Введение к работе
Актуальность проблемы. Натрийуретический пептид В-типа (BNP) относится к семейству пептидных гормонов, сходных по структуре и участвующих в регуляции объема крови, кровяного давления и водно-солевого баланса организма. Помимо BNP, семейство натрийуретических пептидов (НП) включает в себя натрийуретический пептид А-типа (ANP) и натрийуретический пептид С-типа (CNP). Характерной особенностью НП является 17-ти членная кольцевая структура, образованная дисульфидной связью между двумя остатками цистеина. Одиннадцать из семнадцати аминокислотных остатков (а.к.о.) кольцевой структуры у всех представителей семейства НП идентичны, тогда как концевые фрагменты пептидов выраженной гомологии не имеют. BNP синтезируется кардиомиоцитами в форме предшественника, proBNPi_io8, состоящего из 108 а.к.о. Под действием специфической протеазы proBNP расщепляется на два фрагмента -физиологически активный С-концевой фрагмент (BNP77-108) и N-концевой фрагмент (NT-proBNPi.76), физиологическая активность которого к настоящему моменту не установлена. Все три пептида - BNP, NT-proBNP и proBNP присутствуют в кровотоке.
Концентрация BNP и NT-proBNP в крови здоровых доноров не превышает 60 и 200 пг/мл, соответственно. Однако при развитии сердечной недостаточности (СН) уровень синтеза и секреции BNP и NT-proBNP значительно увеличивается и может достигать 7-10 нг/мл в случае BNP и нескольких десятков нг/мл в случае NT-proBNP. СН - сложный клинический синдром, возникающий при нарушении сократительной способности сердца. Наиболее частой причиной СН является снижение способности левого желудочка (ЛЖ) к выбросу крови в аорту. В настоящее время СН является одним из наиболее распространенных осложнений сердечнососудистых заболеваний и оказывает существенное влияние на продолжительность и качество жизни пациентов. Клинические симптомы ранних стадий СН являются неспецифическими, что осложняет диагностику данного заболевания. В настоящее время важным инструментом для исключения СН и оценки дисфункции ЛЖ является определение уровня BNP (или NT-proBNP) с использованием иммунохимических диагностических систем. Применение диагностических систем, разрабатываемых на основе высокочувствительных методов иммуноанализа, использующих моноклональные антитела, является единственным возможным способом количественного определения пептидов, представленных в крови в столь низких концентрациях. Несмотря на широкое применение в клинической практике, до последнего времени практически ничего не было известно о биохимических особенностях BNP, обнаруживаемого в крови человека. Недостаточность знаний о пептиде связана, прежде всего, с его низкой концентрацией в крови и недостаточной
чувствительностью имеющихся в настоящее время методов исследования. Данные о том, в какой форме маркер существует в кровотоке, могут быть полезны как для разработки методов достоверного и надежного определения уровня пептида в крови больных, так и для решения более общих, фундаментальных задач - совершенствования существующей теории функционирования натрийуретических пептидов человека.
Основной целью данной диссертационной работы было изучение биохимических и иммунохимических особенностей BNP человека и его предшественника proBNP с использованием такого высокочувствительного и высокоточного инструмента как моноклональные антитела. Моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с различными эпитопами молекулы BNP, были получены в ходе выполнения данной работы.
Задачи исследования:
Получить и охарактеризовать набор моноклональных антител, специфически взаимодействующих с различными участками молекулы BNP человека.
Создать молекулярно-генетический конструкт для экспрессии рекомбинантного proBNP человека в клетках Е. coli. Разработать метод очистки препарата рекомбинантного proBNP.
На основе метода иммуноанализа сэндвич-типа разработать системы для количественного определения BNP и proBNP в образцах.
4. Исследовать биохимические и иммунохимические свойства BNP и его
предшественника proBNP, присутствующих в крови больных с СН.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения данной работы впервые было показано, что вопреки существующей точке зрения концентрация предшественника BNP (proBNP) в крови больных с СН существенно выше, чем концентрация BNP. Так же установлено, что соотношение proBNP/BNP в крови варьирует у разных больных. Показано, что основная часть молекулы proBNP в крови больных гликозилирована. Показано, что гликозилирование молекулы proBNP на участке с 24-76 а.к.о. препятствует взаимодействию специфических антител с proBNP формой. Поэтому только антитела, специфически взаимодействующие с участком 13-24 молекулы NT-proBNP в комбинации с антителами, специфически взаимодействующими с участком 11-23 или 26-32 молекулы BNP, могут быть использованы для создания системы дифференциального количественного определения молекулы предшественника proBNP. Экспериментально показано, что определение концентрации proBNP в крови больных с СН может иметь клиническую значимость. Эксперименты по изучению стабильности
BNP-иммунореактивных форм выявили, что BNP (синтетическая и эндогенная формы) нестабильны и подвергаются протеолитической деградации в плазме крови, в то время как эндогенная форма proBNP гораздо более устойчива к деградации. На основании полученных результатов нами впервые было предложено использовать гликозилированную форму proBNP, максимально соответствующую по иммунохимическим свойствам эндогенной форме proBNP, в качестве стабильного стандарта в системах для количественного определения BNP. Описанная нами низкая стабильность молекулы BNP позволила нам предположить, что в крови больных значительная часть BNP может присутствовать в виде протеолитических фрагментов. Мы показали, что иммунохимические методы, использующие антитела к С-концевому фрагменту пептида, недооценивают, иногда существенно, концентрацию BNP в образце, подтвердив тем самым предположение о наличии в крови значительного количества фрагментов молекулы BNP. Нами был разработан принципиально новый подход для количественного определения нестабильных молекул, таких как BNP. Предложенный нами иммунохимический метод является гораздо менее чувствительным к протеолитической деградации BNP, так как оба используемых в нем моноклональных антитела специфичны к одному и тому же небольшому и относительно устойчивому к протеолитической деградации фрагменту 11-23 молекулы BNP. Полученные данные могут найти практическое применение при разработке новых систем для количественного определения BNP в образце.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 34-м конгрессе Союза Европейских Биохимических Сообществ в 2009 году (Прага, Чехия), съездах Американской Ассоциации Клинической Химии в 2010 (Анахайм, США), в 2009 (Чикаго, США), в 2008 (Вашингтон, США), в 2007 (Сан-Диего, США) и в 2005 (Орландо, США) годах; на XXXI Конгрессе Клинической Химии Северных стран в 2008 году (Хельсинки, Финляндия); на четвертой Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения в 2008 году (Москва, Россия); на 17-м Европейском конгрессе Клинической Химии и Лабораторной Медицины в 2007 году (Амстердам, Голландия); на Международной конференции «Биотехнология и медицина» в 2006 году (Москва, Россия). Публикации. По теме диссертации было опубликовано 19 печатных работ, включая 5 статей в профильных журналах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, список цитированной литературы. Работа изложена на 140 страницах печатного текста, иллюстрирована 48 рисунками и 12 таблицами. Список цитированной литературы содержит 138 наименований.
