Введение к работе
Актуальность темы. Трансфузионная терапия один из важнейших инструментов современной медицины. Переливание различных искусственных плазмозамещающих растворов (ПЗР) необходимо при терапии многих патологических состояний, в первую очередь, при травмах с массивной кровопотерей, хирургии, лечении пациентов в критических состояниях и т.д. Сегодня существует большое количество таких растворов, обладающих разными физико-химическими свойствами, поэтому эффективность лечения в каждом конкретном случае зависит от правильности их выбора. ПЗР не содержат компонентов гемостаза, поэтому переливание этих растворов приводит к гемодилюции, т.е. разбавлению крови и снижению концентраций всех ее компонентов. Это изменяет состояние гемостаза пациента. Для правильной терапии необходимо знание всех процессов, которые происходят при гемодилюции, однако на сегодняшний день полного понимания этих процессов не существует. Это связано с тем, что система гемостаза очень сложна и даже при разбавлении плазмы одним и тем же раствором, но в разных условиях, получаемые результаты могут быть различны. Кроме непосредственного влияния, которое могут оказывать отдельные компоненты растворов на различных участников системы свертывания, на гемостаз влияет сам процесс разбавления, т.к. в такой многокомпонентной системе как кровь/плазма он приводит к нарушению существующих равновесий между различными реакциями гемостаза. Распространено мнение, что гемодилюция вызывает коагулопатию, связанную со снижением концентраций предшественников факторов свертывания. Такая коагулопатия, действительно, наблюдается при переливании большого объема ПЗР. Однако в целом ряде работ на сегодняшний день показано, что умеренное разбавление плазмы, в первую очередь, кристаллоидными растворами может вызывать состояние гиперкоагуляции, которое регистрируется не только in vitro, но и in vivo, увеличивая, например, частоту возникновения тромбозов глубоких вен. Изучение причин такого нарушения и его влияния на функционирование системы свертывания является важной и актуальной задачей, которая может помочь в правильности выбора инфузионной стратегии. Кроме того, понимания механизмов, приводящих при гемодилюции к нарушению равновесия в системе свертывания, может помочь в правильной модификации существующих ПЗР с целью создания нового поколения таких растворов, переливание которых, даже в относительно больших объемах, будет вызывать меньшие нарушения гемостаза.
Цель работы. Исследовать изменения гемостаза, вызываемые гемодилюцией, и разработать пути модификации стандартных плазмозамещающих растворов для возможной коррекции этих изменений.
Задачи исследования:
1. Экспериментально изучить изменения коагуляции, вызываемые процессом гемодилюции, с помощью стандартных коагулогических тестов, а также с помощью новых интегральных методов оценки состояния гемостаза.
2. Разработать принципы коррекции стандартных плазмозамещающих растворов с целью создания ПЗР, не вызывающих нарушений гемостаза при объемных переливаниях.
3. Разработать новые низкомолекулярные ингибиторы тромбина, которые могут быть использованы в составе ПЗР нового поколения.
Научная новизна. В работе предпринято систематическое изучение влияния гемодилюции на состояние системы свертывания при разбавлении плазмы in vitro и in vivo ПЗР разных типов. Показано, что современные интегральные тесты оценки состояния гемостаза – тест генерации тромбина и оригинальный тест измерения скорости роста сгустка в пространстве, которые способны чувствовать как гипо-, так и гиперкоагуляционные сдвиги в системе, регистрируют усиление свертывания при умеренном (до 50-60%) разбавлении плазмы in vitro различными ПЗР, в то время как традиционные коагулогические тесты являются нечувствительными к возникающим гиперкоагуляционным сдвигам, связанным с нарушением баланса про- и антикоагулянтных реакций.
Впервые показано, что коллоидные ПЗР увеличивают скорость полимеризации фибрина в растворах фибриногена, что позволило опровергнуть существующую гипотезу о том, что данные коллоидные растворы ингибируют скорость полимеризации фибрина, ухудшая взаимодействие тромбина с фибриногеном и/или взаимодействие полимера фибрина с фактором XIIIa. Это позволяет предполагать, что причиной образования некомпетентных сгустков в присутствии различных коллоидных растворов является не снижение скорости полимеризации, а образование сгустков сниженного качества.
Существование гиперкоагуляционного состояния при гемодилюции было подтверждено также in vivo в разработанной модели гемодилюции на крысах, а также у здоровых добровольцев без кровопотери и доноров костного мозга с высокой кровопотерей, которым переливали различные объемы ПЗР разных типов.
Таким образом, было показано, что умеренная гемодилюция является риск-фактором возникновения гиперкоагуляционного состояния. Показано, что причиной этого состояния является снижение при разбавлении плазмы концентраций ингибиторов свертывания и что гемодилюционная гиперкоагуляция может быть снижена или полностью отменена при введении в систему дополнительных ингибиторов свертывания, в частности, ингибиторов тромбина. Впервые предложено использовать ингибиторы тромбина в составе кристаллоидных плазмозамещающих растворов.
Использование методов молекулярного лекарственного дизайна и последующего многоступенчатого экспериментального скрининга позволило разработать ряд новых оригинальных низкомолекулярных ингибиторов тромбина, обладающих высокой эффективностью, низкой токсичностью и высокой стабильностью в водных растворах.
Научно-практическое значение. Изучение влияния гемодилюции на систему свертывания крови важно как для фундаментальной, так и для практической медицины. Гемостаз является сложной многокомпонентной биологической системой. Понимание принципов регуляции его функционирования помогает раскрыть общие закономерности в работе таких систем, а, следовательно, правильно определять пути борьбы с нарушениями, которые могут возникать при их работе. С точки зрения практической медицины важно осознание того факта, что умеренная гемодилюция может являться риск-фактором возникновения гиперкоагуляционного состояния. Это помогает правильно выбирать стратегию инфузионной терапии, учитывая свойства конкретных плазмозамещающих растворов. Кроме того, это указывает пути модификации существующих стандартных ПЗР для создания таких растворов, которые будут лишь минимально влиять на состояние системы свертывания при инфузиях. В работе впервые показано, что эти задачи при гемодилюции могут быть решены путем введения в стандартные ПЗР ингибиторов тромбина.
Вторая часть работы посвящена разработке новых низкомолекулярных ингибиторов тромбина, что важно для улучшения возможностей антикоагулянтной терапии. Проведен направленный поиск таких ингибиторов. Научное значение данной работы состоит в разработке последовательной стратегии отбора и направленного конструирования ингибиторов системы свертывания. Принципы этой стратегии могут быть применены не только при создании ингибиторов тромбина, но и для разработки ингибиторов других протеаз системы свертывания крови. Все это открывает путь к созданию новых антитромботических средств, которые призваны улучшить эффективность и безопасность антикоагулянтной терапии. Практическое значение этой части работы в том, что создан ряд принципиально новых, высокоэффективных и безопасных ингибиторов тромбина, которые могут быть использованы как в составе ПЗР, так и как самостоятельные антитромботические препараты.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Умеренное (до 50-60%) разбавление плазмы любым плазмозамещающим раствором in vitro приводит к сдвигу в сторону усиления свертывания.
2. Умеренная гемодилюция (примерно на 25%) физиологическим раствором в модели на крысах in vivo приводит к усилению свертывания.
3. Гемодилюция при переливании ПЗР здоровым добровольцам без кровопотери, а также восполнение кровопотери в ходе эксфузии костного мозга у здоровых доноров вызывают гиперкоагуляционные изменения гемостаза.
4. Добавление в физиологический раствор ингибитора тромбина (как антитромбина III, так и синтетических низкомолекулярных прямых ингибиторов) способно частично или полностью компенсировать гемодилюционную гиперкоагуляцию.
5. Методы лекарственного дизайна (использование программы докинга низкомолекулярных лигандов в активный центр тромбина) и разработанная многоступенчатая стратегия экспериментальной проверки отобранных соединений позволяют провести направленное конструирование новых ингибиторов тромбина и сократить период разработки новых высокоэффективных соединений.
Апробация работы. Работа прошла апробацию на заседании проблемной комиссии №6 «Биохимия, биофизика и реология крови» ГУ Гематологический научный центр РАМН 22 июля 2009 г.
Материалы диссертации представлены автором на следующих конференциях и конгрессах: III Всероссийский съезд гематологов и трансфузиологов, 26-28 ноября 1996 г., Санкт-Петербург; XVIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH), August 14-21, 1999, Washington, DC, USА; II Съезд биофизиков России, 23-27 августа 1999 г., Москва; II Российский конгресс по патофизиологии (с международным участием), 9-12 октября, 2000 г., Москва; XIXth Congress of ISTH, 12-18 July 2003, Birmingham, UK; IX Съезд Федерации анестезиологов и реаниматологов, 27-29 сентября 2004 г., Иркутск; III Съезд биофизиков России, 24-29 июня 2004 г., Воронеж; 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, February 14-18, 2004, Baltimore, MD, USA; II Всероссийская научная конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", 2-4 февраля 2005 г., Москва; XXth ISTH Congress, 6-12 August 2005, Sydney, Australia; семинар "Новые медицинские технологии в акушерстве, гинекологии и неонатологии (методы гемафереза, квантовая гемотерапия, медицинский озон), Москва, 2005 г.; Conference "Mathematical models and methods in biology and medicine", May 29-June 3, 2005, Bedlewo, Poland; VII сессия Московского научного общества анестезиологов и реаниматологов, 24 марта 2006 г., Москва; XIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", 3-7 апреля 2006 г., Москва; III Всероссийская научная конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (с международным участием), 1-3 февраля 2007 г., Москва; IV Международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 12-16 марта, 2007 г., Москва; конференция "Фундаментальные науки - медицине", по программе фундаментальных исследований Президиума РАН, 3-4 декабря 2007 г., Москва; BIT's 5th Anniversary Congress of International Drug Discovery Science and Technology, Serial II: Advances and Challenges Toward Major Diseases, November 7-13, 2007, Xi'an and Beijing, China; XXIth ISTH Congress, July 6-12, 2007, Geneva, Switzerland; workshop "Modeling of Blood Diseases", November 5-8, 2007, Lyon, France; XI Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных "Биология - наука XXI века", 29 октября - 2 ноября 2007 г., Пущино; Международный форум по нанотехнологиям (Rusnanotech), 3-5 декабря 2008 г., Москва; конференция «Органическая химия для медицины», 7-11 сентября 2008 г., г.Черноголовка, Московская обл.; 53rd Annual Meeting of Society of Thrombosis and Haemostasis Research, 4-7 February 2009, Vienna, Austria; XXII Congress of ISTH, July 11-16, 2009, Boston, MA, USA; конференция по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", декабрь 2009 г., Москва; V Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта, 2009 г., Москва; II Международный форум по нанотехнологиям (Rusnanotech), 6-8 октября, 2009 г., Москва; 1st Joint Meeting GTH and NVTH (54rd Annual Meeting of Society of Thrombosis and Haemostasis Research and Symposium of the Netherlands Society of Thrombosis and Haemostasis), February 24-27, 2010, Nrnberg, Germany; XXXIII World Congress of the International Society of Hematology, October 10-13, 2010, Jerusalem, Israel; конференция «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», 6-7 октября 2010 г., Киров; I Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», 17-19 ноября 2010 г., Москва; конференция по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", декабрь 2010 г., Москва; , 3-5 февраля 2011г., Москва; XXIII Congress of ISTH, July 23-28, 2011, Kyoto, Japan; 36th FEBS Congress: Biochemistry for Tomorrow’s Medicine, 25-30 June 2011, Turin, Italy; конференция по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине", декабрь 2011 г., Москва; 58th Meeting of the scientific and standardization committee of the ISTH, 27-30 June 2012, Liverpool, UK.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 83 работы, в том числе 1 книга, 1 глава в книге, 25 статей в реферируемых научных изданиях, 7 патентов и 49 работ в материалах съездов, конгрессов и конференций.
Личное участие автора в получении результатов. Автором была проведена бльшая часть всех экспериментов по исследованию влияния разбавления плазмы in vitro на генерацию тромбина, а также ключевые эксперименты по влиянию гемодилюции на скорость роста сгустка в пространстве (in vitro) и полностью все тромбодинамические эксперименты при работе со здоровыми добровольцами и донорами костного мозга in vivo. Кроме того, автором были проведены ключевые эксперименты по коррекции гемодилюционной гиперкоагуляции добавляемыми в ПЗР ингибиторами тромбина. Автор руководил работой группы сотрудников при разработке модели гемодилюции на крысах и исследовании влияния ПЗР на полимеризацию фибрина. Теоретическая часть работы по разработке новых низкомолекулярных ингибиторов тромбина была выполнена совместно с Научно-Исследовательским Вычислительным Центром МГУ. При этом автор лично участвовал в разработке структур новых ингибиторов. Экспериментальный скрининг отобранных в базах и вновь синтезированных (в Институте органической химии РАН) соединений был полностью выполнен группой под руководством автора. При этом автор лично провел все измерения по влиянию различных ингибиторов на генерацию тромбина.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 279 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, 10 таблиц, 61 рисунка, выводов и списка цитированной литературы, включающего 537 источников.
