Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ... 5
ГЛАВА I. ГИСТОНЫ И ДРУГИЕ КИСЛОТОРАСТЮРИМЫЕ БЕЛКИ НАСЕКОМЫХ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Специфичность и гетерогенность гистонов насекомых 10
2. Структура и функция гистонов насекомых 20
3. Гистоны в эмбриональных клетках насекомых 21
4. Гистоны в сперматогенезе насекомых 25
5. Другие кислоторастворимые белки насекомых 29
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
I. Материал 34
П. Методы 35
1. Выделение ядер и хроматина из грены 35
2. Выделение суммарного препарата кислото-растворимых белков из ядер и хроматина 36
3. Выделение суммарного препарата кислото-растворимых белков из гомогената грены, личинок,куколок,имаго и семенников 37
4. Отделение гистонов от кислоторастворимых белков с низкой катодной подвижностью 37
5. Получение гистона HI 38
6. Электрофоретическое исследование кислоторастворимых белков в полиакриламидном геле 6.1. Фракционирование белков в системе уксусная кислота-мочевина 39
6.I.I.Окрашивание гелевых колонок раствором прочного зелёного 40
6.1.2. Дифференциальное окрашивание белковых зон раствором кислого алого прочного
6.1.3.Дифференциальное окрашивание
аргининбогатых гистонов 41
6.1.4.Идентификация гистоновых фракций НІ и Н2В 41
6.2. Фракционирование кислоторастворимых белков в полиакриламидном геле
с додецилсульфатом натрия 42
7. Диссоциация гистонов из хроматина 43
8. Аналитические методы 44
ГЛАВА Ш. ГИСТОНЫ И ДРУГИЕ КИСЛОТОРАСТВОРЙМЫЕ БЕЛКИ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА
1. Выделение и характеристика гистонов и некоторых кислототорастворимых белков грены 47
2. Динамика фракционного состава гистонов и других кислоторастворимых белков в процессе пред- постдиапаузного развития грены 6І
ГЛАВА ІУ.ИЗМЕНЕНИЕ СТЕПЕНИ ФОСФОРИЛИРОВАННОСТИ ГИСТОНА НІ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА 77
ГЛАВА У. ГИСТОНЫ И ДРУГИЕ КИСЛОТОРАСТВОРЙМЫЕ БЕЛКИ В ПРОЦЕССЕ ПОСТЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА 83
ГЛАВА УI.ИЗМЕНЕНИЕ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА ГИСТОНОВ И ДРУГИХ КИСЛОТОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ В СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА 96
ГЛАВА УП.НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСА
ГИСТОНЫ-ДНК ХРОМАТИНА ГРЕНЫ ПО
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 119
ВЫВОДЫ ГІ27
ЛИТЕРАТУРА
Введение к работе
В современной биохимии изучение структуры и функции хроматина является одной из центральных проблем. Особый интерес представляет её исследование в онтогенетическом аспекте, так как существенная роль в реализации наследственной информации принадлежит белкам хроматина. Именно они в значительной мере обеспечивают дифференциальную активность генов, которая лежит в основе развития и старения клеток и организмов. Важная роль в структуре хроматина принадлежит гистонам (Bonner,1975 ; КогпЪerg,1977 ; Mlrzabekov, 1980) , принимающим, по последним данным, непосредственное участие в осуществлении репликации и транскрипции (Щш, 1967; Цанев, 1980; Tsanev, 1982).
Гистоны изучены в значительной мере у представителей иглокожих, амфибий, млекопитающих. В последние годы все больше информации накапливается о кислоторастворимых белках хроматина, отличающихся от гистонов и, в первую очередь, об HMG-белках млекопитающих (Goodwin et al.,1980; Johns, 1982)и растений (Spiker et al.,1978). У насекомых группа кислоторастворимых белков исследована крайне неполно. В литературе имеются лишь сведения о гисто-нах шелкоотделительной железы и кишечника тутового шелкопряда (Yoshida et al.,1966; Sakaguchi,Puju,1977 ; Sridhara,Daillie , 1977). Кроме гистонов в хроматине насекомых обнаружены специфические кислоторастворимые белки, а именно: белок D1 у дрозофилы (Alfageme et al.,1980) и белки группы С у средиземноморской плодовой мушки (Franco et ai., 1977), а также белки, подобные нш-белкам млекопитающих (Marquez et al.,1982; Краснов и др.,1983; Куранова и др.,1983) . Характерно, что гистоны и другие кислоторастворимые белки в онтогенезе насекомых до сих пор не исследованы. Между тем ясно, что насекомые и тутовый шелкопряд, в частности, представляют собой крайне удобный объект для изучения белков хроматина в процессе развития, так как обладают хорошо выраженными фазовыми переходами в течение сравнительно короткого жизненного цикла.
Цель и задачи исследования. Основной целью нашего исследования явилось изучение гистонов и других кислоторастворимых белков на разных этапах онтогенеза тутового шелкопряда и выяснение их возможной связи с активностью генома и, в конечном итоге, с процессами дифференцировки и роста организма. Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Выбрать оптимальный метод выделения и фракционирования гистонов и других кислоторастворимых белков из организма тутового шелкопряда на разных фазах его развития.
2. Изучить свойства ( молекулярные массы, аминокислотный состав, подвижность в двух системах полиакриламидного геля) гистонов и некоторых других кислоторастворимых белков грены тутового шелкопряда.
3. Исследовать динамику фракционного состава гистонов и других кислоторастворимых белков в процессе эмбрионального развития
(модель активного генома) и в процессе сперматогенеза (модель неактивного генома) , а также на различных этапах постэмбрио-нального развития тутового шелкопряда, включая личиночную фазу, метаморфоз и взрослое насекомое.
4. Отработать метод выделения хроматина из грены тутового шелкопряда, определить соотношение основных его компонентов, охарактеризовать состояние комплекса гистоны - ДНК и выявить степень фосфорилированности гистона НІ на разных стадиях эмбрионального развития.
Научная новизна. Впервые были выделены препараты кис лото-растворимых белков из ядер грены тутового шелкопряда. При их фракционировании в 15%-ном полиакриламидном геле в системе уксусная кислота-мочевина были обнаружены основные гистоновые акции и фракции кис лот орастворимых белков с низкой катодной подвижностью. Предложен оригинальный метод разделения этих двух групп белков. Определены аминокислотный состав суммарного препарата гистонов и суммарного препарата кислоторастворимых белков с низкой катодной подвижностью, а также молекулярные массы отдельных фракций кис лоторастворимых белков грены тутового шелкопряда. Впервые расшифрована динамика отмеченных фракций кислоторастворимых белков тутового шелкопряда на разных фазах его развития, характеризующихся различной степенью активности генома. Исследовано соотношение основных компонентов хроматина ядер и прочность связи гистонов с ДНК на разных стадиях постдиапаузного развития грены.
Практическое значение работы. Тема диссертационной работы является частью программы, заданной Государственным комитетом по науке и технике СССР, "Исследование структурной организации и активности генома насекомых". Номер государственной регистрации 8I088I84.
Полученные данные углубляют знания о механизмах регуляции дифференциальной активности ядерного генома и об участии в этом процессе кис лоторастворимых белков.
Разработанные для грены методы получения и разделения гистонов и кислоторастворимых белков с низкой катодной подвижностью, а также выделения хроматина могут быть использованы для дальнейшего исследования функционального состояния хроматина на разных стадиях развития тутового шелкопряда. По результатам исследования составлены методические прописи, предназначенные для постановки спецпракгикума по биохимии белков и нуклеиновых кислот в педагогических институтах.
