уровня фибриногена, серомукоидов, С - реактивного белка, сь- и у- глобулинов (Сильвестров В.П., 1987; Чиркин А.А., 1992; Синопальников А.И., 2001).
Для количественной оценки клеточного состава периферической крови использовалась капиллярная кровь, стабилизированная калиевой солью ЭДТА. Подсчет клеток крови осуществлялся импедансно — кондуктометрическим методом на гематологическом анализаторе Cobas Micros ОТ 18 (Франция). На этом же приборе проводилось определение гемоглобина цианметгемоглобиновым методом. Скорость оседания эритроцитов определялась унифицированным методом Панченкова (1972). Для подсчета лейкоцитарной формулы использовали унифицированный метод морфологического исследования форменных элементов крови (1979) с окраской по методу Романовского (Меньшиков В.В., 1987).
Биохимические показатели в сыворотке крови определяли с использованием реагентов Human (Германия), по методикам, рекомендованным Международной Федерацией по клинической химии (IFCC) на многоканальном программируемом фотометре FP-901 (Labsystems, Финляндия). Белковые фракции сыворотки крови исследовали на приборе для электрофореза ЭФ - I (Минск) на ацетатцеллюлозных пленках с использованием анализатора фореграмм АФ 1 (Минск). Концентрацию фибриногена определяли известным унифицированным гравиметрическим методом (Карпищенко А.И., 1999). Метод определения общего количества связанных с белками гексоз. Использовали цветную реакцию с орцином после кислого гидролиза бел ков, осажденных этанолом (Карпищенко А.И., 1999).
К 0,1 мл сыворотки крови добавляли 5 мл 95-96% этанола, перемешивали и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин. Осадок повторно взбалтывали и центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин. Надосадок сливали и пробирку переворачивали на 60 сек. на фильтровальную бумагу. Затем осадок растворяли в 1 мл 0,1 М раствора NaOH, добавляли 8,5 мл орцинового реактива (раствор орцина 1,6 г в 100 мл дистиллированной воды смешивали с серной кислотой (60 мл конц. серной кислоты и 40 мл дистиллированной воды) в соотношении 1:7,5). Перемешивали и ставили на водяную баню при 80 на 15 мин. Охлаждали в темноте в ледяной бане и фотометрировали при длине волны 560 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против контроля (вместо осадка 0,1 мл дистиллированной воды). Расчет производили по калибровочной кривой со стандартными разведениями основного калибровочного раствора (45 мг галактозы и 45 мг маннозы в 100 мл дистиллированной воды).
Применяли метод П.Н.Шараева с соавт. (1997), основанный на образовании цветной реакции метилпентоз с сульфгидрильными соединениями при нагревании с серной кислотой.
В две центрифужные пробирки (№ 1 - опыт, № 2 - контроль) наливали по 0,1 мл исследуемой сыворотки крови и по 0,5 мл 95-96% этанола для осаждения фукозосодержащих гликопротеинов, содержимое пробирок перемешивали и через 4-5 мин центрифугировали (3000 об/мин, 10 мин). В осадке (опыт и контроль) определяли содержание БСФ. Надосадки осторожно переливали соответственно в 2 пробирки (№ 3 - опыт, № 4 — контроль). Для осаждения фукозосодержащих олигомеров к надосадкам добавляли по 3,0 мл охлажденного до Ю...20С этанола. Смеси перемешивали и помещали в морозильную камеру ...20С этанола. Смеси перемешивали и помещали в морозильную камеру холодильника на 2-3 мин, затем центрифугировали в этих же пробирках (3000 об/мин 10 мин). Надосадки осторожно выливали. Далее в осадках определяли содержание ОСФ.
Во все полученные осадки (опытные, контрольные) наливали по 0,5 мл 0,1н NaOH. Пробирки с содержимым встряхивали, опускали в воду со льдом и добавляли по 2,3 мл H2SO4, охлажденной до 1-4С. Содержимое пробирок осторожно перемешивали, не вынимая из воды со льдом. Такое же количество кислоты добавляли к стандартным (10, 20, 30 мкг фукозы в 0,5 мл воды) пробам. Затем все охлажденные смеси помещали на 10 мин в кипящую водяную баню, охлаждали до 18-24С. В опытные пробы добавляли по 0,1 мл 3% солянокислого цистеина, перемешивали и оставляли на 60 мин при комнатной температуре. Фотометрировали на КФК-3 при 396 нм против соответствующих контрольных проб. Оптическую плотность стандартных растворов фукозы измеряли при 396 нм против дистиллированной воды и по полученным данным строили калибровочные графики. По ним находили содержание БСФ и ОСФ. Их концентрацию выражали в миллиграммах на 1 л исследуемой биологической жидкости (мг/л).
Исследование содержания белоксвязанных гексоз, белок-, олиго-мерсвязанных и свободных сиаловых кислот, белок- и олигомер-связанной фукозы, гексозаминов, активности сиалидазы и фукозидазы в сыворотке крови здоровых и больных негоспитальной пневмонией
Содержание гликопротеинов в сыворотке крови изменяется при многих патологических процессах в организме, в частности, при воспалительных, опухолевых заболеваниях, после хирургических вмешательств, при эндокринных расстройствах, патологии печени, сердечно-сосудистой системы и т.д. (Хъюз Р., 1985; Новикова Л.И., Алешкин В.А., 1991).
В связи с тем, что в состав гликопротеинов входят олигосахариды, состоящие из гексозаминов (глюкозамин, галактозамин, маннозамин), гексоз (глюкоза, манноза, галактоза), пентоз (ксилоза, арабиноза), дезоксисахаров (фукоза, рамноза) и производных нейраминовой кислоты (сиаловых кислот) (Готтшалк А., 1969; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981), с начала ставилась задача определить общее количество БСГ, БССК, ОССК, БСФ, ОСФ и гексозаминов в сыворотке крови здоровых и больных негоспитальной пневмонией в зависимости от степени тяжести, формы, характера течения и периода заболевания.
Содержание БСГ в сыворотке крови здоровых людей составило в среднем 1120,0+29,7 мг/л, что не противоречит данным других авторов (Анасашвили А.Ц., 1968; Карпищенко А.И., 1998; Шараев П.Н., 2003). У больных пневмонией в начале заболевания выявлено статистически достоверное повышение уровня БСГ по сравнению с контрольной группой. Количество БСГ при легкой степени тяжести негоспитальной пневмонии составило в среднем 1328,8±52,2 мг/л, что на 18,6% больше нормы (р 0,001), при средней степени тяжести — 1443,8±32,9 мг/л, что превышает контроль на 28,9% (р 0,001), при тяжелой степени — 1781,0+93,0 мг/л, что превышает норму на 59,0% (р 0,001). Из представленных в таблице 4.1.1 данных видно, что количество БСГ в сыворотке крови больных нарастает параллельно с увеличением степени тяжести заболевания. Причем, разница в количестве БСГ у больных с легкой и средней степенью тяжести пневмонии составляет всего 8,7% в сторону увеличения при средней степени тяжести и является статистически недостоверной, а при тяжелой степени пневмонии содержание БСГ на 34,0% выше, чем при легкой степени (р 0,001) и на 23,4% выше, чем при средней степени тяжести (р 0,001).
Количество БСГ сыворотки крови изменяется и в зависимости от формы негоспитальной пневмонии. Так, у больных с очаговой формой оно составляет в среднем 1393,7+29,0 мг/л, что превышает контрольные показатели на 24,4% (р 0,001), а с крупозной формой пневмонии — 1791,0±94,9 мг/л, что на 60,0% больше нормы (р 0,001) и на 28,5% больше, чем при очаговой форме (р 0,001),
У больных с острым течением негоспитальной пневмонии количество БСГ сыворотки крови составило в среднем 1344,1±23,5 мг/л, что превышает контрольные показатели на 20,0% (р 0,001), а при затяжном течении содержание БСГ было значительно выше и составило 1831,0±80,5 мг/л, что превысило норму на 63,5% (р 0,001) и оказалось на 36,0% больше, чем при остром течении (р 0,001). Содержание БСГ сыворотки крови у здоровых и больных негоспитальной пневмонией в зависимости от степени тяжести, формы и характера течения заболевания представлено в таблице 4.1.1.
На 10-12-й день лечения во всех группах больных количество БСГ снижалось по сравнению с началом заболевания, и при легкой и средней степени тяжести пневмонии статистически не отличалось от контрольных показателей. При тяжелой степени, у больных с затяжным течением и при крупозной форме пневмонии количество БСГ оставалось на высоком уровне и после 10-12-ти дней лечения.
Содержание БССК сыворотки крови у практически здоровых людей составило в среднем 501,0±7,3 мг/л, что существенно не отличается от данных других авторов (Анасашвили А.Ц., 1968; Шараев П.Н., 1993; Карпищенко А.И., 1998). Как видно из таблицы 4.1.2, по мере утяжеления негоспитальной пневмонии у больных отмечалось увеличение количества БССК в сыворотке крови. Так, у больных с легкой степенью тяжести негоспитальной пневмонии мы определили 559,0±15,2 мг/л БССК в сыворотке крови, что превышает норму всего на 11,6% (р 0,001). При средней степени тяжести количество БССК составило в среднем 620,3±9,2 мг/л, что на 23,8% больше по сравнению с контролем (р 0,001) и на 11,0% больше, чем при легкой степени (р 0,01). При тяжелой степени тяжести пневмонии мы определили 866,0±20,0 мг/л БССК в сыворотке крови больных и отметили статистически достоверное (р 0,001) увеличение по сравнению с контролем на 72,9%, по сравнению с легкой степенью тяжести — на 54,9% и по сравнению со средней степенью тяжести — на 39,6%.
