Введение к работе
з
Актуальность темы С развитием промышленности и сельского хозяйства в биосферу поступает все большее количество различных ксенобиотиков, в том числе фенолов и фенольных соединений, которые в значительной степени загрязняют окружающую среду В настоящее время нагрузка на естественные процессы самоочищения биосферы является избыточной, и параллельно с деструкцией загрязнений идет их постепенное накопление и преобразование в еще более токсичные соединения Существующие химические и физические способы утилизации фенольных соединений не всегда эффективны В связи с этим разработка теоретических и практических (биотехнологических) основ биодеградации этих веществ является актуальной проблемой биотехнологии и экологии В настоящее время предпочтение отдается микробиологическим технологиям Однако, несмотря на преимущества этих методов, имеется один существенный недостаток Большинство микроорганизмов и биологических агентов не способны функционировать при высоких концентрациях фенолов Вместе с тем содержание фенолов даже в стоках пищевых предприятий, например, коптильных цехов, может доходить до 3% Такие стоки, попадая на биологические очистные сооружения, приводят к гибели микроорганизмов активного ила (Смирнов В Н и др , 2002) В этом плане перспективным может быть использование новых штаммов грибов "белой гнили", обладающих уникальными внеклеточными ферментами лигноли-тического комплекса Благодаря этому они являются единственными организмами способными полностью разрушать один из основных компонентов древесины - лигнин, а также большое количество разнообразных ксенобиотиков (Кадималиев Д А и др, 2003, Рабинович МЛ и др , 2004) Эффективность биодеградации этих соединений зависит от качественного и количественного соотношения внеклеточных ферментов В этом отношении внимание заслуживает гриб Lentmus Щппич штамм ВКМ F-3616D обладающий высокой лигнолитической активностью за счет способности продуцировать нетипичную "желтую" лакказу и секреторную пероксидазу растительного типа (Ревин В В и др , 2000, Кадималиев ДА и др , 2005)
Считается, что немаловажную роль в секреции этих ферментов во внеклеточную среду, играют мембранные структуры, в частности фосфолипиды (ФЛ), которые наряду с жирными кислотами (ЖК) определяют физиологические свойства мембраны -проницаемость, микровязкость, заряд, что особенно важно для транслокации ферментов через мембрану Изменение качественного и количественного состава ФЛ мембран является одним из факторов определяющим ее проницаемость Уровень и механизмы секреции лигнолитических ферментов во внеклеточную среду также зависят от изменений в химическом составе мембраны (Несмеянова М А , 1982, Феофилова Е П и др, 1987) Контролируемое изменение физиологических и физико-химических свойств мембраны грибов путем воздействия на липиды модификаторами - органическими растворителями, детергентами, и другими соединениями может быть одним из возможных методов увеличения секреции ферментов во внеклеточную среду Кроме того, есть данные о значительной роли в процессах биодеградации липидов и продуктов их перекисного окисления (Капич А Н , 1995) Установление связи между этими процессами позволит не только лучше понять механизмы участия липидов в функционировании внеклеточного лигнолитического ферментного комплекса (ВЛФК), но и регулировать процессы их синтеза и секреции
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось изучение процес-х са биодеградации фенольных соединений грибом L. tigrmus и выделяемыми им вне- \ґ~^ клеточными лигнолитическими ферментами, а также подбор условий модификации \
мембраны, обеспечивающий максимальный выход этих ферментов
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
-
Исследовать процесс биодеградации фенольных соединений грибом L tignnus и роль отдельных ферментов внеклеточного лигнолитического комплекса в этом процессе,
-
Изучить изменение липидного состава, продуктов перешеного окисления ли-пидов (ПОЛ) мицелия и лигнолитической активности гриба L tignnus в процессе роста и биодеградации фенола,
-
Установить взаимосвязь между изменением липидного состава, активностью ферментов лигнолитического комплекса и биодеградацией фенола,
-
Подобрать модификаторы клеточной мембраны, их концентрацию и время внесения для повышения выхода ферментов лигнолитического комплекса,
-
Разработать варианты практического использования гриба L tignnus для биодеградации высоких концентраций фенола и его производных в промышленных сточных водах
Научная новизна работы Впервые показана способность гриба L tignnus расти и развиваться в присутствии высоких концентраций фенола (до 5%), а также возможность его использования для биодеградации фенола и его производных Установлено, что лакказа играет в этом процессе ведущую роль, а роль пероксидазы в большей степени заключается в детоксикации образующихся токсичных продуктов его разрушения Причем для эффективной биодеградации фенола необходима секреция этих ферментов в определенных соотношениях
Впервые исследован состав липидов и продукты их окисления в мицелии гриба L tignnus ВКМ F-3616 D Выявлена взаимосвязь между составом липидов мицелия и секрецией лигнолитических ферментов Установлено, что фазе активного роста и максимальной секреции ВФЛК соответствует повышенное содержание легко окисляемых ФЛ, ненасыщенных ЖК и вместе с тем низкое содержание продуктов ПОЛ В идиофазе, характеризующейся более низким выходом внеклеточных лигнолитических ферментов, повышается доля более стабильных ФЛ, насыщенных ЖК и продуктов ПОЛ
Исследовано влияние модификаторов клеточной мембраны на секрецию лигнолитических ферментов грибом L tignnus при глубинном культивировании Показано, что повышение лакказнои и пероксидазнои активностей в культуральнои жидкости по сравнению с контролем наблюдается на 6 сутки роста, при добавлении модификаторов мембраны (бутанола и толуола для лакказы, ЭДТА для пероксидазы) на 3 сутки, т е в начале продуцирования и секреции лигнолитических ферментов Максимальной лакказнои и пероксидазнои активностям соответствует определенное соотношение ФЛ и ЖК
Исследовано влияние новых пирролохинолинов 7-гидроксикарбонил-1,2,3-триметил-4-метокси-1Н-пирроло[2,3-і]хинолина (1) являющегося витаминоподобным аналогом PQQ и 5-трифторметил-1,2,3-триметил-Ш-пирроло[3,2-»]хинолина (2) на рост и развитие гриба L tignnus Показано, что пирролохинолин (1) оказывает стимулирующее действие на рост и развитие гриба, в то время как трифторзамещенный пирролохинолин (2) затормаживает развитие культуры гриба
Научно-практическая значимость работы Результаты исследований расширяют представления о механизмах биодеградации токсичных веществ фенольной природы грибом белой гнили L tignnus и роли отдельных ферментов в этом процессе, участия липидов в процессах секреции лигнолитических ферментов во внеклеточную среду
Предложены новые приемы увеличения выхода ферментов лигнолитического комплекса, путем модификации клеточной мембраны Полученные результаты могут служить основой для увеличения эффективности старых и разработки новых методов биодеградации ксенобиотиков фенольной природы и лигноцеллюлозных субстратов Предложена технология практического использования гриба L tignnus для биодеградации высоких концентраций фенола и его производных в сточных водах
Связь работы с научными программами Представленные результаты были получены в ходе исследований, проведенных в рамках научно-практических работ при поддержке программы "Развитие научного потенциала высшей школы 2006-2008" РНП 2 1 17708 «Моделирование и кинетический анализ процессов деструкции лигноцеллюлозных субстратов и ксенобиотиков с участием ферментов и липидов», гранта Минобрнауки РФ по поддержке ведущих научных школ РИ-112/001/350 "Исследование физиолого-биохимических свойств базидиальных грибов (на примере Panus tignnus) и физико-химических свойств секретируемых ферментов для получения новых материалов", гранта Роснауки по поддержке молодых ученых, шифр 2006-РИ-19 0/001/079 "Исследование свойств лигнолитических ферментов гриба Panus tignnus и их роли в биодеградации растительных отходов и токсичных веществ"
Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены для обсуждения на Огаревских чтениях в Мордовском государственном университете им Н П Огарева (Саранск, 2004-2006), на научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им Н П Огарева (Саранск, 2005-2006), на 10 - ой Пущинской школе - конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), на IV Съезде общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (Пущино, 2006), на 14-ой международной конференции «Математика Компьютер Образование» (Пущино, 2007), VI Республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2007)
Публикации По теме диссертации опубликовано 21 печатных работ, в числе которых 2 статьи в российских научных журналах, рекомендованных ВАК и подана заявка на патент
Структура и объем диссертации Материалы диссертации изложены на тйУ страницах машинописного текста Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы Диссертационная работа включает Л рисунка и і таблицы Список цитируемой литературы включает «v1^ источников, в том числе /іУна иностранных языках
Благодарность Выражаю искреннюю благодарность и признательность научному руководителю доктору биологических наук Кадималиеву Давуду Али-оглы за плодотворные советы при проведении экспериментов, внимание и помощь в подготовке диссертации Выражаю особую благодарность заведующему кафедрой биотехнологии МГУ им Н П Огарева доктору биологических наук, заслуженному деятелю науки РФ Ревину Виктору Васильевичу, кандидату биологических наук Атыкян Нелли Альбертовне и всему коллективу кафедры биотехнологии МГУ им Н П Огарева за поддержку при выполнении диссертационного исследования
