Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 17
1.1. Общая характеристика и классификация амилоидозов .17
1.2. Молекулярно-биологические основы амилоидозов 20
1.3. Гемодиализный амилоидоз и бета2-микроглобулин .34
1.4. Структура бета2-микроглобулина и его функции в иммунной системе 38
1.4.1.Структура бета2-микроглобулина .38
1.4.2. Молекула класса I главного комплекса гистосовместимости
1.4.3. Неклассические молекулы главного комплекса гистосовместимости 42
1.5. Клинические проявления бета2-микроглобулинового амилоидоза
1.5.1. Синдром запястного канала 45
1.5.2. Амилоидная артропатия 47
1.5.3. Контрактуры сгибателей пальцев (атрофический тендосиновит) 47
1.5.4. Деструктивная спондилоартропатия .48
1.5.5. Костные кисты 48
1.5.6. Системные (висцеральные) амилоидные отложения .49
1.6. Диагностика бета2-микроглобулинового амилоидоза 50
1.7. Состав амилоидных отложений при бета2-микроглобулиновом амилоидозе .52
1.7.1. Бета2-микроглобулин – основной компонент амилоидных отложений при бета2-микроглобулиновом амилоидозе 52
1.7.2. Гликирование 53
1.7.3. Бета2-микроглобулин с усеченными аминокислотными последовательностями 54
1.7.4. Другие компоненты амилоидных отложений 55
1.8. Зелены флуоресцентные белки в качестве маркеров фибриллогенеза 58
1.9. Особенности содержания цитокинов в плазме крови больных с хронической почечной недостаточностью 62
1.10. Заключение .66
2. Материалы и методы .67
2.1. Получение 2M из ультрафильтрата больных, находящихся на
хроническом гемодиализе .67
2.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле
2.3. Окраска полиакриламидного геля Кумасси R-250 68
2.4. Идентификация выделенного белка методом MALDI-TOF 68
2.5. Получение поликлональных антител кролика к бета2-
микроглобулину человека .69
2.6. Выделение ДНК из замороженной крови .70
2.7. Полимеразная цепная реакция 71
2.8. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% полиакриламидном геле 72
2.9. Окрашивание полиакриламидного геля бромистым этидием 73
2.10. Окрашивание полиакриламидного геля нитратом серебра 73
2.11. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле 74
2.12. Выделение ДНК из агарозного геля .74
2.13. Получение компетентных клеток E. Coli .74
2.14. Лигирование 75
2.15. Трансформация компетентных клеток E. Coli .76
2.16. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. Coli .76
2.17. Секвенирование ДНК .78
2.18. Создание экспрессионной генетической конструкции pETb2m6.8 для получения рекомбинантного полноразмерного бета2-микроглобулина человека 78
2.19. Создание экспрессионных генетических конструкций pETb2m1.1, pETb2m2.1 79
2.20. Создание экспрессионной генетической конструкции pTRCb2msf
2.21. Выделение и очистка рекомбинантного полноразмерного 2M 80
2.22. Выделение и очистка белка слияния 2MSF .81
2.23. Выделение и очистка рекомбинантных 2M6 и 2M10 .82
2.24. Формирование фибрилл 2M 83
2.25. Измерение флуоресценции комплексов тиофлавина Т с фибриллами 83
2.26. Конфокальная микроскопия 84
2.27. Атомно-силовая микроскопия .84
2.28. Western-BLOT 85
2.29. Dot-BLOT 86
2.30. Иммобилизация 2M6 и 2MSF на BrCN-активированной Сефарозе 86
2.31. Исследование содержания цитокинов в плазме крови больных на хроническом гемодиализе 87
3. Результаты и обсуждение .88
3.1. Получение 2M из диализата больных на хроническом Гемодиализе .88
3.2. Получение рекомбинантного полноразмерного 2M человека .94
3.3. Получение генетических конструкций, кодирующих укороченные варианты 2M 100
3.4. Оптические свойства исходных препаратов 2M и фибриллярных форм белка 104
3.5. Получение рекомбинантного белка слияния 2MSF .113
3.6. Гуморальный иммунный ответ на фибриллы 2М .122
3.6.1. Деполимеризация «кислых» фибрилл 2М в физиологическом растворе .125
3.6.2. Обнаружение специфических антител кролика к фибриллам 2M 127
3.6.3. Перекрестное реагирование антител к фибриллам 2M с фибриллами другого происхождения .128
3.6.4. Неспецифическое связывание фибриллами 2M иммуноглобулинов класса G 129
3.7. Содержание цитокинов в плазме крови больных находящихся на хроническом гемодиализе .131
4. Выводы .149
5. Список использованной литературы
- Структура бета2-микроглобулина и его функции в иммунной системе
- Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле
- Получение компетентных клеток E. Coli
- Получение рекомбинантного белка слияния 2MSF
Введение к работе
Терминальная стадия хронической почечной недостаточности - тяжелое, угрожающее жизни состояние, требующее замещения утраченной почечной функции. Актуальность проблемы замещения функции почек обусловлена значительным увеличением числа таких больных во всем мире.
Во второй половине 20 века в связи с разработкой новых технологий появилась возможность продления жизни больным, страдающим тяжелыми заболеваниями почек. Введение в практику процедур очистки крови при помощи диализа позволяет больным, которые прежде неизбежно погибали, относительно комфортно жить в течение десятилетий. Однако вскоре после введения в практику гемодиализного лечения было обнаружено, что у части больных развивается особая форма амилоидоза, так называемый гемодиализный амилоидоз, или (32-микроглобулиновый амилоидоз (AJ32M). Он носит вторичный характер и его условием служит повышение концентрации в плазме крови особого белка - (32-микроглобулина (|32М). Нарушение почечного катаболизма |32М является причиной многократного возрастания содержания белка в плазме крови. Клинически AJ32M сопровождается снижением качества жизни больных, и для купирования симптомов амилоидоза приходится прибегать даже к хирургическому лечению. Диагностика AJ32M затруднена, терапия мало эффективна. До сих пор остаются недостаточно исследованными молекулярные основы патогенеза AJ32M.
Гемодиализ - пример инвазивной терапии. Так как эта процедура проводится у больных с почечной недостаточностью, то необходимо четко представлять вклад основного заболевания и проводимых лечебных мероприятий в развитие ответных реакций в первую очередь со стороны иммунной системы.
Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор не решены многие фундаментальные проблемы развития амилоидозов вообще и AJ32M в частности. В основе патогенеза амилоидозов лежит аномальный фибриллогенез конкретного белка, который обусловлен действием совокупности внешних и внутренних факторов. Выяснение роли этих факторов и их относительного вклада позволит не только понять причины патологии, но и будет способствовать разработке эффективных способов лечения этих достаточно тяжелых заболеваний.
Цель исследования
Целью настоящего исследования являлось выяснение особенностей фибриллогенеза |32М и молекулярных основ гемодиализного амилоидоза, а также роли иммунных факторов в патогенезе этого заболевания
Задачи исследования
Получить в очищенном состоянии природный |32М человека и поликлональные антитела к этому белку.
Создать генетическую конструкцию для синтеза нативного рекомбинантного |32М человека в бактериальной системе.
Создать генетическую конструкцию для синтеза в бактериальной культуре рекомбинантного белка слияния, состоящего из |32М и зеленого флуоресцентного белка.
Создать генетические конструкции для синтеза укороченных рекомбинантных |32М, накапливающихся в клетках в виде телец включения.
Получить в очищенном состоянии и изучить свойства, в том числе фибриллогенность, рекомбинантных бета-2микроглобулинов и белка слияния.
Изучить имунногенность фибрилл, образованных из |32М человека.
Определить содержание цитокинов в плазме крови больных, получающих процедуры гемодиализа на протяжении различных сроков.
Научная новизна полученных результатов
Предложен новый способ препаративного выделения |32М из диализата плазмы крови больных, получаемого во время лечебной процедуры гемодиафильтрации.
Создана экспрессионная генетическая конструкция, содержащая ген полноразмерного |32М человека. Введенная в структуру гена полинуклеотидная последовательность, которая кодирует лидерный пептид, направляющий синтезируемый белок в периплазму, позволяет получать нативный |32М без образования телец включения. Таким образом, исключаются стадии денатурации и ренатурации, необходимые для извлечения белка из телец включения. Благодаря введенной последовательности из пяти гистидинов на С-конце, синтезируемый в E.coli |32М может быть эффективно и просто очищен на никель-хелатном-агарозном сорбенте. Впервые показано, что полученный таким образом белок способен образовывать амилоидные фибриллы, сходные с амилоидными фибриллами, полученными из природного |32М.
Получены генетические конструкции, кодирующие укороченные с N-конца варианты |32М. Показана фибриллогенность и склонность к образованию олигомеров укороченных на 6 и 10 аминокислотных остатков рекомбинантных |32М. Рекомбинантный вариант без 10 аминокислотных остатков получен и охарактеризован впервые.
Впервые создана экспрессионная генетическая конструкция для синтеза в E.coli белка слияния |32М человека с зеленым флуоресцентным белком. Показано, что получаемый белок слияния (32MSF, с одной стороны, обладает зеленой флуоресценцией, свойственной нативному GFP, с другой стороны, (32MSF способен образовывать фибриллы, не теряя при этом своих флуоресцентных свойств.
Впервые продемонстрировано, что фибриллы |32М, сформированные как при рН 2,0, так и при рН 7,4, прикрепляются к нитроцеллюлозному фильтру и не деполимеризуются во время стандартной процедуры Dot-BLOT (то есть при слабощелочных рН). При помощи таких фильтров показано, что IgG кролика не специфически связываются с фибриллами |32М.
Показано, что при гемодиализе у пациентов по мере увеличения сроков терапии возрастает содержание IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в плазме крови. В то же время содержание IL-10 на начальных этапах гемодиализа возрастает, и далее снижается, достигая нормальных значений.
Научно-практическое значение полученных результатов.
Результаты исследования имеют теоретическое значение, так как вносят
вклад в понимание молекулярных и иммунологических механизмов патогенеза гемодиализного амилоидоза, а также других амилоидозов.
Для изучения фибриллогенеза и поиска веществ, ингибирующих данный процесс или способствующих ему, необходимо иметь десятки миллиграммов очищенного |32М. Созданные нами экспрессионные генетические конструкции синтезируют рекомбинантные |32М человека, как полноразмерный, так и его укороченные формы, встречающиеся у больных AJ32M. Благодаря введенным полигистидиновым последовательностям, созданные рекомбинантные |32М можно получить в необходимых количествах и относительно быстро и эффективно очищать. Для всех полученных белков показана способность к образованию амилоидных фибрилл, что позволяет предложить эти белки в качестве удобных моделей для изучения фибриллогенеза |32М.
Обнаружение факта не специфического связывания фибрилл |32М человека с IgG кролика, на наш взгляд, имеет научно-практическую значимость, так как этот эффект следует учитывать при дальнейшем изучении гуморального иммунного ответа на фибриллы |32М. Если существует такое же связывание IgG человека с амилоидными фиблиллами |32М, то это может иметь важное значение в понимании патогенеза AJ32M, а также в подходах к малоинвазивной диагностике данного заболевания. Кроме того, данный факт следует иметь в виду и при разработке таких иммунологических методов диагностики AJ32M, в которых фибриллы |32М будут использоваться в качестве антигена.
Созданный нами рекомбинантный белок слияния |32М и зеленого флуоресцентного белка может быть использован для визуализации промежуточных стадий фибриллогенеза, а также для исследования внутриклеточной локализации как зрелых фибрилл, так и префибриллярных структур.
Результаты, полученные при изучении содержания цитокинов в плазме крови больных на хроническом гемодиализе, позволяют утверждать, что IL-10 и IL-6 могут служить маркерами клинического течения |32-микроглобулинового амилоидоза.
Представленные данные могут быть использованы для образовательных целей на кафедрах высших учебных заведений в курсах лекций по биохимии, молекулярной биологии и иммунологии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Предложен эффективный способ препаративного выделения |32М из
гемодиафильтрационного диализата плазмы крови больных, который позволяет
получать очищенный |32М человека в нативном состоянии.
2. Показано, что созданные экспрессионные генетические конструкции для
синтеза в бактериальной культуре позволяют получать нативный полноразмерный
рекомбинантный |32М человека, рекомбинантный белок слияния (состоящий из
|32М и зеленого флуоресцентного белка), а также укороченные варианты |32М (без
шести и десяти N-концевых аминокислот).
3. Установлено, что все полученные рекомбинантные белки обладают
способностью к фибриллогенезу Для укороченных вариантов |32М, кроме того,
показана склонность к олигомеризации.
4. Показано, что белок слияния (32MSF обладает зеленой флуоресценцией, свойственной нативному GFP, но при этом способен образовывать фибриллы в условиях фибриллогенеза, описанных для |32М.
4. Выявлено, что иммуноглобулины класса G кролика неспецифически
связываются с фибриллами, сформированными из |32М человека.
5. Показано, что с увеличением срока, в течение которого больные подвергались
процедуре хронического диализа, уровни IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF, IFN-y и
TNF-a в плазме крови увеличивались. При этом содержание IL-10 понижалось
после трех лет диализа до уровня, статистически не различающегося с нормой.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: III международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009», 13 международная Пущинская школа-конференция «Биология - наука 21 века» (28 сентября - 2 октября, 2009, Пущино), 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 года), 7 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010», 15-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18 — 22 апреля 2011 года).
Внедрение результатов работы Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процессы отдела молекулярной генетики ГУ Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул.Ак.Павлова, 12); кафедры медицинской биологии и генетики ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Россия, 197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8).
Личный вклад автора в проведение исследования Лично соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях; создание и проверка экспрессионных генетических конструкций, выделение и очистка белков, используемых в работе, получение фибрилл; приготовление препаратов для флуоресцентного анализа, MALDI-TOF и ДНК-секвенировния также были выполнены соискателем. Кроме того, соискатель подготавливал образцы плазмы крови больных на гемодиализе и принимал участие в определении в них содержания цитокинов (совместно со старшим научным сотрудником НМЦММ на базе СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова, к.м.н. К.А.Сысоевым), проводил статистическую обработку полученных результатов. Электронная микроскопия и исследование оптических свойств |32М и его производных, в частности фибриллярных форм, проводились совместно с сотрудниками Лаборатории структурной динамики, стабильности и фолдинга белков НИИ цитологии РАН.
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой
поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 09-04-00788), программы "Ведущие научные школы РФ" (НШ-1961.2008.4) и Минобрнауки (ГК от 09.03.2010 №_02_740_11_ 5141).
Объем и структура диссертации
Структура бета2-микроглобулина и его функции в иммунной системе
Морфологическая картина заболевания, которое в настоящее время известно как амилоидоз, впервые была описана в 1842 году венским патологоанатом К. Рокитанским. Он выявил характерные макроскопические особенности пораженных органов и назвал заболевание «сальной болезнью» (Rokitansky 1842), которую связывал с туберкулезом, сифилисом и другими инфекционными заболеваниями. Вскоре другой не менее известный патолог Р. Вирхов (Virchow 1854 а, б) представил более подробную картину этого вида патологии. Он гистологически обнаружил в пораженных тканях вещество, которому дал название амилоид по способности окрашиваться йодом, аналогично полисахаридам. В двадцатые годы XX столетия была предложена окраска амилоида конго-красным (Comenzo et al., 2006), затем был обнаружен эффект двойного лучепреломления окрашенного амилоида в поляризованном свете – изменение кирпично-красной окраски на яблочно-зеленую. Изначально предполагалось, что амилоид относится к полисахаридам, о чем свидетельствует и его название «сходный с крахмалом» (amylum – крахмал) из-за способности окрашиваться йодом. В 1959 году (Sipe 2000) при электронной микроскопии вещества амилоидных бляшек было установлено, что основным компонентом амилоида являются фибриллярные белковые структуры.
До начала 70-х годов 20 века считалось, что амилоидные фибриллы, обнаруживаемые при различных заболеваниях, образованы одним и тем же белком (Horwich et al., 2002), поэтому ранняя система классификации амилоидозов была основана на локализации амилоидных отложений. Всю группу заболеваний, при которых происходит образование амилоида, было принято обозначать единым термином «амилоидоз» и различать лишь формы амилоидоза, как единого процесса. Со временем при таком подходе в одну «нозологическую единицу» стали попадать клинически совершенно разные патологии, например, болезнь Альцгеймера и системные поражения, типа транстиретинового амилоидоза. Этиология, патогенез, клиническая картина, терапия и прогноз для болезней, связанных с образованием различных амилоидных фибрилл, не могут быть унифицированы. Поэтому к настоящему времени сложилось представление о том, что существуют не разные формы амилоидоза, а разные нозологические единицы - амилоидозы. Их объединяет общая черта - формирование амилоидных отложений, основу которых составляют фибриллы одного из 27 известных на сегодняшний день амилоидогенных белков (Buxbaum 2009). В настоящее время установлено, что амилоидные отложения содержат около 90% основного белка, характерного только для данного типа заболевания, и около 10% составляют другие компоненты, общие для всех амилоидозов (Merlini, Belotti, 2003). Биохимическая идентификация амилоидогенных белков в составе амилоидных отложений позволила ввести современную классификацию амилоидозов, по которой формы заболевания различают по мажорному фибриллообразующему белку.
Современное обозначение амилоидозов строится с учетом названия белка (Picken, 2010, Westermark et al., 2007). Первая буква в названии указывает на то, что это амилоидоз - A (амилоид). Например, AA -амилоидоз, вызванный накоплением сывороточного амилоидного белка A; AL - амилоидоз, обусловленный отложением легких цепей иммуноглобулинов; ATTR - амилоидоз, связанный с фибриллогенезом транстиретина, Aр2M -гемодиализный амилоидоз, связанный с отложением бета-2-микроглобулиновых фибрилл, и т.д.
С клинической точки зрения вполне логично подразделять амилоидозы на первичные, которые часто обусловлены наследственными причинами, и вторичные, возникающие как осложнения других (часто воспалительных) заболеваний. Кроме того, клинической важно различать формы амилоидоза, в зависимости от характера поражения (системные и локализованные) и превалирования определенной симптоматики (с преимущественным поражением нервной ткани, тканей сердца или других органов). При этом необходимо учитывать, что амилоидоз с участием одного и того же белка часто проявляется симптоматикой со стороны разных органов. В ряде случаев эти различия обусловлены генетическими причинами – множественными патологическими аллелями одного и того же гена. В итоге уточненный диагноз должен включать тип амилоидоза (по белку), клиническую форму, а также генетическую составляющую, то есть точную идентификацию мутации при наследственных формах. Такой подход обусловливает диагностический алгоритм для данной группы заболеваний.
Основу любого амилоида составляет белковый компонент. В таблице № 1 приведен список известных к настоящему времени амилоидогенных белков и пептидов. Все эти белки в нормальном состоянии необходимы для жизнедеятельности клеток и целого организма. Для того чтобы белки начали формировать аномальные структуры – фибриллы необходимы соответствующие условия. Эти условия могут быть как внутренними, так и внешними (Шавловский 2010). Если для вторичных амилоидозов наличие таких факторов устанавливается достаточно легко, то для первичных амилоидозов, как правило, эти факторы не известны. Особая роль принадлежит эндогенным, возможно, генетическим факторам (имеется ввиду влияние генотипа больного на течение амилоидогенеза). Даже при наследственных амилоидозах заболевание обычно проявляется достаточно поздно. Пенетрантность для этого типа патологии существенно ниже 100%. Причины такого положения дел до сих пор не вполне понятны. Имеются предположения о существовании белковых внеклеточных факторов, предотвращающих фибриллогенез (Wyatt et al., 2009). Для ненаследственных форм лаг-период также может быть достаточно длительным. Это же характерно и для инфекционного амилоидоза – прионных заболеваний. Поэтому изучение начальных условий фибриллогенеза и влияния различных соединений на этот процесс может пролить свет на закономерности молекулярных основ патогенеза данного вида заболеваний. Знание патогенеза, в свою очередь, является предпосылкой для эффективной терапии и предотвращения формирования аномальных фибрилл.
Особое значение имеет выяснение механизмов клеточной дегенерации в ходе формирования амилоидных отложений. Высказывается мнение, что не сами фибриллы, а префибриллярные формы, возникающие в начальной фазе изменения пространственной организации амилоидогенных белков – играют ключевую токсическую роль в отношении окружающих клеток (Kayed et al., 2006). Апоптоз этих клеток приводит к нарушению функции органов. В то же время объемный процесс, который сопровождает отложение амилоидных структур, также не может полностью игнорироваться.
Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле
В 1985 году был впервые охарактеризован состав фибрилл, выделенных из лучезапястного канала пациентов, находящихся на хроническом гемодиализе (Gejyo et al, 1985). Процедура выделения включала в себя гомогенизацию ткани в PBS, водную экстракцию осадка, растворение фибрилл в 6 молярном гуанидингидрохлориде и гель-фильтрацию. Секвенирование 16 N-концевых аминокислот выделенного мономера позволило идентифицировать белок как 2М.
В том же году Gorevic с соавторами (Gorevic et al, 1985) опубликовал сиквенс первых 30 аминокислот белка, выделенного из головки бедренной кости пациента, находящегося на гемодиализе 10 лет. Фибриллы были экстрагированы 6 молярным гуанидинхлоридом, очищены на колонке Sephadex G-75, уравновешенной 5 молярным гуанидинхлоридом, и полученный материал был проанализирован с помощью электрофоретического разделения в денатурирующих условиях. Размер белка и его частичный аминокислотный сиквенс позволили авторам утверждать, что основным компонентом фибрилл является интактный 2М. В 1986 году та же группа (Gorevic et al, 1986) опубликовала полную аминокислотную последовательность 2М, полученного из фибрилл, выделенных из костного биоптата. В этом случае они опять же заключили, что основным компонентом фибрилл является не модифицированный 2М. Двумерный электрофорез растворенных амилоидных фибрилл выявил присутствие мономеров, димеров и олигомеров 2М с изоформами, имеющими pI 5.7 и 5.3, типичные для нормального 2М (Hall et al, 1977), а также с более кислыми изоэлектрическими точками.
Argiles et al. (Argiles et al, 1995) анализировал амилоидные отложения, удаленные во время операций на лучезапястном канале у 13 пациентов, находящихся на гемодиализе. Амилоид был гомогенизирован в PBS и растворен в 6 молярном гуанидинхлориде. С помощью двухмерного электрофореза было установлено присутствие, различных изоформ 2М с pI 5.7. Полученные белки были очищены гель-фильтрацией (в качестве элюционного буфера использовался 25 мМ имидазол–HCl) с последующим изофокусированием в имидазольном буфере. Аминокислотный сиквенс различных очищенных изоформ показал, что все изоформы соответствуют 2М без аминокислотных замен.
Miyata с соавторами (Miyata et al, 1993) и Niwa с соавторами (Niwa et al, 1995) показали наличие кислых изоформ 2М, полученного из фибрилл, выделенных из тканей лучезапястного канала различных гемодиализных пациентов. Используя иммуногистохимические методы с антителами к гликированным белкам, исследователи показали, что 2М гликирован. Для этого амилоидная ткань была гомогенизирована 0.15 M NaCl, выделенные амилоидные фибриллы были лиофилизированы, а затем растворены в 80% уксусной кислоте в течение 8 часов и подвергнуты гель-фильтрации. В результате были получены мономер и димер 2М, как следует из SDS-PAGE и ESI-LC/MS анализа (Niwa et al, 1996).
Было предположено, что гликирование 2М может быть вовлечено в образование амилоида. Такое предположение было сделано на основании того факта, что амилоидные отложения при деструктивной спондилоартропатии имеют антигенные детерминанты, свойственные гликированным белкам. Была показана провоспалительная роль гликированного 2М и описаны аминокислоты, вовлеченные в этот процесс (Miyata, Inagi, Iida 1994, Miyata, Inagi, Wada 1994). Однако нет доказательств, что гликирование 2М играет роль в патогенезе деструктивной спондилоартропатии. Во-первых, гликированным в амилоидных отложениях может быть не 2М, а, например, коллаген. Во-вторых, если предположить, что в амилоидных отложениях гликирован именно 2М, то остается неясным, происходит ли гликирование мономера, который затем образует фибриллы, или наоборот, уже сформировавшиеся фибриллы подвергаются гликированию. Кроме того гликирование может быть связано с основным заболеванием – диабетом, который часто осложняется почечными нарушениями, требующими терапии гемодиализом.
В 1987 Linke et al. (Linke et al, 1987) впервые обнаружил 2М с усеченными аминокислотными последовательностями в амилоидных фибриллах, выделенных из синовиальной оболочки пациентов, длительное время находящихся на гемодиализе. Фибриллы были выделены водной экстракцией, лиофилизированы и растворены в 80% муравьиной кислоте. Белки были разделены HPLC в 60% муравьиной кислоте и 20% изопропаноле. N-концевой сиквенс двух выделенных белковых фракций (12 и 24 кДа), составляющих основную часть фибрилл, показал, что они являются интактным мономером и димером 2М. Также был обнаружен 2М, в котором отсутствует первые 6 аминокислот. Такой же результат был продемонстрирован теми же авторами на амилоидных фибриллах, выделенных из костной ткани и синовиальных оболочек семи пациентов, проходивших длительную диализную терапию (Linke et al, 1989). При этом анализ ультрафильтратов плазмы показал наличие только интактного 2М. По мнению авторов, это может свидетельствовать об исключении возможности фрагментирования 2М в результате процедуры экстракции. Такой вывод подкрепляется также тем, что на всех стадиях очистки использовались ингибиторы протеаз.
Получение компетентных клеток E. Coli
Полученный ПЦР-продукт был обработан соответствующими эндонуклеазами рестрикции для вставки в плазмиду pET22b(+), обработанную теми же рестриктазами. При помощи реакции лигирования ПЦР-продукт был вставлен в плазмиду. При этом мы столкнулись с некоторыми трудностями. Дело в том, что в результате обработки эндонуклеазой рестрикции MscI образуется «тупой» конец нити ДНК, а в результате обработки HindIII – «липкий» конец. Выбор именно этих сайтов рестрикции был продиктован строением имеющейся в нашем распоряжении плазмиды pET22b(+) и требованиями к получаемому рекомбинантному белку, изложенными выше. Прилагающиеся к лигазе инструкции такой вариант лигирования не предусматривают, и в доступной литературе путей решения данной проблемы мы не нашли. Поэтому нам пришлось подбирать условия лигирования: молярные соотношения ПЦР-продукта и плазмиды, концентрацию фермента, температуру и время реакции, концентрацию полиэтиленгликоля 6000. Успешное лигирование было осуществлено при 4-6 С в течение ночи. Реакционная смесь состояла из 3,3 мкл 10 х буфера для лигирования, 2 мкл лигазы T4 DNA ligase, 100 нг плазмиды, 75 нг ПЦР-продукта, 27,7 мкл дистиллированной воды.
Компетентные клетки Escherichia coli были трансформированы полученной лигазной смесью и нанесены на селективную агарозную среду, содержащую ампициллин. Поскольку Escherichia coli неустойчивы к ампициллину, а плазмида pET22b(+) включает в себя ген бета-лактамазы, то на ампициллиновой среде селективно вырастают клетки, трансформированные данной плазмидой. Для решения вопроса о том, плазмиды каких из выросших колоний содержат необходимую нам вставку (последовательность 2M), мы подвергли плазмидную ДНК 36 колоний рестрикционному анализу. Отбирались клоны, содержащие вставку необходимой длины (около 300 пар нуклеотидов) и сайт рестрикции MscI. Мы уделяли особое внимание сохранению целостности сайта рестрикции MscI в полученных векторах по следующей причине. При лигировании высока вероятность вставления между «тупыми» концами плазмиды и ПЦР-продукта случайных коротких последовательностей. В этом случае с вероятностью 2/3 произойдет сдвиг рамки считывания, и целевой белок не будет синтезироваться. Если длина этой случайной вставки кратна трем, то целевой белок может синтезироваться, но будет иметь дополнительные аминокислоты на N-конце, что для нас нежелательно. Сохранение целостности сайта рестрикции MscI свидетельствовало об отсутствии посторонних вставок между ДНК плазмиды и ПЦР-продукта. В результате из 36 проверенных колоний было отобрано только две.
Плазмидная ДНК отобранных таким образом клонов была просеквенирована. Одна из плазмид содержала последовательность, кодирующую PelB «лидерный пептид», последовательность 2M, а также полигистидиновую последовательность. Все указанные последовательности находились в одной рамке считывания. Эту плазмиду мы обозначили как «pETb2m6.8».
Рекомбинантный 2M получали из клеток E.coli штамма BL21(DE3), трансформированных созданной нами плазмидой pETb2m6.8. Мы сконструировали вектор таким образом, чтобы 2M синтезировался вместе с бактериальным PelB «лидерным пептидом», транспортирующим белок в периплазматическое пространство бактерии, и впоследствии отщепляющимся под воздействием бактериальной протеазы. Это позволяет получить 2M, не содержащий дополнительного метионина на N-конце и начинающийся сразу с изолейцина, первой аминокислоты 2M человека. Как и ожидалось, в периплазме был обнаружен растворимый 2M. Включение в вектор полигистидиновой последовательности на С-конце дает возможность весьма эффективно и быстро аффинно очистить белок на никель-хелатном никель-агарозном сорбенте. Экстракция периплазматической фракции позволяет получить раствор, содержащий целевой белок и до 30% балластных белковых примесей. Аффинная хроматография приводит к полной очистке 2M (Рисунок 4).
Рисунок 4. Результаты электрофоретического разделения белков в 12% ПААГ. Окраска Coomassie brilliant blue R250. 1-маркер молекулярного веса («Fermentas», кат.№ SM1811). Снизу вверх: 11 кДа, 17 кДа, 28 кДа, 36 кДа, 55 кДа, 72 кДа, 95 кДа. 2 – рекомбинантный 2M. 3 – 2M выделенный из ультрафильтрата плазмы больных на гемодиализе. По данным электрофореза полученный нами рекомбинантный 2M мигрирует как белок с кажущейся молекулярной массой около 12 кДа. При этом скорость миграции рекомбинантного 2M несколько замедленна по сравнению с природным белком. Скорее всего, это замедление связано с наличием полигистидиновой последовательности в рекомбинантном 2M, так как аминокислотная последовательность рекомбинантного белка по результатам сиквенса используемой плазмиды не отличается от природного прототипа. В препаратах рекомбинантного белка какие-либо примесные белки не обнаруживаются. Выход рекомбинантного 2M составляет до 3 мг из 1 л суточной культуры бактерий.
По данным электронной микроскопии (рисунок 5), рекомбинантный 2M в соответствующих условиях фибриллогенеза (см. материалы и методы) образует фибриллярные структуры. Наличие амилоидных фибрилл подтверждается и данными анализа флуоресценции тиофлавина Т в комплексе с 2M (рисунок 14). В образцах, содержащих амилоидные фибриллы, мы наблюдали резкое возрастание флуоресценции по сравнению с контролем –мономера 2M, содержащего ту же концентрацию тиофлавина Т.
Рисунок 5. Электронная микроскопия фибрилл рекомбинантного полноразмерного 2M. Масштабная шкала в правом нижнем углу соответствует 100 нм. Таким образам, нами создана экспрессионная генетическая конструкция для синтеза 2M человека в E.coli. Растворимый рекомбинантный белок аккумулируется в периплазматическом пространстве клеток. Благодаря введенной последовательности из пяти гистидинов на С-конце, 2M может быть эффективно и просто очищен на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте. По данным электронной микроскопии и анализа флуоресценции тиофлавина Т, полученный белок способен при определенных условиях образовывать амилоидные фибриллы. Преимущество сконструированного нами вектора pETb2m6.8 и разработанного способа выделения рекомбинантного 2M заключается в получении нативного растворимого белка, не требующего ренатурационных этапов.
Получение генетических конструкций, кодирующих укороченные варианты 2M
В обзоре литературы отражено современное состояние вопроса о наличие в организме человека 2M с усеченными аминокислотными последовательностями. В частности, приведены работы, в которых выделены укороченные формы 2M (без первых шести и первых десяти аминокислот). Эти варианты 2M были выделены из фибрилл, полученных от пациентов, длительное время находящихся на гемодиализе. При этом в крови и моче больных и здоровых людей укороченных форм 2M не обнаруживается. Это может свидетельствовать о возможном вовлечении данных вариантов 2M в патогенез 2M амилоидоза. Поэтому для дальнейшего моделирования фибриллогенеза мы решили использовать не только полноразмерный 2M, но и 2M без первых шести и десяти аминокислот. С этой целью мы создали соответствующие экспрессионные генетические конструкции: pETb2m1.1 для получения рекомбинантного 2M человека без первых шести аминокислот (2M6-1) и pETb2m2.1 для получения рекомбинантного 2M человека без первых десяти аминокислот (2M10-2).
Перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей 2M6, в плазмиде pETb2m1.1 нами был вставлен не бактериальный PelB лидерный пептид, а старт-кодон ATG. В результате белок, синтезируемый полученной экспрессионной генетической конструкцией, имел дополнительный метионин (за счет старт-кодона) на N-конце. В обоих случаях синтезируемый белок формировал тельца включения. В растворимой фракции 2M не обнаруживался.
Очищенные белки в обоих случаях получали из телец включения, которые растворялись 8М мочевиной в присутствии -меркаптоэтанола, затем проводилась аффинная очистка. Полученные образцы анализировались при помощи элетрофореза. Показано, что образцы состояли из мономеров (11 кДа), димеров (23 кДа) и тримеров (34 кДа) 2М6. Кроме того, наблюдалась дополнительная зона, соответствующая молекулярной массе около 25 кДа. Диметры и тримеры образованы из мономеров за счет S-S связей. Комплекс, соответствующий дополнительной зоне, устойчив к восстановлению S-S связей при помощи -меркаптоэтанола (рисунок 9). Это может свидетельствовать о наличии не дисульфидных ковалентных взаимодействий, участвующих в образовании данного комплекса. Аналогичные результаты были получены для 2M10.
Получение рекомбинантного белка слияния 2MSF
Для решения вопроса об аффинности полученных нами анти-ф2M антител к фибриллам, сформированными из других белков или пептидов, мы провели следующий эксперимент. На один НЦФ наносили одинаковое количество (по массе) фибрилл, сформированных из 2M при кислом и физиологическом pH, фибрилл лизоцима, фибрилл инсулина, фибрилл A 25-35, фибрилл A 6-30, фибрилл, сформированных из участка лактальбумина GYDTQAIVENNESTEYG, фибрилл, сформированных из пептида GDIRIDIRIDIRG, мономера 2M, мономера лизоцима, а также пятикратный избыток мономера 2M. Затем осуществляли стандартную процедуру Dot-BLOT с использованием очищенных анти-ф2M антител. В результате окрасились только те зоны НЦФ, на которые были нанесены фибриллы, сформированные из 2M при кислом и физиологическом pH. Это свидетельствует об отсутствии специфического реагирования с фибриллами, сформированными из указанных выше белков и пептидов. А тот факт, что места нанесения мономера 2M и его пятикратного избытка не окрасились, свидетельствует о достаточно полной «очистке» исходной кроличьей сыворотки от антител к 2M.
Аналогично подготовленный НЦФ обрабатывали антителами к мономеру 2M. В результате окрасились те зоны НЦФ, на которые были нанесены фибриллы, сформированные из 2M при кислом и физиологическом pH, а также сам мономер 2M. К нашему удивлению, фибриллы 2M окрашивались заметно интенсивнее мономера той же концентрации и примерно с одинаковой интенсивностью с пятикратным избытком мономера. Такой результат повторялся и при кратных разведениях обоих антигенов.
Как уже сказано, исходным материалом описанных выше эксперименов являлась кровь, полученная после четырех иммунизаций фибриллами 2M. Но нас интересовало, изменится ли сила иммунного ответа при более длительной иммунизации фибриллами 2M. Ведь в организме больных амилоидозом фибриллы персистируют месяцы и годы. Кроме того, нельзя было исключить возможность появления со временем таких антител к фибриллам, которые были бы аффинны не только к фибриллам 2M, но и к фибриллам других белков и пептидов. Поэтому мы иммунизировали кроликов фибриллами 2M без адъюванта еще 7 месяцев через каждые 2-3 недели. На 21-ый день после последней иммунизации осуществили забор венозной крови и отделили сыворотку. Для решения вопроса об аффинности антител в полученной сыворотке к фибриллам, сформированным из 2M и других белков или пептидов, мы провели эксперимент, аналогичный описанному выше. Как и после 4-недельной иммунизации, в данных сыворотках не было обнаружено антител, связывающихся с фибриллами лизоцима, фибриллами инсулина, фибриллами A A 25-35, фибриллами A A 6-30, фибриллами, сформированными из участка лактальбумина GYDTQAIVENNESTEYG, фибриллами, сформированнми из пептида GDIRIDIRIDIRG.
Мы сочли нужным провести контрольный эксперимент для оценки возможности неспецифического взаимодействия фибрилл 2M с иммуноглобулинами класса G. На НЦФ нанесли различные разведения фибрилл рекомбинантного 2M и мономеров 2M, лизоцима, альбумина. Провели Dot-BLOT. В качестве первых антител использовались разведения сывороток кроликов, не иммунизированных 2M или фибриллами (в качестве вторых антител во всех экспериментах использовались меченные пероксидозой хрена антитела козы против IgG кролика). В результате окрасились области НЦФ, на которые были нанесены фибриллы 2M. Эти результаты воспроизводились в нашей лаборатории неоднократно. Скорее всего, их можно объяснить неспецифическим связыванием кроличьих IgG с амилоидными фибриллами 2M. Данный факт в литературе не описан, поэтому мы решили более детально его исследовать.
Во-первых, в нескольких экспериментах использовали в качестве первых антител не сыворотки кроликов, а выделенную из крови кроликов фракцию иммуноглобулинов класса G. Во-вторых, потребовалось исключить у неиммунизированных кроликов наличие специфического гуморального иммунитета против фибрилл 2M. Для этого мы осуществили Dot-BLOT ы с очищенными поликлональными антителами против лактоферрина человека в качестве первых антител. В обоих случаях результаты провторились: окрасились области НЦФ, на которые были нанесены фибриллы 2M и не окрасились области НЦФ с нанесенными мономерами 2M, лизоцима, альбумина.
Во всех описанных выше опытах использовались фибриллы, сформированные из рекомбинантного полноразмерного 2M. Все рекомбинантные 2M были получены нами из клеток E.coli. Поэтому мы решили исключить теоретическую возможность того, что среди фибрилл 2M есть небольшое количество антигенов E.coli, и что с этими антигенами связываются соответствующие антитела кроликов, обуславливая окраску области нанесения фибрилл 2M на НЦФ. Для исключения такой возможности мы сформировали фибриллы из 2M, выделенного из диализата больных на хроническом гемодиализе и повторили описанные выше эксперименты, используя эти заведомо не имеющие антигенов E.coli фибриллы. Как и ожидалось, окрасились области НЦФ, на которые были нанесены фибриллы 2M и не окрасились области НЦФ с нанесенными мономерами белков. Аналогичные результаты были получены и при использовании фибрилл, сформированных из укороченного 2M (без первых шести аминокислотных остатков).
Таким образом мы обнаружили и, как нам кажется, доказали факт неспецифического связывания фибрилл 2M человека с IgG кролика. Это следует учитывать при дальнейшем изучении гуморального иммунного ответа на фибриллы 2M.
К сожалению, нами к настоящему времени не исследован вопрос, есть ли аналогичный эффект с IgG человека. Если существует такое же связывание IgG человека с амилоидными фиблиллами 2M, то это может иметь важное значение в понимании патогенеза 2M амилоидоза, а также в подходах к малоинвазивной диагностике данного заболевания. Кроме того, данный факт следует иметь в виду и при разработке таких иммунологических методов диагностики A2M, в которых фибриллы 2M будут использоваться в качестве антигена.
