Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Способы удаления антиуглеводных антител 11
1.1.1. Лекарственная терапия 12
1.1.2. Инфузия анти-aGal антител 13
1.1.3. Экстракорпоральная терапия 14
1.1.4. Поиск новых аффинных сорбентов 18
1.2. Способы доставки ДНК в клетку для разработки ДНК-вакцин 19
1.2.1. Электропорация 22
1.2.2. Введение ДНК с помощью микроинъекции 23
1.2.3. Метод "генной пушки" 23
1.2.4. Введение нативной ДНК с помощью прямых инъекций 24
1.2.5. Введение ДНК с помощью различных транспортных систем 24
1.2.5.1. Вирусные векторы 24
1.2.5.2. Белковые и пептидные векторы 25
1.2.5.3. Введение ДНК с использованием липосом 26
1.2.5.4. Введение ДНК, включенной в полимерных микрочастицы и микрокапсулы 27
1.3.Капсулирование 29
1.3.1. Микрокапсулы 29
1.3.2. Полимерные носители 32
1.3.2.1. Природные полисахариды 33
1.3.3. Методы микрокапсулирования 39
1.3.3.1. Химические методы микрокапсулирования 40
1.3.3.2. Физические методы микрокапсулирования 41
1.3.3.3. Физико-механические методы микрокапсулирования 43
1.3.4. Полиэлекролитные микрокапсулы 46
1.3.4.1. Метод послойной адсорбции полиэлектролитов 47
1.3.4.2. Получение микрокапсул с помощью гелеобразования 48
1.4. Заключение по обзору литературы 50
Глава 2. Материалы, оборудование и методы исследования 52
2.1. Материалы и реактивы 52
2.2. Лабораторное оборудование 54
2.3. Методы получения и исследования 55
2.3.1. Получение модифицированных декстранов 55
2.3.2. Определение молекулярной массы модифицированных декстранов 56
2.3.3. Определение степени замещения модифицированных декстранов 57
2.3.4. Получение альгинат-поликатионных микросфер 57
2.3.5. Определение толщины мембраны микросфер 59
2.3.6. Определение эффективности включения гликоконъюгата в микросферы 59
2.3.7. Изучение эффективности сорбции антител микросферами с различной толщиной ПЭ мембраны 60
2.3.8. Сравнение способности альгинат-хитозановых микрочастиц и сефарозы специфически связывать антиуглеводные антитела 61
2.3.9. Проведение ИФА 61
2.3.10. Исследование гемосовместимости микрочастиц 62
2.3.10.1. Изучение морфологии и концентрации форменных элементов крови 62
2.3.10.2. Исследование гемолиза эритроцитов 62
2.3.10.3. Определение фрагмента СЗа 63
2.3.11. Получение микрочастиц карбоната кальция 63
2.3.12. Изучение сорбционной емкости микрочастиц СаСОэ 64
2.3.13. Включение ДНК в микрочастицы СаС03 64
2.3.14. Получение микрокапсул на основе микрочастиц СаСОз методом послойной адсорбции полиэлектролитов 64
2.3.15. Оценка эффективности введения вирусной ДНК, включенной в (ПЛ/АЛГ)з микрокапсулы, в клетки в модели in vitro 66
2.3.16. Изучение доставки вирусной ДНК, включенной в (ПЛ/АЛГ)3 микрокапсулы, в клетки в модели in vivo 66
2.3.17. Оценка эффективности доставки микрокапсулированных форм плазмидных ДНК в моделях in vivo 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 69
3.1. Выбор полимеров для получения полиэлектролитных биосовместимых микросфер 69
3.2. Включение антигенов в биосовместимые альгинат-хитозановые микросферы для специфического удаления антиуглеводных антител 71
3.2.1 Выбор антигенов 71
3.2.2. Выбор метода иммобилизации антигенов 72
3.2.3. Характеристика альгинат-хитозановых носителей 73
3.2.4. Изучение эффективности включения гликоконъюгатов в микросферы 79
3.2.5. Изучение эффективности сорбции антител микросферами 81
3.2.6 Сравнение способности альгинат-хитозановых микрочастиц и сефарозы специфически связывать антиуглеводные антитела 84
3.2.7. Изучение гемосовместимости микросфер 85
3.2.7.1. Изучение морфологии и концентрации форменных элементов крови 86
3.2.7.2. Исследование гемолиза эритроцитов 89
3.2.7.3. Определение фрагмента СЗа 90
3.3. Включение ДНК в биосовместимые полимерные микрокапсулы 91
3.3.1. Выбор материалов и метода для включения ДНК 91
3.3.2 Изучение сорбционной емкости микрочастиц СаС03 93
3.3.3. Подбор полиэлектролитов для получения мультислойных микрокапсул 95
3.3.4. Исследование доставки вирусной ДНК, включённой в (ПЛ/АЛГ) микрокапсулы, в клетки в модели in vitro и in vivo 97
3.3.5. Исследование доставки плазмидных ДНК, включённых в микрокапсулы различного полимерного состава, в модели in vivo... 100
Выводы 106
Благодарности 108
Список литературы 109
- Экстракорпоральная терапия
- Лабораторное оборудование
- Выбор полимеров для получения полиэлектролитных биосовместимых микросфер
Введение к работе
Включение различных биоактивных макромолекул (белков, ДНК, олигонуклеотидов и др.) в биосовместимые полимерные матрицы (в нано- и микрочастицы, нано- и микрокапсулы) является одним из перспективных направлений биотехнологии и биомедицины. Спектр областей применения таких носителей постоянно расширяется и включает в себя разработку новых эффективных систем доставки лекарств с их контролируемым высвобождением, новых методов диагностики рака и других заболеваний, новых способов доставки в клетки ДНК для разработки вакцин, соматической генной терапии и др. [1]. В данной работе рассматриваются две области возможного применения иммобилизованных в биосовместимые полиэлектролитные (ПЭ) микросферы макромолекул - синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК:
создание новых биосовместимых иммуносорбентов (на основе микрокапсул и микрочастиц размером 700-900 мкм);
разработка новых ДНК-вакцин с использованием инкапсулированных плазмидных ДНК (размер микрокапсул 1-3 мкм).
Стоит особо отметить, что, несмотря на разные области применения микросфер, задача иммобилизации (включения) биоактивных молекул решается с использованием одних и тех же подходов и биоматериалов.
Создание новых иммуносорбентов является перспективным подходом для решения ряда медицинских проблем, связанных с заболеваниями и осложнениями, провоцируемых антиуглеводными антителами [2-4]. Существуют различные специфические и неспецифические способы решения проблемы удаления из крови патологических антител [5]. К последним относится гемодиализ, при проведение которого вместе с патологическими антителами из крови тотально удаляются все белки. Недостатком этого подхода, кроме потери пациентом важнейших для его здоровья белков, также является высокая стоимость метода.
Среди прочих способов удаления из крови патологических антител особое внимание уделяется специфической сорбции антител на соответствующем сорбенте, представляющем собой антиген, ковалентно пришитый к твердой фазе (сефарозе, агарозе, силикагелю). Применение таких сорбентов требует предварительной процедуры разделения крови на плазму и клетки крови (плазмаферез), во избежание контакта клеток крови с сорбентом, а затем пропускание плазмы через сорбент (плазмосорбция) с последующим возвращением клеток и плазмы в кровоток. Такая необходимость обусловлена тем, что при пропускании через колонку с сорбентом цельной крови, взаимодействие частиц сорбента, с клетками, сопоставимыми с ними по размерам, приводит к повреждению тромбоцитов, эритроцитов и других клеток крови. Существенным недостатком такого подхода являются еще и потери в объеме крови, что требует заместительной терапии. Поэтому более привлекательным представляется метод удаления патогенных антител непосредственно из цельной крови (гемосорбция). При этом особую значимость приобретает задача создания биосовместимой полимерной матрицы (носителя антигена), которая бы позволила сохранить сорбционную емкость традиционных сорбентов или даже увеличить ее и при этом не травмировать клетки крови за счет применения частиц большего размера.
Разработка новых методов доставки ДНК в клетки является одним из актуальных направлений в биотехнологии и основной предпосылкой для создания новых ДНК-вакцин. Для разработки эффективных вакцин требуется доставка белков антигена в цитоплазму антигенпредставляющих клеток (АПК), к которым относятся дендритные клетки (ДК), а также макрофаги и моноциты. В этом случае АПК способны индуцировать не только гуморальный иммунный ответ, то есть продукцию антител, но и цитотоксический клеточный ответ, необходимый для элиминации зараженных патогеном клеток организма.
Идея конструирования ДНК-вакцины основана на том, что определенный ген или участок генома патогена встраивается в бактериальные или вирусные
векторы. Созданная таким образом ДЬЖ-вакцина потенциально способна индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ [6]. Если рассматривать существующие способы введения ДНК в клетки, то большинство из них применимо только в условиях in vitro, например, метод электропорации и метод "генной пушки". В условиях in vivo пригодными остаются только липид-опосредованное введение ДНК и иммунизация нативной ДНК. Эффективность таких методов остается крайне невысокой, так как количество введенной ДНК, попадающее в АПК клетки, оказывается слишком низким для индукции иммунного ответа. Микрокапсулирование ДНК позволяет не только защитить ДНК от быстрого разрушения в организме нуклеазами, но также обеспечить адресную доставку и взаимодействие с клеточными рецепторами. Как правило, для микрокапсулирования ДНК используют метод распылительной сушки и метод двойной эмульсии (вода/масло/вода). Эффективность включения ДНК последним методом обычно не превышает 30-50%. Метод распылительной сушки более эффективен, однако, использование органических растворителей (например, дихлорметана, диметилсульфоксида), а также различных ПАВ может снижать биологическую активность инкапсулированных биоактивных молекул. Кроме этого метод распылительной сушки требует наличия специального дорогостоящего оборудования. Поэтому актуальной задачей является разработка новых простых и универсальных методов включения ДНК в микрокапсулы для ее доставки в клетки в условиях in vivo.
Целью настоящей работы являлось включение синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК, кодирующих белок-антиген, в биосовместимые полимерные микросферы на основе природных полисахаридов; исследование свойств полученных микросфер и возможности их применения в биомедицине для создания новых биосовместимых иммуносорбентов и ДНК-вакцин.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: 1. Выбрать биодеградируемые полиэлектролиты для получения микросфер.
Разработать и оптимизировать методы включения синтетических антигенов (гликоконъюгатов) и ДНК в полиэлектролитные микросферы (микрочастицы и микрокапсулы) различного композиционного состава.
Исследовать способность полученных микросфер с включенными антигенами сорбировать антиуглеводные антитела.
Сравнить сорбционные свойства полученных микросфер и сефарозы.
Изучить гемосовместимость матрицы-носителя антигена на примере пустых полиэлектролитных микросфер различного композиционного состава.
Изучить эффективность доставки в клетки микрокапсулированной вирусной ДНК в условиях in vitro и in vivo.
Исследовать в модели in vivo индукцию антител на введение микрокапсулированных плазмидных ДНК двух типов, изучить влияние различного композиционного состава микросфер на иммунный ответ.
Экстракорпоральная терапия
Традиционная лекарственная терапия с использованием иммуносупрессивных агентов далеко не всегда приводит к желаемым клиническим результатам и нормализации иммунологических параметров. В связи с этим, в последние два десятилетия предпринимаются настойчивые попытки увеличить эффективность лечения путем применения экстракорпоральных процедур (ЭП), направленных на удаление из организма только патогенных агентов, в частности патологических антител. В таких случаях встает вопрос о применении как несорбционных, так и сорбционных технологий. Рассмотрим некоторые методы эфферентной терапии, которые наиболее часто используются в настоящее время.
Плазмаферез. Процедура плазмафереза представляет собой экстракорпоральное разделение крови на клеточные элементы и плазму, удаление последней из организма и возмещение ее плазмозаменителями, солевыми или глюкозированными растворами или донорской плазмой. Разработку этого метода "очищения крови" от патологических субстанций, в первую очередь, связывают с именем проф. Дж. Абеля. В 1912-1914 гг. группа учёных под его руководством провела первые эксперименты по гемодиализу и плазмаферезу на собаках [21, 22]. Широкое распространение метод получил намного позже, благодаря разработке фракционаторов крови и мембранных плазмофильтров из поливинилдиацетата целлюлозы, лавсана. В современных технологиях экстракорпоральной терапии плазмаферез применяется как один из первоначальных этапов полуселективного или селективного удаления из крови заданных молекулярных или надмолекулярных структур. Все существующие на сегодняшний день варианты проведения плазмафереза можно разделить на две группы [23]:
1) Дискретные методы:
гравитационный метод с использованием центрифуги;
безаппаратный фильтрационный метод (одноигольный метод с использованием плазмофильтров);
ручной метод, предполагающий инкубацию крови во флаконах при 7С в течение 24 ч в присутствии стабилизаторов крови (4% раствора цитрата натрия, гепарина).
2) Непрерывные методы:
аппаратный метод, заключающийся в центрифугировании крови на специальных сепараторах клеток крови (Fresenius, Cobe);
мембранный метод, в котором фильтрация крови осуществляется через специальные мембраны (Gambro).
Проведение процедуры плазмафереза, однако, сопряжено с возможностью развития ряда осложнений, среди которых следует отметить:
- цитратную интоксикацию, обусловленную снижением уровня кальция;
- осложнения, связанные с использованием антикоагулянтов, которые могут иметь геморрогический характер при их избытке или, наоборот, могут приводить к тромбообразованию при их недостатке;
- осложнения, связанные с введением плазмозамещающих растворов (аллергические реакции, анафилактический шок);
- инфекционные осложнения при использовании донорской плазмы и компонентов крови донора;
В своей работе М. Шнайдер [24], рассматривая эффективность плазмафереза при аутоиммунных заболеваниях, отмечает, что эта процедура может использоваться в критических ситуациях при любых иммунологических заболеваниях, однако стандартной терапией является только для некоторых из них, в том числе при остром СГБ. Гемосорбция. Этот метод основан на перфузии цельной крови через сорбенты с целью удаления из кровотока патогенных компонентов. Экспериментальную разработку метода сорбционной детоксикации крови провел Т. Чанг с соавторами в начале 70-х годов [25]. В результате этих исследований была показана возможность использования активированного угля для удаления из крови уремических токсинов. В нашей стране работы с применением сорбента в экстракорпоральной терапии были начаты в коллективе Ю.М.Лопухина и были связаны с уменьшением концентрации гидрофобных и других токсических компонентов при лечении больных с печеночной недостаточностью [26].
В качестве неспецифических гемосорбентов применяют активированные углеродные соединения, ионообменные смолы [27]. Последние представляют собой полимерные гранулы на основе синтетических полимеров, в структуре которых имеются ионогенные группы, содержащие подвижные противоионы. В зависимости от типа ионогенных групп различают: катеониты, аниониты, полиамфолиты и комплексообразующие иониты. Следует отметить, что потери общего белка и альбумина при гемосорбции с использованием ионообменных смол выше, чем при сорбции на углеродных сорбентах. Поэтому ионообменные смолы применяются, в основном, для сорбции веществ, которые плохо или совсем не элиминируются углеродными сорбентами (например, билирубина).
Лабораторное оборудование
Эффективность включения гликоконъюгатов в микросферы (МЧ и МК) определяли спектрофотометрически с помощью флуоресцентно меченного FITC гликоконъюгата (Atri-PAA-FITC). Для этого 1 мл Atri-PAA-FITC (0,5 и 2,2 мг/мл) смешивали с 4% водным раствором АЛГ в соотношении Г.1 (по объему) и использовали эту смесь для приготовления Са-АЛГ гранул. Для получения АЛГ-ХИТ МЧ гранулы инкубировали в 0,2% растворе ХИТ (ММ 3700, рН 4,5) в течение 5 мин и затем промывали 0,9% NaCl. МК получали с помощью обработки АЛГ-ХИТ МЧ 0,1 М раствором ЭДТА в течение 30 мин. Приготовленные АЛГ-ХИТ микросферы хранили в 0,9% NaCl при 4С.
Степень включения Atrj-PAA-FTTC в микросферы определяли следующим образом: серию аликвот (50 мкл) приготовленных МЧ и МК растворяли при рН 11,5, наносили на планшет и измеряли флуоресценцию при 485 нм/535 нм, используя многофункциональный счетчик-анализатор Wallac 420 Victor2. Аналогично были приготовлены и исследованы пустые МЧ и МК. Кроме этого, были исследованы все смывы после каждой стадии получения микросфер, а именно: растворы СаС12, NaCl, хитозана, ЭДТА. Для определения количества Atrr PAA-FITC, включенного и десорбировавшегося в процессе приготовления микросфер, предварительно строили градуировочную зависимость величины флуоресценции от концентрации Atri-PAA-FITC. Степень десорбции низкомолекулярных фракций Atri-PAA-FITC из микросфер в процессе их хранения в 0,9% NaCl оценивали по величине флуоресценции супернатанта.
Выбор полимеров для получения полиэлектролитных биосовместимых микросфер
При выборе материалов для получения микросфер, в первую очередь, предпочтение отдавалось полимерам, уже нашедшим применением в медицине. При этом к полимерам предъявлялись следующие требования:
- биосовместимость;
- гидрофильность;
- способность к образованию стабильного полиэлектролитного комплекса (ПЭК).
В качестве объектов для получения полимерных микросфер были выбраны следующие водорастворимые полиэлектролиты: альгинат (АЛГ), к-каррагинан (КАР), сульфат декстрана (СД); поли-/,-лизин гидробромид (ПЛ); хитозан (ХИТ) и производные хитозана, в частности, четвертичные аммониевые основания ХИТ-1М и ХИТ-2М, отличающиеся молекулярной массой; сульфат хитозана-1 (СХ-1) и сульфат хитозана-2 (СХ-2), отличающиеся молекулярной массой и содержанием сульфогрупп; сополимер поливинилового спирта с хитозаном (ПВС-ХИТ).
Кроме этого, в лаборатории проф. А. Бартковиака (Западнопомеранский университет, г. Щецин, Польша) автором была синтезирована серия новых поликатионов - модифицированных декстранов (ДМ), характеризующихся наличием значительного положительного заряда в своей структуре. Предположительно использование таких полимеров позволит повысить устойчивость полиэлектролитного комплекса при получении полиэлектролитных микросфер.
Модификацию декстрана (ММ 100000-200000) проводили путем его реакции с различными хлораминами (рис. 18). Всего было получено 12 образцов ДМ с различной степенью замещения. Выход конечного продукта составлял не менее 70%. Характеристики хлораминов, использованных в данной работе
