Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности строения лигноцеллюлозных субстратов 9
1. Полисахариды клеточной стенки 10
1.1. Целлюлоза 10
1.2. Гемицеллюлозы 10
1.3. Пектиновые вещества 14
2. Лигнин 16
ГЛАВА 2. Микробиологическая деструкция лигноцеллюлозных субстратов 21
ГЛАВА 3. Ферменты, принимающие участие в биоконверсии лигноцеллюлозных субстратов 21
1. Гидролитические ферменты 21
1.1. Карбогидразы 21
1.2. Эстеразы 22
1.2.1. Ацетилксиланэстеразы 22
1.2.2. Ферулоилэстераза 23
2. Окислительные ферменты 27
2.1. Лигнинпероксидаза 30
2.2. Mn-зависимая пероксидаза 32
2.3. Mn-ингибируемая пероксидаза 35
2.4. Фенолоксидазы (тирозиназа и лакказа) 36
2.5. Арилалкогольоксидаза 36
3. Перекись-продуцирующие ферменты, окисляющие углеводы 37
ГЛАВА 4. Неферментативные механизмы окисления лигнина экспериментальная часть
Глава 5. Объекты и методы исследования 40
5.1. Объекты исследования 40
5.2. Выделение чистых культур С. unicolor, D. confragosa 41
5.3. Условия культивирования грибов белой гнили 41
5.4. Приготовление инокулюма и отбор проб КЖ грибов белой гнили 42
5.5. Исследование ММР лигносульфонатов КЖ грибов белой гнили и продуктов гидролиза природных субстратов ферулоилэстеразой A. heteromorphus методом ГПХ 43
5.6. Методы измерения ферулоилэстеразной активности. Предобработка природных субстратов для действия
ферулоилэстеразы 44
5.6.1. Гидролиз метилового эфира феруловой и л-кумаровой кислот 44
5.6.2. Гидролиз ферулоиларабинозида 44
5.6.3. Гидролиз природных субстратов 45
5.6.4. Определение общего содержания феруловой
кислоты в составе природных субстратов 45
5.6.5. Обращеннофазовая хроматография 46
5.6.6. Определение деацетилирующей активности 46
5.7. Методы определения ксиланазной активности 46
5.7.1. Гидролиз КМЦ и глюкуроноксилана березы 46
5.7.2. Гидролиз МУФ-производных 47
5.7.3. Гидролиз п-НФ производных 47
5.8. Определение рН и температурного оптимумов ферулоилэстеразы и ксиланазыА heteromorphus 47
5.9. Методы определения Мп-пероксидазной активности 48
5.9.1. Окисление MnS04, температурная стабильность. и рН-оптимум МП В, adusta 48
5.9.2. Окисление фенолового красного 48
5.9.3. Активность по отношению к гваяколу 48
5.9.4. Определение активности МП по отношению к другим субстратам 49
5.10. Методы определения пероксидазной и лакказной активности 49
5.11. Определение лигнинпероксидазной активности 49
5.12. Определение арилалкогольоксидазной активности 49
5.13. Выделение гомогенной Мп-пероксидазы В. adusta 90-41 50
5.13.1. Ионообменная хроматография 50
5.13.2. Хроматофокусирование 50
5.14. Выделение гомогенной ферулоилэстеразы и ксиланазыА heteromorphus 51
5.14.1. Ионообменная хроматография 51
5.14.2. Выделение ферулоилэстеразы A. heteromorphus методом гидрофобной хроматография 52
5.14.3. Выделение ксиланазы A. heteromorphus методом гиброфобной хроматографии 52
5.15. ДДС-ПААГ электрофорез и изоэлектрофокусирование 52
5. 15. Субстраты и реактивы 53
ГЛАВА 6. Общие закономерности роста грибов белой гнили на среде с лигносульфонатами 54
6.1. Ферменты, продуцируемые грибами белой гнили 54
6.2. Трансформация лигносульфонатов под действием грибов 57
6.3. Сопоставление данных ГПХ с ферментативной активностью грибов белой гнили 66
6.4. Роль Н2О2 и супероксид-аниона в процессах деструкции/полимеризации лигносульфонатов культурой В adusta 67
ГЛАВА 7. Выделение и свойства МП-пероксидазы В. Adusta .
7.1. Выделение Мп-пероксидазы В. adusta 72
7.2. Биохимические характеристики и субстратная специфичность Мп-пероксидазы В. adusta 75
ГЛАВА 8. Участие ферулоилэстеразы в биотрансформации лигнинсодержащих субстратов 80
8.1. Скрининг препаратов грибов класса Deuteromycetes на ферулоилэстеразную активность 80
8.2. Выделение ферулоилэстеразы A. heteromorphus 81
8.3. Субстратная специфичность и биохимические характеристики ферулоилэстеразы A. heteromorphus 87
8.4. Действие ферулоилэстеразы A. heteromorphus на природные лигнинсодержащие субстраты 88
8.5. Выделение ксиланазы A. heteromorphus 95
8.6. Субстратная специфичность и биохимические характеристики ксиланазы A. heteromorphus 96
8.7. Синергитическое действие ферулоилэстеразы и ксиланазы A. heteromorphus при гидролизе пшеничных отрубей 100
Выводы 103
Список литературы
- Пектиновые вещества
- Окислительные ферменты
- Приготовление инокулюма и отбор проб КЖ грибов белой гнили
- Трансформация лигносульфонатов под действием грибов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Природная деструкция растительных остатков грибами осуществляется, благодаря комплексу их внеклеточных ферментов. При этом особенности строения растительного субстрата определяют состав и свойства ферментного комплекса гриба-деструктора. Так, субстраты с высоким содержанием фенил-пропанового полимера лигнина (например, древесина) эффективно разрушаются окислительными ферментами базидиальных ксилотрофных грибов. В частности, избирательной способностью разрушать лигнин обладают грибы белой гнили. В основном, это представители порядка Aphyllophorales s.l. -Bjerkandera adusta (Willd: Fr.) Karst., Daedaleopsis confragosa Alb. et Schiw., Cerrena unicolor (Bull: Fr.) Murriell., и порядка Agaricales s. I. - Pleurotus ostreatus (Jocq: Fr.) Китт. и др. Их ферментный комплекс обычно включает лигнинпероксидазу (ЛП), лакказу и Mn-пероксидазу (МП). Взаимосвязь биохимических путей превращения лигнина и целлюлозы происходит через систему НгОг-продуцирующих ферментов. Присутствие Н2Ог обеспечивает работу пероксидаз. Кроме того, многие авторы полагают, что Н202 является источником активированных форм кислорода - неферментных окислителей лигнина (супероксид-анион, гидроксильные радикалы). Однако, несмотря на значительный прогресс в исследовании процессов биоконверсии лигнина до сих пор не ясно, что именно инициирует реакции окисления лигнина, какова роль каждого из ферментов, как осуществляется взаимосвязьіферментньїх и неферментных факторов биоконверсии. Решение этих вопросов возможно при культивировании грибов белой гнили на лигнинсодержащем субстрате (например, на лигносульфонатах). При этом важно определять ферментативную активность грибов, а также изменения, происходящие с субстратом под действием грибов. Наконец, необходимо исследование свойств гомогенных ферментов, которые принимают участие в биоконверсии лигнина.
- Относительно недавно было установлено, что многие сапротрофные дейтеромицеты, особенно представители родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma и др., образуют ферменты - ферулоилэстеразы, - которые способны гидролизовать сложноэфирные связи между остатками феруловой кислоты, присоединенной к полисахариду (например, к ксилану) и лигнином. Таким образом, с помощью феруоилэстеразы возможно отделение лигнина от гемицеллюлоз и целлюлоз.
Исследование значения и свойств ферулоилэстераз актуально, в первую очередь, в связи с широкими возможностями применения эстеразных ферментных препаратов в биотехнологических процессах пищевой, кормовой, целлюлозно-бумажной и других областей промышленности.
Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение роли лигнолитических ферментов и активированных форм кислорода в биоконверсии лигнина, а также исследование процессов разрушения лигноуглеводного комплекса ферулоилэстеразами. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Определить динамику лигнолитической активности грибов белой гнили В. adusta, С. unicolor, D. confragosa var. rubescens, P. ostreatus и характер их действия на лигносульфонаты в процессе роста грибов.
-
Исследовать возможное участие активированных форм кислорода в биоконверсии лигносульфонатов под действием В. adusta.
-
Изучить свойства гомогенной МП, выделенной из культуральной жидкости (КЖ) В. adusta.
-
Исследовать действие гомогенной ферулоилэстеразы, выделенной из КЖ A. heteromorhus на растительные субстраты.
Научная новизна. В процессе роста на среде с лигносульфонатами исследована ферментативная активность D. confragosa, С. unicolor, Р. ostreatus и В. adusta. Установлено, что лакказа D. confragosa и С. unicolor, а также МП и лакказа P. ostreatus и В. adusta участвуют скорее в процессах полимеризации, а не деструкции лигносульфонатов. Впервые проведен анализ молекулярно-массовых изменений лигносульфонатов под действием грибных культур. Показано, что P. ostreatus и В. adusta активно деструктируют лигносульфонаты, а в КЖ D. confragosa, С. unicolor преобладают процессы полимеризации. Установлено, что для первоначального окисления лигносульфонатов в КЖ В. adusta необходимо присутствие гидроксильных радикалов, образующихся из Н2О2.
Из КЖ В. adusta выделена гомогенная МП, не обладающая ЛП активностью в отличие от большинства известных МП, и способная, в зависимости от присутствия Мп2+ в реакционной среде, проявлять различные свойства при окислении ряда органических субстратов.
В условиях твердофазной ферментации (ТФФ) A. heteromorphus на пшеничных отрубях получен ферментный препарат, из которого выделены гомогенные ферулоилэстераза и ксиланаза. Установлено синергетическое взаимодействие между ферулоилэстеразой и ксиланазой A. heteromorphus при гидролизе пшеничных огрубей (по выходу феруловой кислоты). Практическая значимость работы. Показана возможность использования грибов белой гнили, особенно P. ostreatus к В. adusta,- для утилизации отходов переработки древесины (лигносульфонатов). Способность МП В. adusta окислять субстраты фенольной и нефенольной природы делают этот фермент и продуцент перспективными для детоксикации стоков целлюлозно-бумажной промышленности. Показано, что применение эстеразных ферментных препаратов позволяет увеличить эффективность гидролиза ксиланазами травянистых субстратов богатых гемицеллюлозами.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Internationa] Workshop on Peroxidase Biotechnology Application (St. Petersburg, Russia, 1997); International Conference on Biotechnology in Pulp and Paper Industry (Vancouver, Canada, 1998); International Conference Biocatalysis-98: Fundamental & Applications (Puschino, Russia, 1998); Международная Конференция Современные проблемы микологии и фитопатологии (Москва, Россия, 1998). Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (4 главы), включающей описание материалов и методов исследования, результатов и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы: Работа изложена на 117 страницах, содержит 34 рисунка и 9 таблиц.
Пектиновые вещества
Эндо-1,4-[3-ксиланазы (КФ 3.2.1.8), которые действуют на внутренние 0-1,4-связи преимущественно незамещенных участков ксиланов и ксилоолигосахаридов. Причем сродство к субстратам уменьшается с уменьшением степени полимеризации. Субстратная специфичность ксиланаз широко варьирует. Известны ксиланазы способные гидролизовать [3-1,4-гликозидные связи не только в составе кислана, но и других природных и синтетических субстратах, таких как целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) и др. Некоторые ксиланазы Bacillus subtilis [44], Gleophylhim trabeum [45] действовуют только на участки гетероксиланов расположенные рядом с остатками, замещенными 4-О-метилглюкуроновой кислотой. Молекулярные массы грибных ксиланаз находятся в пределах от 10 до 85кДа. a-L-арабинофуранозидаза (КФ 3.2.1.55) и р-глюкороиидаза (КФ 3.2.1.1) удаляют соответственно, боковые остатки арабинозы и 4-О-метилглюкуроновой кислоты от основной цепи ксилана (рис. 3), субстратами для определения активности этих ферментов являются их р-нитрофенильные производные.
Эстеразы (КФ 3.1.1). Гидролизуют сложноэфирные связи между основной цепью ксилана и боковыми заместителями. Эстеразы позразделяют на следующие группы:
Ацетилксиланстеразы (КФ 3.1.1.6) удаляют ацетильные группы (-СОСНз) от полимерного ксилана. Вследствие этого происходит образование участков, открытых для действия эндоксиланаз, которые разрывают полимер с образованием олигомеров. Исследования процесса ферментативного деацетилирования показали, что одного только действия эстераз недостаточно, без сопровождающего участия эндоксиланаз полимер становится нерастворимым и, следовательно, недоступным дальнейшему гидролизу [2, 46]. Для определения ацетилксиланэстеразной активности используют ксиланы, богатые ацетильными группами, например О-ацетил-4-О-метилглюкуроноксилан (рис. 1), выделенный из древесины лиственных деревьев или химически ацетилированный, арабиноксплап травянистых растений (рис. 3).
Некоторые авторы выделяют в отдельную группу некоторые ацетилксиланэстеразы не активные к полимерному ксилану. Это ацетилэстеразы, они способны гидролизовать сложноэфирную связь ацетильных групп только в составе олигомеров ксилана. Субстратами для определения ацетилэстеразной активности являются низкомолекулярные синтетические вещества, имитирующие фрагменты полимерного ксилана, например, р-нитрофенил ацетат, a-нафтил ацетат, 4-метилумбеллиферил ацетат. В таких веществах ацетильная группа присоединена сложноэфирной связью к молекуле индикатора, который легко высвобождается под действием фермента и детектируется спектрофотометрически. Однако, основный недостаток таких низкомолекулярных субстратов их нестабильность и неспецифичность. В частности, ацетилксиланэстеразы легко их окисляют [2], кроме того, некоторые ферулоилэстеразы также обладают деацетилирующей активностью [53, 57, 60].
В 1987 году впервые было показано присутсвие ферулоилэстеразной активности в коммерческом препарате гемицеллюлаз [43]. Авторы предположили что, разрушая сложноэфирную связь основной цепи полимерного ксилана с феруловой (4-гидрокси-3-метокси-коричной) или кумаровой (4-гидрокси-коричной) кислотами, соответствующие эстеразы (феруловая, кумаровая) делают полимер доступными действию карбогидраз.
В гомогенном состоянии ферулоилэстераза была впервые получена из культуральных фильтратов Streptomyces olivochromogenes [47] и, другими авторами, из грибного источника A. orysae [48].
Образование конечного продукта реакции - феруловой кислоты - наблюдали в процессе гидролиза следующих природных субстратов: пшеничные отруби [47, 49-52], пшеничная солома [48, 53], свекловичный жом [54], препараты клеточных стенок некоторых растений, например Lolium multiflorum [53, 55]. Количественные оценки образования продукта можно получить с использованием хроматографических методов с детекцией поглощения в УФ части спектра (280 или 310 нм) - максимум поглощения феруловой, кумаровой кислот. Возможна качественная реакция определения присутствия феруловой кислоты в гидролизате методом тонкослойной хроматографии на пластинах с чувствительным в ультрафиолетовой области носителем [58].
Интересны результаты исследования специфичности эстераз по отношению к олигосахарам - фрагментам арабиноксиланов [12, 51, 56] и пектинов [12, 49], полученных путем ферментативного гидролиза вышеупомянутых субстратов под действием карбогидраз [4, 5, 7, 12]. На примере реакции таких субстратов с ферулоилэстеразами возможно исследование специфичности фермента к стерической конфигурации и длине олигомеров [50, 54]. Получение олигомерных субстратов для ферулоилэстераз достаточно трудоемко, поэтому большинство авторов для исследования субстратной специфичности используют синтетические субстраты, имитирующие участки действия фермента (см. рис. 4, 7). В основном это метиловые эфиры феруловой или кумаровой кислот [13, 49, 53, 55-57]. В 1991 предложена схема синтеза 5-0-ггат-ферулоил-а-Ь-арабинофуранозида [58]. Этот субстрат довольно близок по своей структуре к природному, т.к. феруловая кислота здесь связана с арабинофуранозидом такой же связью как в арабиноксилане (рис. 7с).
При изучении субстратной специфичности ферулоилэстераз из различных источников, было показано, что некоторые из них обладают широкой специфичностью. В частности, способны гидролизовать не только метиловый эфир феруловой кислоты, но и метилкумарат (например, P. pinofilum [53], A. awamori [57]), метилкумарат и метилкоффеат (A. niger [14, 49]), проявлять деацетилирующую активность к нитрофенильным и нафтильным производным [53, 57, 60], ацетилированному ксилану [53, 57]. В связи с этим, для изучения особенностей фермента необходимо исследование активности с использованием ряда субстратов.
Молекулярные массы описанных ферулоилэстераз находятся в пределах от 24 до 112 кДа [57, 60]. Известны более высокомолекулярные ферулоилэстеразы, которые по-видимому, обладают димерной структурой и в денатурирующих условиях распадаются на одинаковые мономеры, например, по данным гель-фильтрации, масса ферулоилэстеразы A. niger была равна 132 кДа, а по данным SDS-фореза в полиакриламидном геле - 63 кДа [49].
Изоэлектрические точки грибных ферулоилэстераз находятся обычно в диапозоне от 3 до 4,7, бактериальных - от 7,9 до 8,5 [47]. Оптимальные значения рН гидролиза метилового эфира феруловой кислоты находятся обычно в пределах от 5,5 до 7 [47-48, 54].
Окислительные ферменты
С другой стороны, происходит разрыв С-С связей ароматических колец в составе полимера; это может приводить к уменьшению оптического поглощения на 280 нм и, следовательно, уменьшению высоты основного пика лигнина на ММР. Однако при этом сильного изменения молекулярной массы полимера может не наблюдаться (см. рис. 13, кривая 2, рис, 14, кривые 2-3). Под действием грибов второй группы - P. ostreatus и В. adusta, вероятно, реализуются оба процесса, что приводит к значительному уменьшению высоты основного пика лигниносульфонатов и увеличению низкомолекулярного пика продуктов деструкции в первую фазу роста.
Интересной структурной особенностью лигнина является то, что некоторые фенольные группы боковых цепей остаются свободными, благодаря этому сохраняется способность лигнина к дальнейшей конденсации при дополнительном окислении. На ММР этот процесс отражается в увеличении средней степени полимеризации лигносульфонатов в первую фазу роста и, соответственно, в сдвиге основного пика лигнина в высокомолекулярную область. Вероятно, подобные процессы происходили, в основном, под действием грибов первой группы - D. confragosa и С. unicolor (см. рис. 11, кривая 2, рис. 12, кривая 2).
Таким образом, грибы первой группы (Д confragosa и С. unicolor) в значительной степени полимеризовали лигносульфонаты. Процессы деструкции в первую фазу роста этих грибов были незначительны и сопровождались увеличением средней степени полимеризации до 7000Да. Реполимеризация низкомолекулярных продуктов окисления лигнина сопровождалась образованием высокомолекулярных фракции (до ЗООООДа).
Грибы второй группы В. adusta и P. ostreatus в первую фазу роста вызывали значительное накопление продуктов окисления лигносульфонатов. На ММР в этот период наблюдается существенное уменьшение высоты основного пика лигносульфонатов, образование новых низкомолекулярных пиков и значительное увеличение высоты низкомолекулярного пика в области 140Да. Вторая фаза роста грибов этой группы характеризуется реполимеризацией образовавшихся низкомолекулярных продуктов деструкции. При этом в культуре В. adusta происходило увеличение средней степени полимеризации лигносульфонатов до ЮОООДа. В культуре P. ostreatus таких изменений не происходило. 6.3. Сопоставление данных ГПХ с ферментативной активностью грибов белой гнили.
До 5-6 суток роста во всех культурах не наблюдали лигнолитической активности, в то же время на ММР происходило первое появление низкомолекулярных продуктов деструкции субстрата, т. е. начальная деструкция лигносульфонатов происходила независимо от участия лигнолитических ферментов.- Появление лакказной активности в КЖ С. unicolor и D. confragosa наблюдали, начиная с 6 суток роста. Увеличение активности лакказы в КЖ происходило во вторую фазу роста этих грибов и сопровождалось реполимеризацией низкомолекулярных продуктов окисления полимера (20 сутки для С. unicolor, 8-13 сутки для культуры D. confragosa).
В литературе отмечалась способность лакказ к конденсации фенолов за счет рекомбинации радикалов, образуемых при лакказном окислении [108-109]. С другой стороны, существует точка зрения, допускающая участие лакказы в процессах деструкции лигнина, в частности в катализе процесса деметоксилирования - ключевого этапа биодеструкции [32]. Вероятно, лакказа, образуемая культурами С. unicolor и D. confragosa, параллельно осуществляет оба процесса, однако образование низкомолекулярных фрагментов полимера (деструкция) происходит менее интенсивно, чем процессы конденсации и реполимеризации лигносульфонатов. Таким образом, лакказа С. unicolor и D. confragosa принимает участие скорее в процессах полимеризации, а не деструкции лигносульфонатов.
В культурах P. ostreatus и В. adusta появление лакказы и МП также происходило после появления первых продуктов деструкции лигносульфонатов на ММР. В КЖ P. ostreatus значительное увеличение активности лакказы в КЖ происходило во вторую фазу роста параллельно с процессами реполимеризации на ММР. Однако средняя степень полимеризации лигносульфонатов в КЖ P. ostreatus не менялась, и уровень МП активности был в 4 раза ниже уровня МП в культуре В, adusta. Как видно из рисунка 13, во вторую фазу роста В. adusta на ММР реполимеризация низкомолекулярных продуктов окисления сопровождалась увеличением средней степени полимеризации лигносульфонатов, при этом происходило увеличение МП активности. Таким образом, вероятно непосредственное участие МП В. adusta в процессах реполимеризации лигносульфонатов. Из сопоставления данных о ферментативной активности с результатами ММР лигносульфонатов нами был сделан вывод о том, что ферменты (лакказа для культур С. unicolor и D. confragosa и МП и лакказа для культур В. adusta и Р. ostreatus) участвуют скорее в реакциях полимеризации, а не деструкции лигносульфонатов.
Роль Н2О2 и супероксид-аниона в процессах деструкции/полимеризации лигносульфонатов культурой В. adusta.
В первые сутки роста В. adusta в КЖ не было детектировано лигнолитической активности. В то же время на ММР КЖ наблюдается первичное образование низкомолекулярных продуктов деструкции лигносульфонатов. Возможно происходит за счет неферментных окислителей, например, за счет присутствия в КЖ активных форм кислорода - Н2О2 и супероксид-аниона [115-116], которые продуцируются грибами и участвуют во многих процессах, поддерживающих жизнедеятельность грибов. Кроме того Н2О2, сама по себе окислитель средней силы, является источником наиболее реакционноспособных гидроксильных радикалов - ОН , которые, по мнению некоторых авторов, играют ключевую роль в первичном окислении лигниновой матрицы [115].
Естественную защиту организма от разрушительного воздействия активных форм кислорода осуществляет система внутриклеточных ферментов, основные из которых каталаза и супероксиддисмутаза (СОД). В присутствии каталазы происходит разложение перекиси с образованием атомарного кислорода и воды по реакции 1. В присутствии СОД происходит инактивация супероксид-аниона с образованием перекиси и кислорода по реакции 2:
Приготовление инокулюма и отбор проб КЖ грибов белой гнили
Общее содержание феруловой кислоты в пшеничных отрубях, свекловичном жоме и пшеничной соломе определяли, осуществляя полный щелочной гидролиз этих субстратов в течение 24 часов, согласно методике [4-5, 14]. В пшеничных отрубях содержалось 0,3% феруловой кислоты, в свекловичном жоме - 0,5%, в пшеничной соломе - 0,2%), т.е. общее содержание феруловой кислоты в исследованных природных субстратах существенно не отличалось.
На рисунке 28 представлены результаты гидролиза пшеничных отрубей, свекловичного жома и пшеничной соломы под действием гомогенной ферулоилэстеразы и КЖ A. heteromorphus. Как видно из рисунка, исследованные субстраты проявляли различную реакционную способность (по выходу феруловой кислоты). Наибольшая реакционная способность была отмечена для пшеничных отрубей - как под действием гомогенного фермента, так и КЖ A. heteromorphus. Высокая реакционная способность отрубей, по-видимому, объясняется тем, что остатки феруловой кислоты в их структуре наиболее доступны для действия ферулоилэстеразы (в составе отрубей остатки феруловой кислоты преимущественно связывают между собой молекулы ксилана).
В составе свекловичного жома феруловая кислота, наряду с другими ароматическими кислотами, связана с полигалактуроновыми и пектиновыми структурами.
Из всех исследованных субстратов наиболее низкой была реакционная способность пшеничной соломы. Так, действие гомогенной ферулоилэстеразы А. heteromorphus не приводило к образованию феруловой кислоты, при действии КЖ A. heteromorphus наблюдалось образование всего 1,3% (относительных) феруловой кислоты (см. рис. 28). Такая низкая реакционная способность соломы, вероятно, связана с относительно высоким содержанием в её структуре лигнина, который затрудняет доступ ферулоилэстеразы к ферулоильным остаткам.
Необходимо отметить, что под действием КЖ A. heteromorphus из всех субстратов происходило образование гораздо большего количества феруловой кислоты, чем под действием гомогенной ферулоилэстеразы. Это свидетельствует о наличии синергитических взаимодействий ферментов КЖ A. heteromorphus и ферулоилэстеразы. 20 15 10
Условия ГПХ как на рис, 10. Как видно из рисунка 28, в случае гидролиза пшеничных отрубей синергитический эффект был наиболее значительным - под действием КЖ А. heteromorphus выход феруловой кислоты был в 8 раз выше, чем под действием гомогенного фермента. Скорее всего, при гидролизе пшеничных отрубей, речь идет о синергизме между ферулоилзстеразой и ксиланазами [48-50, 54, 57].
Изменения ММР продуктов гидролиза исследованных природных субстратов, детектировали, анализируя методом ГПХ фракции, полученные после окончания гидролиза и растворимые в элюенте (ДМФА, содержащий 0,03М LiBr 0,03М Н3Р04). Условия ГПХ были те же, что и при анализе ММР лигносульфонатов в составе среды для роста грибов белой гнили. В качестве контроля использовали фракции, полученные в тех же условиях, но без добавления фермента.
В случае гидролиза пшеничной соломы не наблюдали изменения ММР растворимых в ДМФА продуктов, как под действием гомогенной ферулоилэстеразы, так и под действием КЖ A. heteromorphus. Эти данные коррелируют с тем, что в процессе гидролиза пшеничной соломы КЖ А. heteromorphus и гомогенной ферулоилзстеразой выход феруловой кислоты был незначительным (см. рис 28).
При гидролизе пшеничных отрубей гомогенной ферулоилзстеразой А. heteromorphus заметных изменений в ММР растворимых в ДМФА продуктов продуктов гидролиза зафиксировать не удалось (рис. 29). При действии же КЖ А. heteromorphus на пшеничные отруби происходило накопление продуктов деструкции в области 194Да (феруловая кислота).
В результате гидролиза свекловичного жома гомогенной ферулоилзстеразой в ММР были отмечены значительные изменения - в частности, происходило накопление низкомолекулярных продуктов гидролиза в области ММР, соответствующей массе феруловой кислоты - 194Да, чем при действии гомогенной ферулоилэстеразы, и ниже - ІЗОДа. При действии КЖ A. heteromorphus-продуктов деструкции с массой 194Да образовывалось больше, чем при действии гомогенной ферулоилэстеразы (см. рис. 30).
Таким образом, пшеничная солома обладает наименьшей реакционной способностью. Наибольшая реакционная способность была характерна для пшеничных отрубей, причем в качестве основного продукта образовывалась феруловая кислота (см. рис. 28, 29). Под действием КЖ A. heteromorphus выход феруловой кислоты был в 8 раз больше, чем при действии гомогенной ферулоилэстеразы, что предполагает наличие синергизма ферулоилэстеразы с другими ферментами КЖ (скорее всего с ксиланазами).
Кроме того, из литературы известно, что особенности строения субстрата могут влиять на каталитичекие свойства ферулоилэстеразы. Например, при выращивании A. niger на пшеничных отрубях образовывалась ферулоилэстераза специфичная по отношению к гидролизу олигосахаров из пшеничных отрубей [47, 49]. Вероятно, что полученная нами в процессе роста на пшеничных отрубях ферулоилэстераза A. heteromorphus, также является специфичной к образованию феруловой кислоты именно из этого субстрата.
Как отмечалось выше, действие КЖА. heteromorphus на пшеничные отруби приводило к образованию значительно большего количества феруловой кислоты, чем при действии гомогенной ферулоилэстеразы (см. рис. 28), что, вероятно, свидетельствует о наличии синергизма между ксиланазой и ферулоилэстеразой А. heteromorphus. Для проверки этой гипотезы мы разработали схему выделения ксиланазы из ферментного комплекса A heteromorphus. Очистку фермента проводили, используя в качестве исходного препарата фракцию, полученную в ходе очистки ферулоилэстеразы и содержащую белки, не связавшиеся с носителем DEAE Spheron в стартовых условиях. И обладавшую наибольшей ксиланазной активностью (42 ед/мг общего белка во фракции). В процессе очистки активность ксиланазы определяли по отношению к глюкуроноксилану березы при 50С, рН 5,0. Очистку ксиланазы проводили с помощью гидрофобной хроматографии на колонке с носителем Phenyl Superose. Стартовый буфер - 0,1М аммоний-ацетатный, рН 5,0 -содержал 1,7М (NH SO Связавшиеся с носителем белки элюировали в градиенте уменьшающейся ионной силы, снижая концентрацию (NHtb SO4 от 1,7М до нуля. Полученная хроматограмма представлена на рисунке 31. Как видно из рисунка, фракции, обладающие максимальной ксиланазной активностью по отношению к глюкуроноксилану березы, выходили при концентрации 0,65М (NH SO Основные результаты очистки ксиланазы представлены в таблице 8.
Трансформация лигносульфонатов под действием грибов
С другой стороны, происходит разрыв С-С связей ароматических колец в составе полимера; это может приводить к уменьшению оптического поглощения на 280 нм и, следовательно, уменьшению высоты основного пика лигнина на ММР. Однако при этом сильного изменения молекулярной массы полимера может не наблюдаться (см. рис. 13, кривая 2, рис, 14, кривые 2-3). Под действием грибов второй группы - P. ostreatus и В. adusta, вероятно, реализуются оба процесса, что приводит к значительному уменьшению высоты основного пика лигниносульфонатов и увеличению низкомолекулярного пика продуктов деструкции в первую фазу роста.
Интересной структурной особенностью лигнина является то, что некоторые фенольные группы боковых цепей остаются свободными, благодаря этому сохраняется способность лигнина к дальнейшей конденсации при дополнительном окислении. На ММР этот процесс отражается в увеличении средней степени полимеризации лигносульфонатов в первую фазу роста и, соответственно, в сдвиге основного пика лигнина в высокомолекулярную область. Вероятно, подобные процессы происходили, в основном, под действием грибов первой группы - D. confragosa и С. unicolor (см. рис. 11, кривая 2, рис. 12, кривая 2).
Таким образом, грибы первой группы (Д confragosa и С. unicolor) в значительной степени полимеризовали лигносульфонаты. Процессы деструкции в первую фазу роста этих грибов были незначительны и сопровождались увеличением средней степени полимеризации до 7000Да. Реполимеризация низкомолекулярных продуктов окисления лигнина сопровождалась образованием высокомолекулярных фракции (до ЗООООДа).
Грибы второй группы В. adusta и P. ostreatus в первую фазу роста вызывали значительное накопление продуктов окисления лигносульфонатов. На ММР в этот период наблюдается существенное уменьшение высоты основного пика лигносульфонатов, образование новых низкомолекулярных пиков и значительное увеличение высоты низкомолекулярного пика в области 140Да. Вторая фаза роста грибов этой группы характеризуется реполимеризацией образовавшихся низкомолекулярных продуктов деструкции. При этом в культуре В. adusta происходило увеличение средней степени полимеризации лигносульфонатов до ЮОООДа. В культуре P. ostreatus таких изменений не происходило. 6.3. Сопоставление данных ГПХ с ферментативной активностью грибов белой гнили.
До 5-6 суток роста во всех культурах не наблюдали лигнолитической активности, в то же время на ММР происходило первое появление низкомолекулярных продуктов деструкции субстрата, т. е. начальная деструкция лигносульфонатов происходила независимо от участия лигнолитических ферментов.- Появление лакказной активности в КЖ С. unicolor и D. confragosa наблюдали, начиная с 6 суток роста. Увеличение активности лакказы в КЖ происходило во вторую фазу роста этих грибов и сопровождалось реполимеризацией низкомолекулярных продуктов окисления полимера (20 сутки для С. unicolor, 8-13 сутки для культуры D. confragosa).
В литературе отмечалась способность лакказ к конденсации фенолов за счет рекомбинации радикалов, образуемых при лакказном окислении [108-109]. С другой стороны, существует точка зрения, допускающая участие лакказы в процессах деструкции лигнина, в частности в катализе процесса деметоксилирования - ключевого этапа биодеструкции [32]. Вероятно, лакказа, образуемая культурами С. unicolor и D. confragosa, параллельно осуществляет оба процесса, однако образование низкомолекулярных фрагментов полимера (деструкция) происходит менее интенсивно, чем процессы конденсации и реполимеризации лигносульфонатов. Таким образом, лакказа С. unicolor и D. confragosa принимает участие скорее в процессах полимеризации, а не деструкции лигносульфонатов.
В культурах P. ostreatus и В. adusta появление лакказы и МП также происходило после появления первых продуктов деструкции лигносульфонатов на ММР. В КЖ P. ostreatus значительное увеличение активности лакказы в КЖ происходило во вторую фазу роста параллельно с процессами реполимеризации на ММР. Однако средняя степень полимеризации лигносульфонатов в КЖ P. ostreatus не менялась, и уровень МП активности был в 4 раза ниже уровня МП в культуре В, adusta. Как видно из рисунка 13, во вторую фазу роста В. adusta на ММР реполимеризация низкомолекулярных продуктов окисления сопровождалась увеличением средней степени полимеризации лигносульфонатов, при этом происходило увеличение МП активности. Таким образом, вероятно непосредственное участие МП В. adusta в процессах реполимеризации лигносульфонатов. Из сопоставления данных о ферментативной активности с результатами ММР лигносульфонатов нами был сделан вывод о том, что ферменты (лакказа для культур С. unicolor и D. confragosa и МП и лакказа для культур В. adusta и Р. ostreatus) участвуют скорее в реакциях полимеризации, а не деструкции лигносульфонатов.
Роль Н2О2 и супероксид-аниона в процессах деструкции/полимеризации лигносульфонатов культурой В. adusta.
В первые сутки роста В. adusta в КЖ не было детектировано лигнолитической активности. В то же время на ММР КЖ наблюдается первичное образование низкомолекулярных продуктов деструкции лигносульфонатов. Возможно происходит за счет неферментных окислителей, например, за счет присутствия в КЖ активных форм кислорода - Н2О2 и супероксид-аниона [115-116], которые продуцируются грибами и участвуют во многих процессах, поддерживающих жизнедеятельность грибов. Кроме того Н2О2, сама по себе окислитель средней силы, является источником наиболее реакционноспособных гидроксильных радикалов - ОН , которые, по мнению некоторых авторов, играют ключевую роль в первичном окислении лигниновой матрицы [115].
Естественную защиту организма от разрушительного воздействия активных форм кислорода осуществляет система внутриклеточных ферментов, основные из которых каталаза и супероксиддисмутаза (СОД). В присутствии каталазы происходит разложение перекиси с образованием атомарного кислорода и воды по реакции 1. В присутствии СОД происходит инактивация супероксид-аниона с образованием перекиси и кислорода по реакции 2:
