Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Актуальность проблемы нитритных отравлений 11
1.1. Биохимические механизмы токсического действия кислородсодержащих неорганических соединений азота 11
1.2. Влияние нитратов и нитритов на структурно -функциональное состояние эритроцитов 22
1.3. Биохимические механизмы действия перфторорганических соединений 32
ГЛАВА И. Материалы и методы исследования 43
II. 1. Экспериментальные модели и состояние экспериментальных животных 43
II.2. Выделение мембран эритроцитов 44
И.З. Определение активности ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов 45
П.4. Определение компонентов тиол-дисульфидной системы в плазме крови и мембранах эритроцитов 46
П.5. Определение окислительной модификации белков сыворотки крови 48
II.6. Определение концентрации свободного гемоглобина в плазме крови 49
П.7. Определение суммарной пероксидазной активности в плазме крови 50
II. 8. Определение деформируемости эритроцитов 50
II.9. Определение кислотной резистентности эритроцитов 51
II. 10. Определение активности каталазы 52
II. 11. Определение восстановленного глутатиона 53
П. 12. Статистическая обработка экспериментальных данных ... 54
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 55
III. 1. Активность ацетилхолинэстеразы при остром отравлении нитритами и введении перфторана 55
Ш.2. Состояние тиолдисульфидной системы при остром отравлении нитритом натрия и введении перфторана 59
Ш.З. Окислительная модификация белков плазмы крови при остром отравлении нитритами и введении перфторана 69
111.4. Содержание в крови внеэритроцитарного гемоглобина и суммарная пероксидазная активность плазмы крови при остром отравлении нитритами и введении перфторана 79
111.5. Деформируемость эритроцитов при остром отравлении нитритами и введении перфторана 81
111.6. Кислотная резистентность эритроцитов при остром отравлении нитритами 84
111.7. Активность каталазы и содержание восстановленного глутатиона в крови при остром отравлении нитритами и введении перфторана 88
Заключение 91
Выводы 100
Список литературы 101
- Влияние нитратов и нитритов на структурно -функциональное состояние эритроцитов
- Определение активности ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов
- Статистическая обработка экспериментальных данных
- Содержание в крови внеэритроцитарного гемоглобина и суммарная пероксидазная активность плазмы крови при остром отравлении нитритами и введении перфторана
Введение к работе
Актуальность проблемы. Охрана здоровья человека становится актуальной задачей современности. В результате антропогенной деятельности человечество все больше отдаляет себя от природы и условий, которые способствовали формированию в процессе эволюции адаптационных механизмов организма. Человек становится заложником технического прогресса, испытывая давление иных, созданных им самим условий.
Кислородсодержащие неорганические соединения азота (сюда входят азотная и азотистая кислоты, а также их соли: нитраты, нитриты и все оксиды азота) в настоящее время привлекают особое внимание. Они поступают в организм человека в основном с пищей и питьевой водой в виде нитратов и нитритов. Существуют и другие пути поступления этих веществ в организм (через легкие, кожу), однако, играющие относительно незначительную роль (91).
Диоксид азота, попадая в атмосферу с выхлопными газами автомобилей и затем, соприкасаясь с эпителием легких, образует азотную и азотистую кислоты, которые после диссоциации на нитрит и нитрат - ионы способны превращать гемоглобин в метгемоглобин (136,184). Нитраты и нитриты также широко применяются в качестве лекарственных средств - в кардиологии как вазодилататоры, действующие на гладкомышечные клетки вен и артерий (77,139,146,182).
В настоящее время доказано, что нитриты постоянно присутствуют в организме эндогенно, синтезируясь человеком, причем синтез происходит при любом уровне нитратов в пищевом рационе и питьевой воде (7, 188, 195). Целый ряд причин, среди которых на первом месте стоит загрязнение продуктов питания из-за чрезмерного применения азотсодержащих удобрений в сельском хозяйстве, способствует нитрат- нитритным интоксикациям. При этом в организме человека и животных возникают
поражения почти всех органов и тканей (25). Нитраты и нитриты считаются способными вызывать канцерогенные процессы (165).
Одним из проявлений острой и хронической интоксикации нитратами и нитритами является метгемоглобинемия и гемическая гипоксия, что влечет за собой многообразные изменения в органах и тканях.
Гипоксия - одна из важнейших причин и следствие ряда критических состояний. Пусковым механизмом ее является нарушение снабжения тканей кислородом с развитием полиорганной недостаточности. Степень поражения различных органов и систем может различаться, что в значительной мере зависит от исходного состояния и функциональной способности органов и в меньшей степени - от первичного поражающего фактора. Очевидно, что результаты реанимации и интенсивной терапии любого критического состояния в значительной мере определяются своевременностью и адекватностью антигипоксической коррекции. Новым подходом в терапии гипоксических повреждений является разработка класса фармакологических препаратов - антигипоксантов, способных уменьшить или ликвидировать проявления гипоксии, благодаря поддержанию минимально допустимого энергетического обмена в клетке, особенно в раннем постгипоксическом периоде.
Разнообразие и тяжесть возникающих нарушений в организме человека диктуют необходимость разработки комплексных мер и совершенствование лечебно профилактических мероприятий, направленных на снижение последствий нитритных интоксикаций.
Одним из веществ, способных влиять на индукцию монооксигеназных систем являются перфторорганические соединения - плазмозаменители с газотранспортной функцией. Механизм защитного действия перфторуглеродных эмульсий связан не только с газотранспортными и реологическими свойствами, но и с непосредственным взаимодействием перфторуглеродов и проксанолов - компонентов перфторана с мембранами клеток. Эффект стабилизации биологических мембран после контакта с
7 перфторуглеродами установлен на уровне митохондрий, который проявляется как в активации окислительного фосфорилироания, так и в повышении сохранности изолированных митохондрий.
Перфторуглероды и проксанол из состава перфторана также меняют функциональные свойства мембран эритроцитов, повышая их утойчивость к механической травме, к гипо- и гиперосмии, действию детергентов и ионофоров, увеличивают их термостабильную резистентность. Под влиянием перфторана наблюдается стабилизация трансмембранного градиента: К+, Са+, ЇҐ и воды, повышая устойчивость клеточных мембран к действию многих повреждающих агентов, уменшается глубина ацидоза. Описанные эффекты ПФОС позволили нам использовать перфторан при экспериментальном отравлении животных нитритами в эксперименте (46, 63, 69).
Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы явилось изучение биохимических изменений мембран и структурно-функционального состояния эритроцитов при остром отравлении нитритом натрия и введении перфторана. В соответствии с поставленной целью в работе решались конкретные задачи:
Исследовать у животных активность ацетилхолинэстеразы, компоненты тиол-дисульфидного обмена, содержание восстановленного глутатиона, деформируемость и кислотную резистентность эритроцитов при остром отравлении нитритом натрия в дозе ЛД5о.
При модельных условиях эксперимента в плазме крови определить: показатели тиол-дисульфидного обмена, суммарную пероксидазную активность и содержание внеэритроцитарного гемголобина.
Разработать пути направленной регуляции биохимических и структурно-функциональных изменений эритроцитов при острой нитритной интоксикации введением перфторана.
8 Основные положения, выносимые на защиту:
Развитие патогенетических механизмов острой нитритной интоксикации сопровождается структурными изменениями белков сыворотки крови, нарушениями их окислительной модификации и изменениями соотношения количества сульфгидрильных групп и дисульфидных связей белков.
Нитритная интоксикация (нитрит натрия в дозе ЛД50) оказывает существенный мембранотоксический эффект, о чем свидетельствуют угнетение активности ацетилхолинэстеразы, изменения интегральных показателей стойкости эритроцитов (содержания свободного гемоглобина, суммарной пероксидазной активности), уменьшении деформируемости эритроцитов и их кислотной резистентности, а в целом снижением стойкости эритроцитов.
Обоснована целесообразность применения перфторана при острой нитритной интоксикации для коррекции биохимических изменений и структурно-функционального состояния эритроцитов.
Научная новизна:
Впервые изучены биохимические и структурно- функциональные показатели эритроцитов в ранние сроки при остром отравлении нитритами и введении перфторана.
Получены новые результаты об изменении компонентов тиол-дисульфидной системы при остром отравлении нитритом натрия в ЛД50.
Установлено существенное снижение содержания восстановленного глутатиона в ранние сроки после отравления нитритами.
Обнаружено, что использование перфторана оказывает заметное корригирующее действие на содержание востановленного глутатиона и активность каталазы в эритроцитах отравленных животных.
Показано корригирующее действие перфторана на структурно -функциональное состояние мембран эритроцитов после отравления
9 нитритом натрия в ЛД5о- Получены результаты, свидетельствующие о стабилизирующем действии перфторана на компоненты плазмы крови при нитритной интоксикации.
Научно - практическое значение работы:
Полученные в работе данные расширяют наши представления в понимании молекулярных механизмов токсического действия нитритов и формирования компенсаторно-приспособительных реакций, наблюдаемых в условиях гипоксии и метгемоглобинемии. Получены новые данные о биохимических механизмах действия перфторана - перспективного кровезаменителя с газотранспортной функцией, что представляет несомненный интерес для практической медицины.
Практическая значимость данной работы определяется также и тем, что на основании полученных данных могут быть проведены прикладные исследования по использованию перфторуглеродов для коррекции структурно-функциональных изменений эритроцитов при острых отравлениях нитритами.
Результаты работы указывают на целесообразность применения перфторана в качестве препарата, улучшающего структурно-функциональное состояние эритроцитов и использования его в общем комплексе профилактических и лечебных мероприятий при острых отравлениях нитритами.
Полученные в диссертации результаты используются в учебном процессе при чтении лекций по токсикологической химии и биохимии в Дагестанской медицинской академии. Результаты работы вошли в лабораторный практикум по биохимии и сборник тестов по биохимии (Махачкала, 2004г.), которыми студенты пользуются на практических занятиях по медицинской и клинической биохимии.
Апробация работы:
Материалы диссертации докладывались на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава ДГМА (2000 -
10 2004), на конференции молодых ученых ДГМА (2001-2004), на международной научной конференции «Биохимия - медицине», (Махачкала, 2002), на 2-й республиканской научно-практической конференции «Новые технологии в медицине» (Махачкала, 2003), на Всеросс. научн. конф. «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (Томск, 2004), на региональной научно-практической конференции «Диагностика -специфическая форма познания патологических процессов» (Махачкала, 2004).
Влияние нитратов и нитритов на структурно -функциональное состояние эритроцитов
Известно, что различные патологические процессы, в основе которых лежат гипоксия и нарушение клеточного метаболизма, отражаются на функциональных и морфологических свойствах эритроцитов (60,61,62). В свою очередь, изменения формы эритроцитов могут давать определенную информацию о степени выраженности патологического процесса и его природе (131).
Эритроциты обладают мощной системой антиоксидантной защиты. Однако при высокой концентрации свободных радикалов в эритроцитах или недостаточной эффективности первичной антиоксидантной защиты, окислительное повреждение мембранных компонентов эритроцитов приводит к утрате эритроцитами их способности транспортировать ( и СОг и к гемолизу клеток. Индуцированный окислителями гемолиз может возникать также при некоторых заболеваниях, физиологическом старении эритроцитов и в ряде других случаев (162, 1726, 183).
Важной функциональной структурой, определяющей вязкоэластические свойства эритроцитарных мембран является цитоскелет. Это прочная эластическая сеть, образованная белками на внутренней поверхности липидного бислоя мембраны эритроцита (120). Нарушения метаболизма эритроцитов, снижение уровня АТФ, восстановленного глутатиона, активация процессов пероксидации липидов, возникающие при отравлениях, могут привести к образованию сшивок между молекулами белков - структурными компонентами цитоскелета, а это в свою очередь отрицательно влияет на способность эритроцитов к деформации, что является причиной развития гемолитических анемий.
Нормальный эритроцит человека - безъядерная клетка с высоким содержанием гемоглобина и выраженной способностью к изменению двояковогнутой формы при прохождении через кровеносные капилляры. В кровеносном русле при нормальных физиологических условиях, двояковогнутая форма эритроцитов объясняется необходимостью иметь, возможно, большую поверхность для беспрепятственного обмена кислородом между эритроцитами и окружающей средой (60). Такую способность к деформации обеспечивают особенности клеточного скелета и структуры мембран эритроцита за счет взаимодействия между белками мембраны. Дефекты этих белков ведут к морфологическим и функциональным нарушениям эритроцитов (6).
Белки мембраны эритроцита выполняют различные функции: формируют мембранный скелет и определяют форму клетки, обеспечивают транспорт ионов и других веществ через мембрану, образуют рецепторы и антигенные детерминанты (в том числе и, детерминанты многих групп крови), взаимодействуют с компонентами цитозоля и плазмы, а также между собой и мембранными липидами (11).
Реологические свойства крови определяются различными факторами, которые условно подразделяются на гемодинамические, клеточные, плазменные, факторы взаимодействия и внешних условий (105). Ключевая роль в формировании реологического поведения крови принадлежит форменным элементам, и, прежде всего, эритроцитам, на объемную долю которых приходится до 98% (11). Внутриэритроцитарная жидкость, содержащая гемоглобин, имеет вязкость около 7 сПз, что значительно выше, чем значение вязкости цельной крови (59). Механические свойства эритроцитов обусловлены их деформацией, т.е. способностью изменять фориу клетки под действием внешних сил. Это свойство определяет аномальное поведение крови в диапазоне скоростей сдвига от 50 до 150 - 200 с"1.
Во время движения крови по сосудистому руслу эритроциты постоянно находятся в деформированном состоянии, при этом отмечается ротация мембраны относительно внутриэритроцитарного содержимого, этот феномен получил название «гусеница танка» (27), значительно меняется форма и размеры эритроцитов. Особенно существенные изменения формы эритроцитов наблюдаются в микроциркуляторном русле, некоторые капилляры которого имеют диаметр около 2 и менее мкм. Нормальные эритроциты способны значительно деформироваться, не меняя при этом своего объема и площади поверхности (58). Эта особенность движения эритроцитов в потоке имеет чрезвычайно важное значение для поддержания оптимальности процессов диффузии газов (177).
Деформация эритроцитов повышает гидродинамическое перемешивание его цитоплазмы.
Ухудшение деформируемости эритроцитов наблюдается при многих заболеваниях сердечно-сосудистой системы, крови, сахарном диабете, хирургической патологии (42,141,142,159). Механизм действия многих широко используемых фармакологических средств (например, реополиглюкин, гепарин, солкосерил и др.) основан на улучшении реологических свойств крови, и в частности деформируемости эритроцитов (105,192). Это свойство красных клеток крови влияет на проницаемость фибриновой сети внутрисосудистого тромба, что следует учитывать при действии фибринолитических средств (192). Выдвинута гипотеза о ведущей роли неишемическои гипоксии в патогенезе атеросклероза, вызванного нарушением деформируемости эритроцитов (185). Этот параметр является одним из факторов травматического повреждения эндотелия в области разветвления сосудов, стеноза за счет повышения местного напряжения сдвига (144,171). Выявленно ухудшение деформируемости эритроцитов при активации процессов перекисного окисления липидов и снижении факторов антиоксидантной защиты при различных состояниях. Внутриклеточное накопление перекисей липидов, возникающее при аутоокислении полиненасыщенных жирных мембран снижает деформируемость эритроцитов. Активация свободнорадикальных процессов обуславливает гемореологические нарушения, реализуемые через повреждение циркулирующих эритроцитов (потеря мембранных липидов, повышение жесткости билипидного слоя, агрегация мембранных белков), оказывая опосредованное влияние и на другие показатели кислородтранспортной функции крови, и в целом транспорт кислорода в ткани. Установлено, что деформируемость эритроцитов очень чувствительна к свободным кислородным радикалам, что проявляется в увеличении времени их прохождения через поры фильтра и обусловлено перекрестным сшиванием спектрина и гемоглобина (177).
Эритроцитарная оболочка состоит из примембранного слоя -гликокаликса и собственно мембраны. Эритроцитарная мембрана выполняет множество функций, включая барьерную, транспортную, рецепторную, иммунологическую и т.д. (6). Свойства эритроцитарных мембран зависят от их липидного состава (17).
Определение активности ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов
Метод основан на измерении количества образовавшегося тиохолина в результате ферментативного гидролиза ацетилхолина. Измерение активности основано на реакции тиоловой группы с ионом 5,5-дитио-бис-2-нитробензоата.
Тиохолин быстро вступает в необратимую реакцию с ДТНБ, высвобождая окрашенный продукт - 5-тио-2-нитробензоат, имеющий максимум поглощения при длине волны 412 нм. Таким образом, количество прореагировавшего ацетилхолина соответствует количеству образовавшегося аниона 5-тио-нитробензоата. Интенсивность окраски последнего определяется спектрофотометрически ( по методу Масловой, Резника, 1976).
Инкубационная среда для определения активности фермента содержит 2,9 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН = 8,0) и 0,1 мл суспензии исследуемых мембран, содержащий 50 - 70 мкг мембранного белка. Для учета спонтанного гидролиза АТХ ставят контрольную пробу, в которую сразу добавляют 0,02 мл ингибитора холинэстераз - прозерина. Реакцию начинают добавлением в опытные и контрольные пробы 0,5 мл смеси растворов ДТНБ и АТХ (1: 1), приготовленной непосредственно перед употреблением. После тщательного перемешивания пробы инкубируют при 37С в течение 20 мин.
По окончании инкубации гидролиз АТХ, только в опытных пробах, останавливали добавлением 0, 02 мл прозерина. Пробы центрифугируютпри 4000 об/мин в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяют интенсивность желтой окраски аниона 5-тио-2-нитробензоата при длине волны 412 нм. Активность АХЭ выражают в мкмолях тиохолина/мг белка/ч, где АЕ - разность значений экстинкции в опыте и контроле; 3- коэффициент пересчета на 1 ч инкубации; Еем- значение экстинции соответствующее 1мкг тиохолина, находят по калибровачной кривой, 247,1 - молекулярная масса тиохолина, С- содержание белка в пробе, мг.
Количество тиохолина в пробах определяют по калибровачной кривой, построенной по стандартным растворам тиохолина иодида.
Принцип метода, описанный Соколовским В.В.(1977), основан на том, что при титровании растворов, содержащих тиоловые соединения, азотнокислым серебром ионы серебра связываются SH- группами с образованием меркаптида по уравнению: R-SH +Ag+ R-Sag + +H,
где R-SH - соединения, содержащие сульфгидрильные группы; R-SAg -меркаптиды серебра. По достижении конечной точки титрования (когда все SH- группы оказываются блокированными) в растворе появляется избыток ионов серебра. При этом в электрическом элементе, состоящем из погруженных в титруемый раствор платинового индикаторного электрода и электрода сравнения, возникает диффузионный ток, пропорциональный концентрации ионов серебра и измеряемый с помощью миллиамперметра. Содержание SH-групп в исследуемом растворе эквивалентно количеству раствора азотнокислого серебра затраченному на титрование. Чувствительность метода составляет 0,1-1,0 мкмоль SH-rpynn.
Данным методом определяют сульфгидрильные группы низких молекулярных соединений, «свободные» и «вялотекущие» сульфгидрильные группы нативных белков. «Замаскированные» сульфгидрильные группы белков определяются только после их денатурации (Соколовский, 1977).
При определении общего количества SH-групп к 0,2 плазмы добавляли 1 мл 1% раствора до децил сульфата натрия и выдерживали 5 мин при 37С. Затем добавляли 18,8 мл 0,1 М аммиачного буфера рН 9,2 и титровали 0,001 М раствором азотнокислого серебра.
Для определения содержания SH-групп низкомолекулярных тиолов к 0,5 мл плазмы добавляли 0,7 мл Н20 и 0,8 мл 6% раствора сульфосалициловой кислоты. После осаждения белков ( 3000 об/мин, 10 мин) 0,5 мл надосадочной жидкости использовали для анализа количества SH-групп низкомолекулярных тиолов.
При определении S-S связей плазмы титрование проводили в тех же условиях, но в присутствии сульфита натрия.
Количество белковых SH-групп в плазме крови расчитывали как разность между содержанием суммарных SH-групп и SH-групп низкомолекулярных тиоловых соединений. Количество SH-групп выражали в мкмолях SH-групп на 100 мл плазмы крови.
При определении суммарного количества SH-групп белков мембран эритроцитов, их солюбилизировали додецилсульфатом натрия и выдерживали 5 мин при 37 С. Для этого к 0,2 мл суспензии мембран эритроцитов добавляли 1 мл 1% раствора додецилсульфата Na и выдерживали 5 мин при температуре 37С.
Измерение количества свободных (поверхностных) SH-групп в мембранах эритроцитов проводили в 0,4 мл исходной суспензии. По разности между содержанием общих и поверхностных SH-групп, рассчитывали количество скрытых сульфгидрильных групп белков.
Количество S-S связей белков устанавливали после сульфитолиза. При этом к 1, 2 солюбилизированных в додецилсульфате натрия мембран эритроцитов добавляли 0,1 мл насыщенного раствора сульфита натрия и инкубировали 5 мин при 37С, после этого SH-группы титровали, как описано выше.
Количество SH-групп и S-S связей в белках мембран эритроцитов выражали в мкмоллях SH-групп на 1 мг белка мембран. Белок определяли по методу Лоури.
П.5. Определение окислительной модификации белков
сыворотки крови
В результате окисления белков под действием свободных радикалов кислорода образуются альдегидные и кетонные группировки аминокислотных остатков (карбонильные группы), которые взаимодействуют с 2,4-ДФГ с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона (34). Для анализа использовали 0,05-0,1 мл сыворотки крови крыс. Осаждение белков сыворотки крови осуществляли с помощью 20% растрвора ТХУ. К денатурированным белкам приливали равный объем (1мл) 0,1 М 2,4-ДФГ, растворенного в 2М НС1. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем пробы центрифугировали про 3000g в течение 15-20 мин. Осадок промывали 3 раза раствором этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок подсушивали с целью устранения оставшегося растворителя этанол этилацетата и затем растворяли в 8 М растворе мочевины. Мочевину приливали к осадку в объеме 2,5 мл и выдерживали в кипящей бане в течение 5 мин до полного растворения осадка. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре СФ-46. Образовавшиеся 2,4-динитрофенилгидразоны регистрировали при следующих длинах волн; 356 нм (альдегид-динитрофенилгидразоны нейтрального характера); 370 нм (альдегид 49 динитрофенилгидразоны нейтрального характера); 430 нм (альдегидно динитрофенилпроизводные основного характера); 530 нм (кетонодинитрофенилпроизводные основного характера). Уровень карбонильных групп при длине волне 370 нм рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 21000 М"1 «см"1 для ДНФ - производных, и выражали в мкмоль/мг белка.
Статистическая обработка экспериментальных данных
С целью оценки достоверности полученных результатов проводили статистическую обработку по методу малой выборки (Кокунин, 1975). Из всех полученных значений определяли среднее арифметическое М; среднее квадратическое отклонение по формуле: где а - отклонение каждого определения от среднего арифметического М; п - число опытов; среднюю ошибку средней арифметической (среднюю квадратическую ошибку) m по формуле:
При определении степени различия средних арифметических двух сравнительных вариационных рядов находили показатель существенной разницы t по формуле:
Затем на основании t по таблице Стьюдента определяли вероятность различия "Р". При Р 0,05 различие расценивалось как достоверное (т.е. вероятность различия более 95%); при Р 0,01 вероятность различия больше 99%; при Р 0,001 вероятность различия больше 99,9 %.
Ацетилхолинэстераза эритроцитов представляет собой аллостерический фермент, состоит из двух неодинаковых субъединиц и локализованна на наружной поверхности эритроцитарной мембраны. Количество АХЭ в мембране составляет примерно 0,2% от всего мембранного белка. АХЭ прочно асоциирована с мембраной эритроцита и является интегральным белком. Ввиду тесной связи с мембраной АХЭ представляет собой высокочувствительный маркер ее структурного состояния (127).
При исследовании температурных зависимостей трансмембранного переноса анионов была обнаружена связь анионного транспорта с конформационным состоянием мембранной АХЭ. Показано, также, что АХЭ при взаимодействии с ацетилхолином, способна индуцировать генерализованные структурные перестройки эритроцитарной мембраны.
Результаты исследований влияния нитрита натрия на активность АХЭ (табл.1, рис.4) показали, что через 30 мин после введения нитрита натрия наблюдается снижение активности АХЭ, уровень которой, по отношению к контрольным данным составляет 77 %. Через 90 мин происходит дальнейшее снижение активности АХЭ, которая достигает 55% от уровня интактных животных. Таким образом, наблюдается раннее торможение активности АХЭ мембран эритроцитов при остром отравлении нитритом натрия в ЛДбо Вероятно, одной из причин торможения активности АХЭ при острой нитритной интоксикации является мембранолитическое действие продуктов ПОЛ, концентрация которых резко возрастает в уловиях интоксикации. Образование свободных радикалов гидроксила НО, инициирующих процесс свободнорадикального окисления, имеет место при взаимодействии N0? с молекулами воды. Субстратами свободнорадикального окисления становятся белки и липиды клеточных мембран. ивность АХЭ эритроцитов при осіром отравлении нитритами и введении нерфторана
Прежде чем использовать перфторан в качестве корректора активности АХЭ мембран эритроцитов при остром отравлении, нами было проведено исследование влияния перфторана на активность АХЭ у интактных животных. Как показали результаты исследований (табл.2, рис.5), у интактных животных через 3 часа после внутривенного введения перфторана в дозе 1 мл/І00гр в мембранах эритроцитов происходит увеличение активности АХЭ снижается по сравнению с предыдущим показателем (в среднем, на 13%) и показатели приближаются к контрольным значениям.
При введении отравленным нитритом натрия крысам перфторана, через 90 мин наблюдается повышение активности ацетилхолинэстеразы по сравнению с аналогичной группой живтных, которым не вводили перфторан, и составляет в среднем 78% от уровня контроля. Следовательно, активность фермента на 23% выше, чем активность ацетилхолинэстеразы у группы животных с нитритными отравлениями без введения перфторана.
Влияние иерфорана на АХЭ мембран эритроцитов интактных животных.
Таким образом, проведенные исследования, свидетельствуют о положительном влиянии перфторана на активность АХЭ, что может быть одной из причин улучшения состояния животных, что наблюдалось в наших экспериментах.
Механизм защитного действия перфторана, как показали исследования, связан с непосредственным взаимодействием перфторана с мембранами клеток. Положительный эффект перфторана, выражающийся в предотвращении мембранодеструктивных процессов, связан с полифункциональным действием препарата. Во-первых, перфтордекалин, действуя как индуктор микросомальной монооксигеназной системы восстанавливает структуру биомембран, внедряясь в липидный бислой мембран. Кроме того, находящееся в составе перфторана поверхностно-активное вещество проксанол, адсорбируясь на мембране, препятствует поступлению различных токсикантов внутрь клетки, и способствует снижению гемолиза.
Содержание в крови внеэритроцитарного гемоглобина и суммарная пероксидазная активность плазмы крови при остром отравлении нитритами и введении перфторана
Концентрация свободного гемоглобина (ВЭГ) и уровень СПА в плазме крови являются информативными и чувствительными показателями стабильности мембран. Как показали проведенные исследования, содержание ВЭГ достоверно повышается в результате нитритнои интоксикации, причем более существенно спустя 90 мин после отравления. Вероятно, это связано с мембранотоксическим действием нитритов и разрушением мембран эритроцитов и выходом из них гемоглобина, Введение перфторана оказывает заметное корригирующее действие не только на содержание свободного гемоглобина, но и на суммарную пероксидазную активность плазмы крови (табл.14; рис. 17).
Через 30 мин после острого отавления нитритом нитрия в дозе ЛДдо количество свободного гемоглобина в плазме крови увеличивается на 55%, а через 90 мин содержание ВЭГ составляет 181% от уровня контрольной группы животных. Величина СПА плазмы крови через 30 мин после отравления составила 184%, а через 90 мин - 216% по отношению к контролю.
Через 90 мин после введения перфторана отравленным животным, концентрация ВЭГ снижается на 53%, по сравнению с показателем при нитритнои интоксикации через 90 мин, и составляет 128% от исходного уровня. Уровень СПА, составляет 207% от контрольного.
Свободный гемоглобин и железосодержащие продукты его деструкции представляют собой систему усиления токсического эффекта нитритов, вследствии способности гемового железа катализировать процессы ПОЛ.
Таким образом, результаты исследования двух интегральных показателей стойкости эритроцитарных мембран - СПА и ВЭГ показывают, что при остром отравлении нитритами происходят изменения структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов, нарушение их проницаемости. III.5. Деформируемость эритроцитов при остром отравлении нитритами и введении перфторана
Деформируемость эритроцитов - одна из наиболее лабильных характеристик крови, которая чуствительно реагирует на изменения практически любого метаболического процесса в эритроцитах, и в целом организме. Отмечаемое ухудшение деформируемости эритроцитов при различных видах кислородной недостаточности ограничивает оптимальное функционирование системы транспорта кислорода па различных ее уровнях: сердце, сосудистое русло, кислородтранспортная функция крови. В условиях гипоксии изменения показателей кислородтранспортной функции крови, процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы коррелируют с ухудшением деформируемости эритроцитов, что позволяет рассматривать этот показатель как интегральный критерий не только тяжести нарушений кислородного обеспечения, но и прооксидантно-антиоксидантного состояния организма (35, 42, 97, 171). В условиях воздействия нитритами (табл. 15; рис. 18) происходит резкое и достоверное снижение индекса деформируемости эритроцитов через 30 мин почти на 64% и составляет около 46% от уровня контрольных величин.
При введении перфторана индекс деформируемости эритроцитов повышается. В частности, через 3 часа после введения перфторана ИДЭ у отравленных крыс повышается и существенно приближается к показателям контрольной группы животных.
Таким образом, перфторан оказывает выраженный корригирующий эффект на деформационную способность эритроциарных мембран.
Деформируемость эритроцитов формирует кислородтранспортную функцию крови и обеспечивает достижение полезного приспособительного результата системы транспорта кислорода. Оценка данного показателя чрезвычайно важна для характеристики функционального состояния организма (42).
Деформируемость эритроцитов участвует в формировании адекватного потока кислорода в ткани в соответствии с их потребностью в нем, а ее ухудшение содействует перераспрделению использования кислорода с оксидазного пути на оксигеназный. Ухудшение данного параметра отражает нарушение процессов утилизации кислорода в организме. Возникает порочный круг: снижение деформируемости эритроцитов ухудшает транспорт кислорода в ткани, его полноценную утилизацию в тканях, это в свою очередь обуславливает еще более выраженное нарушение этого показателя красных клеток крови. Очевидно, деформируемость эритроцитов является не только важным фактором транспорта кислорода в ткани и обеспечения их потребности в нем, но и механизмом, влияющим на эффективность функционирования антиоксидантной защиты, и в конечном итоге, всей организации поддержания прооксидантно-антиоксидантного равновесия всего организма.
