Введение к работе
Актуальность проблемы. Основные системы многоклеточного организма - нервная, иммунная, сердечнососудистая и эндокринная - имеют объединяющий механизм, ключевым звеном которого являются пептидные медиаторы. Биологически активные пептиды образуются в организме в результате протеолитического расщепления белков-предшественников. Нередко активность образующихся фрагментов отличается от активности исходного полипептида. Известно, что основные эффекты биологически активных пептидов реализуются через их взаимодействие со специфическими рецепторами. Например, фрагменты молекул белков гистосовместимости I класса, обеспечивающие связывание с Т-клеточным рецептором, ингибируют лизис антигенов цитотоксическими Т-лимфоцитами. В то время как взаимодействие исходных белков гистосовместимости I класса с Т-клеточным рецепторомам приводит к увеличению литической активности цитотоксических Т-лимфоцитов (Clayberger et al., 1994). Таким образом, в некоторых случаях биологические эффекты пептидов антагонистичны эффектам исходной белковой молекулы.
Известно, что биологически активные пептиды служат удобным инструментом изучения того типа рецептора, к которому они проявляют специфичность. В связи с этим характеристика биохимических свойств синтетического пептида октарфина - центрального фрагмента молекулы Р-эндорфина человека, важна и актуальна.
В настоящее время на основе природных пептидных гормонов уже создано и успешно применяется в клинике несколько десятков эффективных и безопасных лекарственных препаратов. Поиск и изучение свойств новых пептидов с простой структурой (состоящих из нескольких аминокислотных остатков), высокой устойчивостью к действию протеаз (долгоживущих) и обладающих ценными фармакологическими свойствами - важнейшая задача современной биохимии. В связи с этим изучение спектра биологической активности и механизма действия октарфина является актуальным исследованием, результаты которого могут быть использованы на практике при создании новых лекарственных препаратов на основе пептидов.
Целью настоящей работы было изучение биохимических свойств синтетического пептида октарфина (TPLVTLFK).
Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:
-
Исследовать связывание меченного тритием октарфина ([ Н]октарфина) с иммунокомпетентными клетками мыши и мембранными фракциями, выделенными из коры головного мозга, миокарда и коры надпочечников крысы.
-
Изучить влияние октарфина на активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo.
-
Изучить влияние октарфина на функциональную активность миокарда крысы in vivo.
-
Изучить влияния октарфина на функциональную активность коры надпочечников крысы in vitro и in vivo.
Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым экспериментальным доказательством того, что синтетический пептид октарфин, соответствующий аминокислотной последовательности 12-19 молекулы Р-эндорфина, обладает иммуностимулирующим действием. Экспериментально показано, что октарфин увеличивает адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов мыши, а также повышает их способность переваривать бактерии вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415 in vitro. Внутрибрюшинное введение пептида приводит к активации перитонеальных макрофагов, а также Т- и В-лимфоцитов селезенки мыши. Показано, что иммуностимулирующее действие октарфина опосредовано через налоксон-нечувствительный (неопиоидный) рецептор Р-эндорфина.
Приоритетными являются результаты исследования
налоксон-нечувствительного рецептора Р-эндорфина мембран, выделенных из
коры головного мозга крысы, полученные с помощью меченного тритием
октарфина ([ Н]октарфина).
Впервые показано, что октарфин обладает выраженным кардиопротекторным и противоишемическим действием. Экспериментально установлено, что он нормализует коронарный кровоток и сократительную активность миокарда, снижает интенсивность цитолиза и перекисного окисления липидов в миокарде, способствует повышению уровня антиоксидантной защиты. С помощью [ Н]октарфина доказана экспрессия неопиоидного рецептора Р-эндорфина на поверхности мембран, выделенных из миокарда крысы, и получены доказательства участия рецептора данного класса в регуляции функций миокарда.
Результаты настоящей работы показывают, что октарфин при связывании с неопиоидным рецептором Р-эндорфина ингибирует аденилатциклазную активность мембран клеток коры надпочечников и блокирует выброс
глюкокортикоидов из надпочечников в кровь. С помощью [ Н]октарфина удалось показать, что кратковременный температурный шок приводит к изменению свойств неопиоидного рецептора Р-эндорфина на поверхности мембран, выделенных из коры надпочечников крысы.
Практическая значимость работы. В виду того, что биологически активные пептиды, производные природных белков, обладают низкой иммуногенностью, токсичностью и аллергенностью (Клуша, 1984), они рассматриваются как потенциальные лекарственные средства нового поколения. Октарфин может служить основой для создания лекарственного препарата, обладающего иммуностимулирующим, кардиопротекторным и стресс-протекторным действием, поскольку доказана способность пептида активировать клетки иммунной системы, увеличивать устойчивость миокарда к гипоксии и ингибировать секрецию глюкокортикоидов из надпочечников в кровь.
Октарфин является селективным агонистом неопиодного рецептора Р-эндорфина, и поэтому он может быть успешно использован в качестве инструмента выявления и исследования данного типа рецептора на различных типах клеток. Характеристика биологических эффектов, возникающих под действием октарфина, позволит расширить представления о неопиоидной составляющей в функционировании пептидного гормона Р-эндорфина.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Карелия, 2011), чтениях памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2011), всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии» (Пущино, 2012), всероссийской молодежной научной школе-конференции "Биология будущего: традиции и новации" (Екатеринбург, 2012), зимних международных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2010, 2011, 2012), на международных научных конференциях «Ломоносов-2010» и «Ломоносов-2011» (Москва, 2010, 2011), Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2010, 2011, 2012).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 24 печатные работы, в том числе 8 статей в журналах из списка, рекомендованного ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов работы, обсуждения результатов работы, выводов и списка цитируемой литературы из 274 наименований. Работа изложена на 160 страницах, содержит 20 рисунков и 17 таблиц.
