Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Биологическая роль белка и его фракций в сыворотке крови
2.2. Биологическое значение амінотрансфераз и фосфатаз . 16
2.3. Влияние разных факторов на изменение активности трансаминаз и фосфатаз 24
2.4. Генетическая изменчивость сывороточных аминотрансфераз и фосфатаз. 32
2.5. Связь активности сывороточных аминотрансфераз и фосфатаз с хозяйственна-полезными признаками у с/х животных и птиц 37
3. Экспериментальная часть 47
3.1. Объект исследований 47
3.2. Биохимические методы исследований . 51
3.3. Методы морфологических исследований качества яиц 65
3.4. Методы статистической обработки полученных данных 66
4. Результаты собственных исследований 68
4.1. Общий белок сыворотки крови кур 68
4.2. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови кур 71
4.3. Онтогенетические изменения активности аспартатаминотрансферазы сыворотки крови
кур 94
4.4. Онтогенетические изменения активности щелочной и кислой фосфатазы 97
4.5. Морфологические показатели яиц и их связь с активностью щелочной фосфатазы 112
5. Обсуждение полученных результатов . 120
6. Выводы 130
Список литературы 133
Приложения 151
- Биологическое значение амінотрансфераз и фосфатаз
- Связь активности сывороточных аминотрансфераз и фосфатаз с хозяйственна-полезными признаками у с/х животных и птиц
- Биохимические методы исследований
- Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови кур
Введение к работе
Актуальность темы» В решении задач по увеличению производства продуктов питания большое внимание во всех странах мира уделяется увеличению и интенсификации производства продуктов животноводства.
Одна из задач, поставленных перед с.-х. и биологической науками - " Совершенствование племенных и продуктивных качеств скота и птицы, улучшение существующих и создание новых высокопродуктивных пород, породных групп, линий, гибридов и кроссов, приспособленных к промышленной технологии в области животноводства." +)
На Майском (1982 г.) Пленуме ЦК КПСС была одобрена продовольственная программа СССР на период до 1990 года, где указано: в одиннадцатой пятилетке среднегодовое производство мяса (в убойном весе) должно быть доведено до 17-17,5 млн.тонн и в двенадцатой пятилетке - до 20-20,5 млн.тонн, молока соответственно 97-99 млн.тонн и 104-106 млн.тонн, яиц до 75 млрд. штук и 78-79 млрд.штук.
Птицеводство, являясь одной из ведущих отраслей животноводства, дает ценные продукты питания - яйца и мясо.
Однако успешное развитие высокопродуктивного птицеводства может осуществляться только при условии проведения большой племенной работы и создания высокопродуктивных новых пород и совершенствования существующих пород птиц. Блеете с тем^ проведение этой работы невозможно без глубокого понимания физио-
+)Продовольственная программа СССР на период до 1990 года.
[логических и биохимических закономерностей, глубокого проникновения в сущность обменных процессов в организме с/х птиц в различные периоды их жизнедеятельности.
Особенно важная роль в процессах метаболизма, в построении структур тканей организма и в биосинтезе продуктов птицеводства принадлежит белкам. Белки сыворотки крови являются компонентами динамической циркулирующей системы и отражают физиолого-биохимические особенности организма в целом.Поэтому исследование белкового обмена у кур представляет большой интерес для познания процессов яйцеобразования и яйцвкладки.Также познание биохимических сдвигов в белковом составе сыворотки крови кур в различные периоды жизни имеет большое значение для клинической биохимии.
Белковый спектр сыворотки крови изучали многие советские и зарубежные авторы : М.П. Завгородая,(І969, 1975); В.П.Рыбникова (1968); ЇЇ.М. Дарьеко (1972); Л.А. Зуборева и соавт. (1972); I.H. Дубов (1978); Ф.М. Абделькерим (1973); I.A. Мако-рова (1980); Саладин Исса Аббас (1983); F.Bolumbasi ,N.Baysoo (1976); S.Potenbeng, P. Sorensen (1978) И др.
Однако несмотря на многочисленные исследования, цельная картина онтогенетического развития белкового спектра до сих пор не выявлена. Наличие значительных противоречий в работах разных авторов не позволяет выделить определенные закономерности становления белкового состава крови кур в онтогенезе. Поэтому мы решили изучить белки и белковые фракции в сыворотке крови разных линий кур в онтогенезе.
В селекционной работе с сельскохозяйственной птицей отводится значительный срок на оценку генотипа племенных особей. Требуется почти 500 дней на оценку продуктивности. Поэтому
перед биохимиками и селекционерами стоит проблема - найти биохимические или какие-либо биологические тесты организма птицы, по которым представилась бы возможность прогнозировать продуктивность и жизнеспособность племенной птицы.
Современная наука о наследственности и изменчивости организмов имеет ряд самостоятельных направлений, приобретающих значение отраслей биологических знаний. Среди этих направлений наибольший вклад как прикладная наука для практики и селекции оказывает популяционная генетика^ которая позволяет контролировать племенную работу в отдельных стадах или породах в целом и тем самым обеспечивает необходимый прогресс совершенствования продуктивных и племенных качеств животных.
Однако и популяционная генетика, как самостоятельная отрасль биологии, начинает исчерпывать свои возможности при анализе таких сложных признаков как удой, интенсивность роста, плодовитость, качество продукции и т.д, Кроме того, на основе популяционной генетики пока нельзя определять потенциальную продуктивность молодых животных, лучший вариант сочетаемости пар, качество потомства от определенного спаривания и т.д.Вот почему возможность ранней оценки племенных и продуктивных качеств животных привлекает пристальное внимание исследователей.
Ряд авторов для прогнозирования хозяйственно-полезных качеств используют методы оценки экстерьера, некоторые морфологические признаки, конституциональные типы и т.д. Большое внимание при этом уделяется вопросам использования интерьерных показателей в селекционной работе, в частности, для раннего прогнозирования продуктивности животных. На необходимость проведения работ в этом направлении указывал классик советской генетики А.С. Серебровский, Н.П. Дубинин и Я.Л. Глембоцкий считают, что
одна из основных задач генетики в области животноводства на ближайшие 20-30 лет - это разработка методов раннего прогнозирования молочной, мясной и яичной продуктивности по физиолого-биохимическим тестам.
Особый интерес для прогнозирования племенных и продуктивных качеств животных вызывает изучение состава крови. Кровь отражает наиболее важные жизненные отправления организма. Некоторые показатели крови позволяют судить о конституциональных особенностях, физиологическом состоянии и в связи с этим о характере продуктивности животных ( 96, ПО, 139 ).
Преимущество гематологических признаков связано еще и с тем, что кровь представляет собой жидкую ткань, легко доступную для прижизненного анализа. Её можно систематически исследовать в повседневной практике ( II, 83, 128 ).
По сравнению с морфологическим составом (форменные элементы, белки крови, эритроциторные антигены, гемоглобины и др.) биохимические показатели крови являются более специфическими, так как большинство из них характеризует функциональную способность органов и тканей, контролирующих продуктивность животных.
В этом отношении особый интерес представляют собой ферменты крови - биологические катализаторы, направляющие течение всего жизненного процесса по определенному пути ( 13 ).
Установлено, что активность ряда ферментов крови находится под генетическим контролем. В связи с этим большой интерес представляет выявление взаимоотношений генетических систем, контролирующих ферменты крови и систем, определяющих различные продуктивные признаки. Эти взаимоотношения необходимо использовать для совершенствования сельскохозяйственных живот-
ных. Некоторые ферменты благодаря большому количеству реакций, в которых они принимают участив, контролируют целые группы обменных процессов, а их активность может служить показателем состояния обмена веществ ( 36а). Так, аминотрансферазы могут в общем виде дать картину интенсивности белкового обмена, а фосфатази проиллюстрировать состояние обмена минеральных веществ.
Активность ферментов крови и их связь с хозяйственно-полезными признаками изучалась, главным образом, на коровах, свиньях, кроликах. Работ . же, в которых описывается активность ферментов крови кур практически мало.
Наиболее перспективными ферментами крови для оценки физиологического состояния организма в норме, при некоторых заболеваниях и прогнозировании продуктивности с.-х. животных в раннем возрасте являются аминотрансферазы, катализирующие пе-реаминирование аминокислот и фосфатазы, принимающие участие в минеральном, углеводном и жировом обменах.
Учитывая важность трансаминаз и фосфатаз в обмене веществ куру интенсивность которых у птиц весьма высокая* а также ограниченное количество исследований по этому вопросу мы решили изучить активность аминотрансфераз и фосфатаз в сыворотке крови кур в онтогенезе.
Целью работы явилось изучение влияния возраста, физиологического состояния и линейных отличий кур на показатели метаболизма белков и активность некоторых ферментов (аспартатами-нотрансфераза, щелочная фосфатаза и кислая фосфатаза) в сыворотке крови кур, а также установление некоторых связей между активностью ферментов и хозяйственно-полезными признаками кур.
Задачами исследований явилось :
Определение возрастных изменений содержания общего белка, белковых фракций и свободных аминокислот в сыворотке крови кур разн'ых линий.
Изучение возрастной динамики активности трансаминаз в сыворотке крови кур различных линий, объяснение изменчивости активности ACT в связи с изменением уровня аспарагиновой кислоты в сыворотке крови,
Изучение онтогенетических изменений активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови кур разных линий.
Связь между активностью ферментов с некоторыми хозяйственно-полезными признаками у кур (живая масса цыплят, морфологические показатели яиц).
Научная новизна состоит в том, что в работе впервые проведено систематизированное исследование в онтогенезе белкового спектра сыворотки крови кур разных линий кросса "Беларусь-9". Впервые установлена взаимосвязь изменения ACT с изменением содержания аспарагиновой кислоты в сыворотке крови кур. Впервые выявлены оптимальные возрастные периоды кур для исследования трансаминаз и фосфатаз сыворотки крови для генетических целей.
Теоретическое и практическое значение
В результате проведенных исследований дана качественная и количественная характеристики белкового состава, а также активности аспартаттрансаминазы, щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови кур в зависимости от возраста, физиологического состояния и линейных отличий кур.
Результаты, полученные в работе, могут быть использованы как исходные в клинической биохимии и в научно-исследовательских работах при изучении обмена веществ в организме кур, также могут быть использованы в качестве биохимических тестов
в селекционной работе с сельскохозяйственной птицей.
На защиту выносятся следующие основные положения
работы
динамика содержания общего белка, белковых фракций и свободных аминокислот в сыворотке крови кур разных линий.
Онтогенетические изменения активности аспартаттранс-аминазы в сыворотке крови кур.
Онтогенетические изменения активности щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови кур.
Морфологические показатели яиц разных линий кур.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Биологическое значение амінотрансфераз и фосфатаз
Трансферрин служит для переноса железа между различными органами, для будирования возможного токсического воздействия избытка ионов железа в крови и для обеспечения легко доступного атоксического циркулирующего депо железа. Кроме того, трансферрин играет роль при защите организма от возбудителей инфекций. f -липопротеин является частью популяции липопротеинов, различающихся по содержанию липидов, по молекулярному, удельному весу. р -липопротеин выполняет роль переносчика гли-церидов, холестерина, фосфолипидов; растворимых в жирах витаминов и гормонов.
Фракция tf -глобулинов сыворотки крови человека и животных представляет собой чрезвычайно гетерогенный класс соединений. Впервые они были выделены в 1937 г. Тизелиусом, указавшим на роль этих белков как защитных факторов организма. В состав І -глобулинов наряду с неспецифпческими белками, синтез которых детерминирован генетически, входят специфические белки-антитела. Последние образуются в организме в ответ на поступление чужеродных белков (антигенов) и обеспечивают иммунитет животных к инфекционным заболеваниям. Иммунные белки, большинство которых содержится в у -глобу-линовой фракции, называют иммуноглобулинами ( ig ). До недавнего времени было известно четыре основных класса иммуноглобулинов, входящих во фракцию У -глобулинов : igG , igM » igA и ig D . в последние годы был открыт пятый класс иммуноглобулинов igE ( А.в. Чечеткин и др., 1982).
Многие авторы проводили электрофоретические исследования белков сыворотки крови кур ( м. Kaminski , 1965; Г.Е. Ха-ристанов и др., 1971; М.А. Фатхи, 1973; Л.А.Макарова, 1980). Они отмечали различия в белковой картине у птиц разного вида и пола. Кроме того, работами многих исследователей показано, что белковая картина крови птиц в онтогенезе непостоянна и зависит от целого ряда факторов - возраста, пола, кормления, физиологического состояния, направления и уровня продуктивности, различных заболеваний, сезонов года и других факторов ( 69, 107).
Содержание общего белка сыворотки крови кур также колеблется в широких пределах в зависимости от перечисленных факторов. Так у молодняка содержание белков в плазме меньше, чем у взрослых, например, у цыплят (яичные породы кур)содержится от 2 до 3 Tffo белков, а у кур - 4-5 т%, причем с повышением интенсивности яйценоскости их содержание постепенно уменьшается. У высокопродуктивных кур в период яйцекладки в крови больше белков, чем у низкопродуктивных. Е.И. Артюк (1967) установил» что содержание общего белка в сыворотке крови кур с возрастом, как правило .увеличивается. А.И. Чубис и др. (1969) изучали возрастные и половые особенности белковой картины сыворотки крови у кур русской белой породы. Их данные показали, что наименьшее количество белка наблюдалось у одномесячных курочек ( 3,05 т%), с возрастом его количество увеличивалось. Максимальное содержание в крови общего белка было у 18-месячных кур (5,6 г#). к. Tanaka , s. AokI963) исследовали сывороточные белки крови у цыплят разного возраста (от 40 до 210 дней). Авторы установили, что относительное содержание альбуминовой фракции уменьшается ( 55,3$ до 31$), а содержание общего белка и глобулиновой фракции увеличивается.
Таким образом, литературные данные показывают, что содержание общего белка в сыворотке крови у кур с возрастом увеличивается и также происходят качественные сдвиги в его составе - снижается процентное содержание альбуминов и нарастает количество глобулинов, преимущественно за счет V - глобулиновой фракции.
Важным вопросом является отношение между количеством сывороточных белков ж периодами яйцекладки. Д.Т. Волков (1953) показал, что максимальное количество общего белка содержится перед началом и в начале яйцекладки, а минимальное - во время кладки яиц и в покое. В период лактации скота и в разгар яйцекладки кур в крови повышено как общее содержание белков, так и количество X -глобулинов. С затуханием яйцекладки ж перед спариванием у лактирующих животных снижаются концентрация общего белка и уровень У -глобулинов. Содержание І -глобулинов резко возрастает при активной и пассивной иммунизации животных, хронических инфекционных заболеваниях. СМ. Литой (1965) доказал, что наиболее высокое содержа 16 ниє белка в крови кур-несушек наблюдается в период интенсивной яйцекладки и уменьшается во время линьки и полового покоя. 2.2. Биологическое значение аминотрансфераз и фосфатаз Аминотрансферазы Аминотрансферазы - ферменты, катализирующие перенос аминогруппы с донорной -аминокислоты на акцептор с -кетокислоту без промежуточного образования аммония (25). Аминотрансферазы открыты в 1937 году советскими биохимиками А.Е. Браунштейном и М.Г. Крицман (91), которые наблюдали перенос аминогрупп от оі -аминокислот к Л -кетокислотам в кашице из грудной мышцы голубя. Трансаминирование играет ключевую роль в промежуточном метаболизме, так как обеспечивает синтез и разрушение аминокислот в живых клетках. Три аминокислоты - глутамат, аспартат и аланин, могут при помощи трансаминирования превращаться в соответствующие -аминокислоты, которые являются компонентами цикла трикарбоновых кислот. Окисляясь таким образом, они могут служить источником энергии. Трансаминирование также играет большую роль в обеспечении цикла мочевины аспартатом. В тканях человека и животных присутствует большое число различных аминотрансфераз. Наиболее высокое содержание и наибольшую каталитическую активность имеют два фермента : аспар-татаминотранфераза (ACT) и аланин-аминотрансфераза (AIT).
Связь активности сывороточных аминотрансфераз и фосфатаз с хозяйственна-полезными признаками у с/х животных и птиц
Известно, что состав крови в определенной мере обусловливает интенсивность и характер протекающих в организме биохимических процессов и отражает воспринимаемые ими влияния внешней среды.
В связи с этим есть основания считать гематологические показатели важным интерьерным показателем продуктивности животных. Применение некоторых физиологических и биологических показателей в целях селекции животных основывается на установлении зависимости между этими показателями и продуктивностью. У отдельных пород животных с определенным направлением и характером основной продуктивности хорошо выражены те биологические процессы, которые обусловливают эту продуктивность. Поэтому на основе биохимических данных можно прогнозировать продуктивные качества и племенную ценность животных по биохимическим тестам, измеренным в раннем возрасте ( В.Г. Нико-нова, 1969 ).
Разработке и использованию интерьерных показателей в связи с продуктивностью с.-х. животных посвящен ряд монографий, сборников ( 50, 93, 99) большое количество статей (6, 24, 28, 29, 32 - 36).
Активность ACT и АЛТ у коров с высоким, средним и низким уровнем продуктивности изучали Cristw z.,otal (125). Животные с высоким среднесуточным удоем ( от 30 до 48 кг ) имели тенденцию к значительному увеличению уровня ACT по сравнению с животными со средней и низкой продуктивностью. Если коровы были сгруппированы по периодам лактации, активность аминотрансфераз находилась в четко выраженной взаимосвязи с продуктивностью.
Ф.Р. Кивкуцан и Л.К. Эрнст (58) также установили, что активность АЛТ в сыворотке крови коров холмогорской и черно-пестрой пород положительно коррелирует с удоем за всю лактацию ( г = 0,342).
П.А. Воробьев и Ю.А. Перчихин (36а) установили, что активность трансаминаз у молодняка положительно связана с настригом шерсти. По активности этих ферментов у ягнят 2-4-месячного возраста можно прогнозировать будущий настриг шерсти (0,51 - 0,69). На основании полученных данных можно рекомендовать использование проверки активности трансаминаз у ягнят в возрасте 2-4 месяцев для раннего прогнозирования их шерстной продуктивности в производственных условиях.
В исследованиях В.Г. Никоновой установлена положительная корреляция сывороточной активности трансаминаз в раннем возрасте свиней уржумской породы с абсолютным привесом животных за период откорма ( г = 0,435 по ACT и 0,315 по АЛТ ) и отрицательная - с числом дней достижения подсвинками живого веса в 100 кг ( г = -0,301 и -0,213 соответственно). Прижизненная активность сывороточных ферментов в возрасте 2-3 месяцев коррелирует положительно с мясными качествами животных : с весом туш ( r = 0,40; 0,39), с выходом мяса в туше ( г = 0,402; 0,30), с площадью мышечного глазка ( г= 0,354; 0,25) и имеет тенденцию к отрицательной корреляции с содержанием сала в туше ( r = -0,174; -0,021).
O.K. Смирнов и В.Д. Карликов (1968) в опытах на свиньях установили достоверную положительную корреляцию между активностью ACT и АЛТ в сыворотке крови, полученной перед убоем и абсолютными приростами поросят за период откорма. Коэффициент корреляции составлял соответственно +0,392 и 0,580. Авторы также установили корреляцию между показателями активности трансаминаз и выходом мяса в туше.
А.В. Архиповым установлена прямая и четко выраженная связь активности трансаминаз крови и печени со скоростью роста и яичной продуктивностью у кур. Так, наивысшая активность ферментов совпадала с наиболее активным периодом роста цыплят и периодом яйценоскости кур. Помеси, как правило, имели более интенсивные обменные процессы в молодом и взрослом состоянии. Активность сывороточных аминотрансфераз у них была также выше по сравнению с исходными породами.
В.Н. Доронина в обзоре литературы по этому вопросу отметила, что совершенно аналогичные результаты были получены в ВИЖе, где на различных видах животных изучали связь между активностью ферментов переаминирования и хозяйственно-полезными признаками. В результате долголетних исследований пришли к следующим выводам : 1) у помесей от промышленного скрещивания с повышением в крови аспартат или аланин аминотрансфераз, по сравнению с родителями, значительно увеличилась и энергия роста ; 2) высокая активность сывороточных аминотрансфераз положительно коррелирует с мясностью туш у свиней и овец на откорме ; 3) установлена положительная корреляция между активностью аминотрансфераз и плодовитостью. Ряд авторов не выявил достоверной связи активности ферментов переаминирования со скоростью роста цыплят ( 14, 15, 75, 101, 134). Активность ACT была выше у кур с низкой скоростью роста, а гибриды характеризовались более низкими показателями активности ACT по сравнению с исходными родителями формами. Необходимо при этом отметить, что эти данные были получены на курах яичного и яично-мясного направления продуктивности. Л.А. Бегма ( 14, 15 ) изучала.активность ACT у леггорнов, родаиландов и их гибридов. Самая высокая активность фермента наблюдалась у леггорнов, самая низкая - у гибридов, которые превосходили родительские формы по выводимости, выживаемости, живой массе, содержанию белка в печени. Автор делает вывод, что степень резистентности и продуктивные качества птицы находятся в обратной зависимости от активности ACT. Д. Карасиньский с соавт. ( 55 ) обнаружили отрицательную связь между активностью ACT крови гусят в 6-месячном возрасте и их яйценоскостью, коэффициент корреляции составил - 0,18. Между активностью ACT и живой массой гусят корреляция также отрицательна —0,04.
Биохимические методы исследований
В конической колбочке смешивают 7,5$ гель с раствором персульфата аммония из расчета I мл катализатора на 100 мл геля. Закрыв колбочку пробкой с трубкой, из неё с помощью насоса откачивали воздух, после этого быстро вливали гель в щель кассеты, заполняя её на 2/3 по высоте. Для выравнивания поверхности геля аккуратно наслаивали дистиллированную воду с помощью шприца или пастеровской пипеткой. Полимеризация геля заканчивается через 15-20 мин. Об окончании полимеризации судили по образованию четкой границы между гелем и слоем воды.
После полимеризации воду сливали, промывали поверхность геля 3,5$ акриламидом на буфере "В" и вносили данный гель в кассету в объеме, заполняющем щель кассеты на 1/6 по высоте. Снова наслаивали дистиллированную воду, котору после полимеризации сливали и промывали поверхность геля 3,5$ акрил-амидом на буфер "С". Заливали щель кассеты 3,5$ акриламидным гелем рН 8,3 почти до верхнего края и вставляли в кассету гребёнку из оргстекла, имеющую 20 зубьев 0,5x1 см для формирования лунок. После полимеризации гребенку осторожно удаляют из геля и заполняют лунки буфером "С", таким образом получали блок геля, состоящий из разделяющего, концентрирующего и формирующего лунки слоев.
Затем готовили пробы сыворотки в.40$-ном растворе сахарозы на буфере "С" (для предотвращения диффузии белка в буфер). Хорошев разделение и оптимальная для денситометрирования концентрация белков достигается при соотношении сыворотки и сахарозы 1:2 (при концентрации белка в сыворотке 3-4 %) при больших концентрациях разведение увеличивалось. Приготовленная таким образом сыворотка крови вносилась в лунки в количестве 0,02 мл микропипеткой методом подслаивания под буфер. Для маркировки движущегося пограничного слоя в две крайние лунки вносили по I капле раствора бромфенолового синего. 3. Заполненную кассету ставили в нижнюю камеру прибора, предварительно заполненную на 1/2 объема 10$ раствора буфера "С". На кассету укрепляли верхнюю камеру, заполняли её тем же электродным буфером осторожно, чтобы не вымыть пробы из лунок. 4. Электрофорез проводили при силе тока 60 ма на блок в концентрирующем геле и 120 ма на блок в разделяющем геле. Б качестве источника постоянного напряжения использовали универсальный источник питания УИН-І. Следует учесть, что фронт белков идет в данном случае на 2-3 см выше фронта бромфенолового синего, поэтому электрофорез заканчивают, когда краситель полностью выйдет из разделяющего геля. 5. После электрофореза блок геля удаляли из кассеты и красили 1% раствором амидочерного в течение 10 мин. После чего отмывали блок в 1% уксусной кислоте, хранили гели в том же растворе. Идентификация железосодержащих белков, церуло-плазмина и щелочной фосфатази 1. Трансферрин и другие железосодержащие белки выявляли в полиакриламидном геле по методике J.т.Clarke (1964). К 0,2 г бензидина и 0,5 мл ледяной уксусной кислоты в 100 мл дистил лированной воды, перед употреблением добавляли 0,2 мл 30$ пергидроля. Полученным раствором заливали форегрзмм, . Во вре мя инкубации в течение 30 мин появлялись синие полосы на ме сте нахождения железосодержащих белков. Окрашенные участки со временем приобретают коричневый цвет. 2. Окраску церулоплазмина производили 0,2$ раствором па рафенилендиамина в ацетат натрия буфера рН 5,6 в течение 2 часов при 37С. Церулоплазмин обнаруживается в виде темно фиолетовых полос. 3. Щелочная фосфатаза выявляется в виде коричневых полос после окраски фореграммы в течение часа при комнаиной темпе ратуре следующим реактивом : - трис - буфер рН 8,6 состоит : 12,10 г трис и 2,0 г хлористого магния растворяли в I литре воды. а) В 300 мл трис-буфера растворяли 150 мг красителя синий прочный РР ; б) 60 мг о -нафтилфосфата растворяли в 6 мл трис-буфе ра. Растворы "aV и "б" смешивали перед употреблением. Для количественного определения содержания белковых фракций, отдельные участки денситограмглы, соответствующие определенным белковым фракциям, вырезали и взвешивали. Абсолютное содержание белковых фракций определяли по формуле .
Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови кур
В своей работе мы использовали блочный тип вертикального диск-электрофореза по принципиальной схеме Б.А.Устинникова и Г.А. Ермолина (1972). В ходе работы в данную методику были внесены изменения, касающиеся прописи приготовления геля, режимов проведения электрофореза, а так же количества сыворотки, подвергаемой разделению. Указанные изменения позволяют за 1,5-2 часа провести четкое разделение белков сыворотки крови кур.
Для разделения использовали разделяющий слой 12% акрил-амидного геля на трис-HCI буфере рН-9 ( по методу Б.А. Устин-никова и Г.А. Ермолина -7,5$ акриламидный гель). Пробы сыворотки были приготовлены в 40$ растворе сахарозы при соотношении сыворотки и сахарозы 1:1 (по методу Б.А. Устинникова при соотношении 1:2).
В результате работы по разделению белковых фракций методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле нами были получены и идентифицированы II фракций ( от анода к катоду) : преальбумин, альбумин, постальбумин, трансферрин, церулоплаз-мин, щелочная фосфатаза, 2""ГЛ0 УЛИН» 2 макроглФглин % j-глобулин, /2 -липопротеид и Ц 2 ГЛ0С УЛИН Зону транефер-рина обнаруживали по реакции с бензидином, зону церулоплазми-на - по реакции окисления парафенилендиамина, щелочную фосфатазу окрашивали по .в. Gahne (1964).
На фореграммах и денситограммах различались 3 подфракции преальбуминов, 4 подфракции постальбуминов, 3 подфракции трансферринов, 2 подфракции церулоплазминов и 2 подфракции tf 2 глобулинов.
Наибольшее количество подфракции выявляли,главным образом, у цыплят в возрасте от 30 до 90 дней. У суточных цыплят подфракции трансферринов разделялись не четко, на денситограм-мах выявлялись в виде обширных зон. У взрослой птицы фракция с 2-макроглобулин и фракция $ j-глобулин на денситограммах иногда также выглядят в виде обширных зон, поэтому они анализировались в сумме.
Результаты определения содержания белковых фракций в сыворотке крови кур кросса "Беларусь-9" в онтогенезе представлены в таблицах 8, 9 и 10 и на рисунках 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и II, а процентное содержание данных фракций приведены в таблицах II, 12 и 13.
Содержание преальбуминов во всех возрастах у всех групп птиц имеет величину относительно небольшую по сравнению с другими белковыми фракциями. Наименьший уровень преальбумина отмечался у суточных цыплят. У цыплят линии Б-9(5) данный показатель достоверно снижался в возрасте 60 дней, затем он постепенно повышался с возрастом. У цыплят линии Б-9(6) и гибридных цыплят в общем, содержание преальбуминов постепенно увеличивалось с возрастом.
Количество альбуминов в сыворотке крови подопытных цыплят возрастало до 30-дневного возраста. Если в суточном возрасте уровень альбуминов в сыворотке крови цыплят линии Б-9(5) составил 0,5 1% у линии Б-9(6) - 0,64 т% и у гибридов - 0,86 т%, то к 30 дням этот показатель достигал 0,73+0,016 т%, 0,86+ 0,025 т% и 1,07+0,055 г$ соответственно. Увеличение как содержания, так и процентного соотношения альбуминов в 30-дневном возрасте сопровождалось уменьшением количества и процентного соотношения почти всех групп глобулинов. После 30 дней жизни уровень альбуминов постепенно повышался с возрастом, что хоопровоздалооь повышением количества общего белка в сыворотке крови у кур линии Б-9(5) содержание альбуминов достигает максимума в 210-дневном возрасте (1,96+0,11 т%) и у кур линии Б-9(6) - в 360-дневном (1,86+0,080 i%). Из таблиц 6,7 и 8 видно, что процентное соотношение альбуминов,в целом, снижалось с возрастом. Эта закономерность возрастной эволюции у всех видов животных одинакова. Этим объясняется способность превращения альбуминов в глобулины в организме взрослых животных.
Фракция постальбумина ( или ы -глобулина ) состоит из нескольких гликопротвидов и липопротеидов, при электрофорезе в полиаіфиламидном геле она разделялась на 3-4 подфракции.Закономерность возрастного изменения постальбуминов у разных линий кур не одинакова. У цыплят линии Б-9(5) содержание постальбумина значительно повышалось с возрастом. Если в суточном возрасте его уровень составил 0,19 т%, то к 120 дням данный показатель достигал максимума 0,56+0,095 г .В 150-дневном возрасте количество постальбумина значительно падало до 0,39+ 0,047 т%, а затем происходило увеличение уровня постальбумина до значения соответствующего 120 дням в конце исследованного периода - 0,55+0,032 т%. У цыплят линии Б-9(6) динамика содержания постальбумина выражена незначительно. Наименьшее значение получено для 30-дневных цыплят - 0,37+0,034 т%, в других возрастах этот показатель составлял 0,37 - 0,47 т%9 у гибридных цыплят содержание постальбуминов увеличивалось к 90 дням жизни, и несколько снижалось к 120 дням.
Фракция трансферрина представляет собой железосодержащий р -глобулин, встречающийся в трех или больше генетически определяемых формах: ВВ, ВО и БД. В сыворотке крови птицы содержание и процентное соотношение трансферринов снижалось к 30 дням жизни. Если у суточных цыплят линии Б-9(5) уровень трансферринов составил 0,31 т%, у линии Б-9(6) - 0,28 т% и у гибридов - 0,25 %, то к 30 дням данный показатель снижался 0,21+0,022, 0,26+0,014 и 0,27+0,016 т% соответственно. Затем уровень трансферринов повышался с возрастом и достигал макси-хмума в 210-дневном возрасте: у кур Б-9(5) - 0,58+0,030 т% , а у кур Б-9(6) - 0,61+0,023 %. В процессе роста процентное соотношение трансферринов колеблется в пределах от 6,54 до 9,62% у всех групп птиц ( за исключением суточных цыплят Б-9(5) - 14,22 т%).
