Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Основные сведения об электронотранспортной и энерго-преобразущей функциях митохондрий 10
1.2. Краткие сведения о механизмах развития кровопотери и геморрагического шока 16
1.3. Энергетический обмен при кровопотере и шоке 19
1.4. Биоэнергетические основы формирования необратимости при терминальных состояниях 30
1.5. Современные методы коррекции нарушений энергетического обмена при шоке 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Характеристика экспериментального материала 43
2.2. Методика воспроизведения геморрагического шока 43
2.3. Методы исследования 46
ГЛАВА 3. Функциональное состояние митохондрий печени кроликов при острой кровопотере
3.1. Дыхательная и фосфорилирущая функции митохондрий печени при кровопотере 52
3.2. Активность полиферментных систем СМЧ печени кроликов при острой кровопотере 65
3.3. Термостабильность полиферментных систем СМЧ печени кроликов при кровопотере 69
3.4. Влияние субстратов окисления на процесс термодегра-дации ПС СМЧ печени кроликов при кровопотере 74
ГЛАВА 4. Функциональное состояние митохондрии печени кроликов при геморрагическом шоке
4.1. Дыхательная и фосфорилирущая функции митохондрий печени при геморрагическом шоке 83
4.2. Активность полиферментных систем СМЧ печени кроликов при геморрагическом шоке 96
4.3. Термостабильность полиферментяых систем СМЧ печени кроликов при геморрагическом шоке 99
4.4. Влияние субстратов окисления на процесс термодегра-дации оксидазных систем СМЧ печени кроликов при шоке 101
ГЛАВА 5. Модификация дыхательной цепи митохондрий печени с помощью соединений 1,4-нафтохинона
5.1. Влияние производных 1,4-нафтохияона на перенос электронов в дыхательной цепи и активность полифермеят-ных систем СМ печени интактных крыс в опытах in vitro 114
5.2. Щунтирование заблокированной цианидом дыхательной цепи митохондрий препаратами 1,4-нафтохинона в опытах in vivo 126
ГЛАВА 6. Исследование влияния препарата ak-i35 на функциональное состояние митохондрий печени кроликов при кровопотере и геморрагическом шоке
6.1. Влияние препарата AK-I35 на дыхательную и фосфорили-рувдую функции митохондрий печени кроликов при кро-вопотере и шоке ( in Vitro) 131
6.2. Влияние препарата АК-І35 на термостабильность полиферментных систем СМЧ печени кроликов при крово-потере и шоке ( in vitro) 133
6.3. Влияние препарата AK-I35 (in vivo) на дыхательную и фосфорилирукщую функции митохондрий печени кроликов с "необратимым" геморрагическим шоком 138
6.4. Активность и термостабильность полиферментных систем СМЧ печени кроликов с геморрагическим шоком под влиянием препарата AK-I35 (in vivo ) 148
6.5. Влияние препарата AK-I35 на продолжительность жизни и выживаемость животных с "необратимым" шоком 153
Заключение 157
Выводы 176
Указатель литературы 178
- Основные сведения об электронотранспортной и энерго-преобразущей функциях митохондрий
- Дыхательная и фосфорилирущая функции митохондрий печени при кровопотере
- Дыхательная и фосфорилирущая функции митохондрий печени при геморрагическом шоке
- Влияние производных 1,4-нафтохияона на перенос электронов в дыхательной цепи и активность полифермеят-ных систем СМ печени интактных крыс в опытах in vitro
Основные сведения об электронотранспортной и энерго-преобразущей функциях митохондрий
Благодаря многичисленным исследованиям, проведенным в различных лабораториях , в настоящее время принято считать, что митохондрии обладают следующими тремя основными функциями: окисление компонентов цикла трикарбоновых кислот, транспорт электронов по дыхательной цепи и окислительное фосфорилирование. Кроме того, они имеют еще и дополнительные функций, такие как набухание и сокращение, активный транспорт ионов, обращенный поток электронов, активный перенос водорода (Д.Грин, Р.Гольдбергер, 1968).
Энергия внешних ресурсов - субстратов окисления - освобождается в процессе переноса электронов по редокс-цепям, которые составлены из окислительно-восстановительных ферментов и кофермен-тов, локализованных во внутренней мембране митохондрий. В той же мембране происходит фосфорилирование АДФ неорганическим фосфатом с образованием АТФ. Этот второй процесс (фосфорилирование) обеспечивается энергией, освобождающейся при переносе электронов.
Большинство исследователей считают, что окислительная цепь организована ассиметрично (P.Mitchell ,1966; Э.Рэкер,1979). Для определения локализации мембранных компонентов используются разные методы. К наиболее информативным подходам относятся: а) использование специфических антител к отдельным компонентам; б) применение непроникающих химических веществ, служащих модификаторами поверхностных компонентов мембраны; в) применение непронйкащйх искусственных акцепторов ЙЛЙ доноров электронов. Полученные с помощью ЭТИХ методов результаты ПОЗВОЛИЛИ представить топографию внутренней митохондриальной мембраны в виде схемы (рис.1). По современным представлениям (Э.Рэкер,1979), сопрягающий фактор Pj и сук-цинатдегидрогеназа расположены на М-стороне мембраны и обращены к матрйксу вместе с другими сопрягающими факторами. Цитохромы с и Cj расположены на С-стороне мембраны и обращены к внешней митохондриальной мембране. Цитохромоксидаза закреплена трансмембранно с цитохромом а на С-стороне и цитохромом ад на М-стороне.
Используя такие субстраты, как сукцинат и аскорбат, которые включаются в дыхательную цепь на уровне переносчиков с менее отрицательным потенциалом, удается проанализировать отдельные сегменты полиферментной системы в интактных митохондриях Й субмито-хондриальных частицах. Важный вклад в эту область внесли Y.Hate-fi с соавт.(І96І), которые разделили окислительную цепь на отдельные комплексы, катализирующие работу индивидуальных сегментов. Выделение этих комплексов упростило подход к идентификаций каталитических компонентов и определению последовательности реакций в процессе переноса электронов.
Осторожная фрагментация мембранных структур митохондрий приводит к выделению четырех типов олигоферментных объединений, каждое из которых содержит комплекс определенных дыхательных ферментов с близким редокс-потенциалом (Д.Грин, С.Флейшер,1964; Д.Грин, Р.Гольдбергер,1968).
Комплекс I катализирует окисление НАД«Н убихиноном. Главный компонент комплекса I - флавопротевд НАД»Н-дегидрогеназа. Комплекс П окисляет янтарную кислоту и восстанавливает убихинон. Он содержит другой флавопротеид - сукцинатдегидрогеназу. Комплекс Ш окисляет убихиноя цитохромом С. Функциональные компоненты комплекса Ш - цитохромы в Й Cj и специфический негемовый железопротеид. Комплекс ІУ - последний в дыхательной цепи - содержит цитохромы а Й ад, а также медь-протеид. Функция комплекса ІУ заключается в окислении цитохрома С молекулярным кислородом.
В известном смысле всю дыхательную цепь можно было бы определить как один фермент - НАД»Н-оксидазу, а отдельные переносчики как субъединицы различной степени агрегации, составляющие натив-яый фермент с очень сложной четвертичной структурой (В.П.Скула-чев, 1969).
Согласно гипотезе П.Митчелла (P.Mitcheii,I96I), дыхание и фосфорилирование связаны между собой через электрохимический потенциал ионов водорода на митохондриальной мембране.
На основании многочисленных экспериментальных данных, полученных в различных лабораториях, основная идея гипотезы П.Митчелла может быть выражена в виде трех основных заключений: I) энер-гизация сопрягающих мембран сопровождается появлением мембранного потенциала; 2) образование мембранного потенциала вызывает энергизацию сопрягающих мембран; 3) снижение мембранного потенциала нарушает сопряженность окисления и фосфорилирования.
По П.Митчеллу (P.Mitchell,1966), дыхательная цепь собрана в виде трех петель. На первом участке НАД Н2 передает с матриксной стороны мембраны 2 атома водорода переносчику, который высвобождает 2 протона с другой стороны мембраны, в то время как электроны по каналу возвращаются обратно через переносчик электронов на мембрану, обращенную к матриксу. Здесь они связываются с протоном среды, и второй переносчик водорода повторяет этот процесс во второй петле, и т.д.
По формулировке П.Митчелла (1966) сопрягающее устройство -олигомицинчувствительный протонный насос - функционирует с участием интєрмєдиатов ХСГ и У", которые под действием мембранного потенциала движутся в направлении от отрицательно заряженной стороны мембраны. Экспериментальных данных в пользу существования таких отрицательно заряженных анионов не существует, но эта концепция представляет остроумную схему, показывающую, как мембранный потенциал может участвовать в химической реакции (Э.Рэкер, 1979).
В утверждении хемиосмотической гипотезы большую роль сыграли исследования отечественных авторов (Е.А.Лйберман, Л.М.Цофина, 1969; E.A.Liberman,V.P.Topali ,1968; В.П.Скулачев,1974), применивших оригинальный метод с использованием синтетических проникающих ионов.
Согласно хемиосмотической гипотезе, важной особенностью сопрягающего устройства является то, что оно представляет собой обратимый протонный насос, т.е. использует поток протонов для генерации АТФ.
Дыхательная и фосфорилирущая функции митохондрий печени при кровопотере
Известно, что при различных патологических процессах нарушение транспорта электронов по редокс-цепи может быть связано с подавлением активности ферментных систем в различных ее звеньях. Предполагалось, что снижение электронотранспортной функции митохондрий печени животных после кровопотери также обусловлено торможением переноса электронов в одном или нескольких участках цепи. В связи с этим представлялось важным исследовать состояние
оксидазных систем митохондрий, непосредственно, участвующих в переносе электронов. Полярографический метод регистрации активности и термостабильности отдельных оксидаз дает возможность установить место и характер происходящих нарушений в дыхательной цепи митохондрий.
Проведенные исследования состояния ПС СМЧ печени контрольных и опытных кроликов позволили установить, что при кровопотере исходные активности оксидаз достоверно снижены по сравнению с нормой (табл.7): НАД«Н-оксидазы на 44%, сукцинатоксидазы - на 41%, цитохром С-оксидазы - на 37,5%. При делении опытных животных на группы по характеру течения процесса оказалось, что при кровопотере, протекающей по благоприятному типу (группа I), нарушения активности указанных ПС выражены в меньшей степени, чем при тяжелом течении процесса (группа П). Так, исходные активности НАД.Н-С , сукцинате02 и цитохром-С были снижены на 44%, р . 0,001, 36%, р 0,05 и 32%, р 0,05. При тяжелом течении кровопотери активности сукцинатоксидазы и цитохром С-оксидазы были снижены не только по сравнению с нормой (на 54%, р 0,01,и 55%, р 0,001 соответственно) , но и по сравнению с данными у животных группы I (на 28,3% и 34,4%, р 0,05).
При определении активности каждой из оксидазных систем (кроме НАД Ор) представляется возможность преимущественного определения активности некоторых из участков редоке-цепи. Так, в случае сукцинатоксидазы измеряется активность звена от убихинона до кислорода, а цитохром С-оксидазы - от цитохрома С до С . Относительно равномерное снижение активности всех исследуемых оксидаз при благоприятном течении кровопотери и более выраженное нарушение активности сукцинат-02 и цитохром С-С при тяжелом течении процесса позволяет предположить, что торможение переноса электронов происходит на цитохромном участке дыхательной цепи. Вероятными причинами этого могут быть либо вымывание цитохрома С из внутренней мембраны митохондрий, либо нарушение его "челночной" функции. Есть указания на солюбилизацию цитохрома С из мембран митохондрий гепатоцитов ишемизированной печени (Т.А.Князева с соавт.,1975) и при терминальных состояниях (Г.Я.Любан с соавт.,1973; Л.В.Слепне-ва с соавт.,1981). В связи с этим добавление цитохрома С к СМЧ печени при измерении активностей НАД Н-оксидазы и сукцинатоксида-зы позволило бы установить роль этого компонента редокс-цепи в происходящих при кровопотере и шоке нарушениях.
Было установлено, что в присутствии цитохрома С происходит резкое увеличение активности НАД-Н-С в СМЧ печени животных всех групп. Информативным оказалось вычисление разницы между оксидаз-ной активностью в присутствии и отсутствии цитохрома С в измерительной среде. Эта разница, обозначенная дА, свидетельствовала об активации процесса переноса электронов экзогенным цитохромом С (см. табл.7).
При измерении активности НАД Н-оксидазы в этих условиях показатель АА у здоровых животных составлял 46,2 нАС /мин/мг белка, а при кровопотере - 32,4, т.е. был снижен на 30%. У животных с благоприятным течением процесса показатель дА был снижен на 23% по сравнению с нормой. У кроликов с выраженным ацидозом активация цитохромом С НАД -Н-оксидазы была снижена на 50% по сравнению с нормой и на 36% по отношению к показателю для группы I.
Стимуляция активности сукцинатоксидазы добавленным цитохромом С при кровопотере была также снижена (на 22,7% по сравнению с нормой, а величина л А была гораздо ниже, чем в случае НАД Н-С , и составляла 9,8 нА0Р/мин/мг белка. У животных группы I показатель А был ниже на 28%, чем у контрольных, а в группе П - на 51% ниже, чем в норме и на 44% по отношению к группе I.
На оснований полученных данных можно заключить, что при кро-вопотере наблюдается снижение активности ПС СМЧ печени, степень которого коррелирует с тяжестью патологического процесса. Добавление экзогенного цитохрома С к СМЧ выявило неодинаковое отношение к нему оксидазных систем: прирост активности НАД Н-оксидазы в этих условиях был значительно выше, чем в случае сукцинатокси-дазы. Вместе с тем этот компонент дыхательной цепи не способен был восстановить нарушенную при кровопотере активность ПС до нормального уровня.
Дыхательная и фосфорилирущая функции митохондрий печени при геморрагическом шоке
Как уже указывалось (см. главу 2), критерием наступления "необратимости" шока служило сочетание спонтанного возвращения в сосудистое русло не менее 1/3 эксфузированной крови со снижением рН артериальной крови до 7,2 и ниже. У исследуемых животных эти показатели соответствовали установленным критериям. Объем реинфу-зированной крови составлял 36,3 і 1,41$, а рН артериальной крови был равен 6,99 і 0,03; температура тела была достоверно снижена в среднем на 3,7С.
Показатели дыхательной и фосфорилирущей функций митохондрий печени кроликов в состоянии геморрагического шока представлены в табл.8. При окислении сукцината митохондриями печени опытных животных выявлено достоверное снижение скоростей потребления Ор (по сравнению с контролем) в состоянии 2 - на 26,4%, в состоянии 3 - на 42%, в состоянии 4 - на 29,7%, а после добавки 2,4-ДНФ -на 37,2%. Отмечено снижение ДК по Чансу и Ларди на 22,5% и 28,4% соответственно. Время фосфорилирования увеличено на 77,7%.
При окислении глутамата митохондриями печени тех же животных также отмечено закономерное снижение показателей дыхания и фосфо-рилирования (по сравнению с нормой): в состоянии 3 - на 38%, в состоянии 4 - на 21,4%, в разобщенном состоянии - на 26,5%. Большая степень снижения скорости дыхания в состоянии 3 по сравнению с состоянием 2 привело к уменьшению ДК по Ларди на 31%. Время фосфорилирования увеличено на 18%. Несколько снижен коэффициент АДФ/0.
Исследование разностных показателей скоростей дыхания митохондрий печени кроликов при геморрагическом шоке показало, что "мощность" и резервные возможности дыхательной цепи достоверно снижены по сравнению с нормой (табл.9).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что нарушения электронотранспортной функции митохондрий печени, возникшие еще на стадии острой кровопотери (см. табл.2), усугубляются в "необратимой" стадии геморрагического шока. Это выражается прежде всего в более резком снижении скоростей дыхания и выработки АТФ в единицу времени. Кроме того, если при кровопотере митохондрии печени всех животных обладают способностью фосфорилировать в данных условиях, то в состоянии геморрагического шока 25% образцов митохондрий не способны к фосфорилированию при окислении сукцината и 39% - при окислении глутамата. Эти данные свидетельствуют о : значительной тяжести шока в наших экспериментах, поскольку, например, В.А.Аркатов с соавт. (1975) не считают нарушение энергообразования характерным для травматического шока, а Г.Л.Заветная с соавт. (1977) отметили лишь незначительное снижение эффективности фосфорилирования в торпидной фазе травматического шока.
Вместе с тем наши данные подтверждают мнение многих исследователей о том, что функция митохондрий может в определенной сте - 87 гієни отражать состояние организма при слабых и тем более сильных воздействиях на него. Большинство авторов, так же как и мы, отмечает снижение скоростей дыхания при различных видах шока и при клинической смерти (Ф.Ф.Мизулин,1973; M.Sayeed, A.E.Baue ,1971 И др.).
Несмотря на то, что характерной реакцией митохондрий печени на геморрагический шок является торможение переноса электронов по редокс-цепи, степень снижения скоростей дыхания, как и при крово-потере, была неодинаковой у разных животных. Причинами подобной не однотипности, как уже указывалось (см. главу 3), могли быть разные исходное состояние и индивидуальная реакция на кровопотерю и геморрагический шок. Последняя во многом определяется характером метаболизма, в частности энергетического.
Для выявления корреляции между особенностями течения шока и изменениями в энергетическом состоянии митохондрий печени была проанализирована реакция организма отдельных животных на кровопотерю и последующую ГЙП0ТЄНЗИЮ.
Следует отметить, что полуавтоматическое поддержание АД на уровне 40 мм рт.ст. дает возможность четко проявиться индивидуальной реакции организма, которая выражается в скорости развития шока и наступления его необратимой стадии.
Проведенные исследования позволили выделить две различные по течению шока группы кроликов (табл.10). Помимо основных критериев, указанных в главе 2, большое внимание уделялось периоду наступления "необратимой" фазы шока (время гипотензии),;а также его составляющих - времени начала реинфузии и периода возвращения 1/3 выпущенной в резервуар крови.
Влияние производных 1,4-нафтохияона на перенос электронов в дыхательной цепи и активность полифермеят-ных систем СМ печени интактных крыс в опытах in vitro
Согласно договору о творческом сотрудничестве в Институте органического синтеза АН Латв.ССР под руководством доктора химических наук Я.Ф.Фрейманйса были синтезированы препараты из группы 1,4-нафтохинонов. Выбор нафтохинонового ряда был обусловлен уже упоминавшейся ролью хиноновых систем в процессах биологического окисления в организме. Фактов же, свидетельствующих о возможности регулирования функции дыхательной цепи с помощью синтетических производных 1,4-нафтохинона, нам в литературе не встретилось.
Вещества, обозначенные АК, синтезировались из 2,3-дихлорнаф-тохинонов-1,4- или 2-метил-3-хлорметилнафтохинонов-1,4 и соответствующего амина. Акцепторная способность соединений оценивалась измерением потенциала восстановления полярографическим методом. Установленные окислительно-восстановительные потенциалы (ОВП) веществ находились в пределах от -0,23 до +0,04 В (табл.14). Нами были проведены исследования У препаратов, условно названных АК-44, АК-45, АК-90, AK-IOO, AK-I04, AK-I05, AK-I08, АК-122, AK-I35 и отличающихся между собой строением боковой цепи и величиной ОВП. Изучали влияние названных препаратов на дыхательную и фосфорилирующую функции митохондрий, а также на активность полиферментных систем СМЧ печени интактных крыс. Параллельно устанавливалось место включения этих веществ в дыхательную цепь с помощью различных ингибиторов переноса электронов. Условия проведения эксперимента описаны в гл. Данные о ВЛИЯНИЙ АК на окисление глутамата приведены в табл. 14, где АК расположены по возрастающей способности ускорять окис W ЛЄНЙЄ субстрата (-у ). Из всех АК неактивными оказались AK-IOO и AK-IQ4; они практически не ускоряли окисления митохондриями глутамата. Как оказалось в дальнейшем, они не ускоряли также дыхания на сукцинате, не "снимали" действия ингибиторов переноса электронов (ротенон, антимицин А и цианид), не влияли на активность ПС СМЧ печени. Остальные АК обладали различной активностью, причем чем сильнее действие препарата, тем большее влияние он оказывал на скорости дыхания во 2-ом и 4-ом состояниях, на показатели эффективности фосфорилирования (АДФ/О), стимуляции дыхания после добавки АДФ (ДК по Ларди), прочности сопряжения (ДК по Чансу;. Надо отметить, что АК, увеличивая скорость субстратного дыхания на 18-168$ и скорость дыхания в отрегулированном состоянии 4 на 20-220$, оставляли скорость дыхания в активном состоянии 3 практически без изменения. Однако время фосфорилирования у "сильных" АК достоверно увеличивалось на 18-75% . Увеличение скоростей дыхания в состояниях 2 и 4 при незначительно менящейся скорости дыхания в состоянии 3 вызывало уменьшение ДКд на 12-50% и Мц на 13,4-50%. Снижение коэффициента АДФ/и составляло 9-33$. При сравнении скоростей Vg и v в пределах каждого препарата видно, что скорость переноса электронов после добавления АК выше, чем скорость накопления энергии \. Это свидетельствует о том, что под влиянием АК в митохондриях снижается степень энергетической регуляции и увеличивается доля свободного окисления. Поскольку в дыхательной цепи митохондрий перенос электронов осуществляется не только с НАД-зависимых субстратов, необходимо было проверить влияние АК на окисление сукцината. Как и в опытах с глутаматом, 7 из 9 АК стимулировали потребление кислорода во 2-ом и 4-ом состояниях, снижали ДКд и ДК (табл.15). Снижение ДК и коэффициента АДФ/О при действии на митохондрии АК-45, АК-44, AK-I05, АК-90 и AK-I08 достигало 12-43% и 13-21% соответственно; при добавлении к митохондриям AK-I35 и AK-I22 эти показатели становилось невозможным вычислить из-за предельного ускорения потребления кислорода. Следовательно, процесс переноса электронов преобладал над процессом фосфорилирования и митохондрии переходили в низкоэнергетическое состояние. Таким образом, удалось показать, что некоторые соединения класса 1,4-нафтохинона проявляли выраженные акцепторные свойства, о чем свидетельствуют повышение так свободного дыхания (— - 1), снижение стимуляции дыхания добавленным АДФ (ДКд) и сопряженности дыхания с фосфорилированием (ДК ), По степени ускорения свободного окисления видно, что наиболее слабым из действующих акцепторов является АК-45. Для установления места включения различных АК в дыхательную цепь митохондрий проведен йнгибиторный анализ, позволивший определить способность данных препаратов к шунтированию заблокированных участков редокс-цепй. Данные таблицы 16 иллюстрируют неодинаковую способность различных АК к шунтированию дыхательной цепи, заблокированной роте-ноном, антимицином А и цианидом. Так, АК-45 и АК-90 в исследуемой дозе оказались способными к переносу электронов только через ро-теноновый блок; АК-І05 и АК-І08 - через ротеноя- и антимицин А-чувствительные звенья. АК-44, АК-І2И и АК-І35 транспортировали электроны с глутамата прямо на кислород, минуя все заблокированные учаскй редокс-цепй, причем со скоростью, превышающей скорость окисления субстрата до добавления ингибитора. Ингибирование цианидом окисления митохондриями глутамата происходило в меньшей степени, чем сукцината (табл.17), что может быть связано с наличием альтернативных путей переноса электронов, не чувствительных к цианиду (см. рис.14). В этих условиях ни один из АК не был способен шунтировать заблокированную дыхательную цепь. Таким образом, можно заключить, что исследуемые соединения могут принимать электроны с НАД-зависимых субстратов и шунтировать заблокированную в различных участках редокс-цепь.
