Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы 9
Липосомы, как средство доставки лекарственных препаратов 9
З.1. Свойства мембраны 9
3.2. Получение липосом и основные способы загрузки веществ 11
3.3, Классические липосомы 15
3.4 Стерически стабилизированные или Stealth-липосомы 19
3.5. Активно нацеленные липосомы 21
3.5.1. Липосомы, нацеленные с помощью антител 22
3.5.2. Липосомы, нацеленные с помощью других лигандов 24
3.6. Липосомы с контролируемым высвобождением 24
3.6.1. Термочувствительные липосомы 25
3.6.2. рН-Чувствительные липосомы 26
3.7. Активная загрузка липосом , 32
3.7.1. Загрузка липосом с помощью рН-градиента 32
3-7.2, Вторичный рН-градиент»... 38
3.7.3. Загрузка липосом с помощью градиента сульфата аммония 39
4. Результаты работы и их обсуждение ,.43
4.1. Оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных активно загруженных доксорубицином липосом 44
4.1.1. Выбор метода получения первичной дисперсии мультиламеллярных липосом с сульфатом аммония 45
4.1.2. Формирование дисперсии одноламеллярных липосом с сульфатом аммония ,„.46
4.1.З. Создание градиента концентрации сульфата аммония 47
4.1 А Состав буферного раствора дты проведения загрузки липосом доксорубицином 47
4.1.5. Температурный режим загрузки 48
4.1.6. Оценка высвобождения доксорубицина 49
4.1.7- Биологические испытания полученной дисперсии 53
4.2. Создание и обработка методики получения стерически стабилизированных липосомальных препаратов доксорубицина с возможностью иммобилизации химерных белков с доменом' барназы 57
4.3. Оценка эффективности комбинированной терапии опухолей при одновременном использовании липосомальных препаратов с различными действующими началами „„65
4.4. Влияние мочевины на стабильность липосомальной дисперсии 68
4.4.1. Флуоресцентные исследования 69
4.4.2, Оценка микровязкости лапосомального бислоя 70
4.43. Влияние мочевины на активную загрузку липосом доксорубицином при
использовании градиента сульфата аммония 72
5- Экспериментальная часть 74
5.1. Материалы и методы , 74
5.2. Оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных активно загруженных доксорубицином липосом 75
5.2.1. Получение липосом 75
5.2.2. Определение степени загрузки доксорубицина , 82
5.2.3. Определение размера липосом 83
5.2.4. Оценка термочувствительных свойств полученных липосом 83
5-2.5. Определение степени высвобождения доксорубицина из липосом при 43С 83
5.2.6. Биологические испытания 84
5.3. Создание и отработка методики получения стерически стабилизированных липосомальных препаратов доксорубицина с возможностью иммобилизации химерных белков с доменом барназы 86
5.3.1. Контрольный эксперимент 87
5.3.2. Электрофорез 87
5.3.3. Получение электронных микрофотографий 88
5.4. Оценка эффективности комбинированной терапии опухолей при одновременном использовании липосомальных препаратов с различными действующими началами,... 89
5.4.1. Получение липосом с доксорубицином 89
5А2. Получение липосом с аигиостатином , 89
5.4.3. Определение эффективности загрузки 89
5.4.4. Схема эксперимента in vivo 90
5.5. Влияние мочевины на стабильность липосомальпой дисперсии 92
5.5.1. Оценка микровязкости липосомального бислоя 92
5.5.2. Влияние мочевины на активную загрузку липосом доксорубицином при использовании градиента сульфата аммония 93
6. Выводы , 95
7. Благодарности 96
8. Литература 97
- Свойства мембраны
- Оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных активно загруженных доксорубицином липосом
- Материалы и методы
Введение к работе
Липосомы как потенциальные средства доставки лекарственных веществ рассматривались еще с середины 60-х годов прошлого века. Для этого есть множество причин:
• небольшой размер липосом (минимальный размер около 25 нм), благодаря чему достигается эффект пассивного нацеливания (вплоть до 200 нм);
• биосовместимость (липосомы состоят из фосфолипидов и холестерина -природных, не токсичных веществ);
• способность к включению как амфифильных, так и гидрофобных веществ (Рис. 1);
• защита инкапсулированного вещества от преждевременной деградации;
• обеспечение внутриклеточной доставки.
Наряду с положительными качествами у липосом есть и недостатки:
• невозможно длительное хранение готовых липосомальных препаратов без лиофилизации;
• быстрое поглощение макрофагами липосом (без специальной модификации), и( как следствие, малое время циркуляции в кровотоке.
Хотя классические липосомы увеличивают эффективность включенных веществ» по крайней мере, в некоторых случаях, значительная часть введенных липосом захватывается макрофагами. Для устранения этого недостатка были разработаны липосомы с увеличенным временем циркуляции. Гидрофильная оболочка подобных липосом ограничивает их распознавание и захват клетками ретикуло-эндотелиальной системы, что приводит к аккумулированию липосом во внеклеточном пространстве опухолевой ткани.
В течение последних десятилетий были предприняты попытки увеличить селективность накопления терапевтических агентов в тканях опухоли. Так как большинство лекарственных препаратов не имеют сродства исключительно к тканям опухоли, были разработаны коныогаты, в которых молекула эффектора была присоединена непосредственно к нацеливающему лиганду. Для того, чтобы увеличить количество молекул лекарственного вещества, доставляемого в клетку-мишень, в качестве средства доставки также были предложены липосомы. Присоединение к поверхности липосом лигандов, селективно распознающих и связывающихся со специфическими мишенями, которые экспрессируются на поверхности клеточных мембран, позволяет липосомалыюму эффектору проникать внутрь клетки, что увеличивает эффективность терапии. Дальнейшим интересным развитием липосомалъных систем доставки лекарственных препаратов является создание эффективных систем с контролируемым высвобождением.
Эффективное комбинирование различных подходов является одним из путей преодоления указанных недостатков, а разработка технологичных схем получения липосомальных препаратов позволит нарабатывать их для полномасштабных испытаний и, при положительном результате последних, для терапии.
Целями данной работы являлись:
1. Разработка и оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных липосом, загружаемых доксорубицином против градиента сульфата аммония. Исследования и биологические испытания in vitro и in vivo указанного препарата.
2. Создание и отработка методики, позволяющей оперативно получать липосомальные препараты с различными нацеливаЕОщими лигандами.
3. Получение комбинированных липосомальных препаратов на основе веществ, различающихся по природе проявляемой противоопухолевой активности. Оценка эффективности in vivo терапии злокачественных новообразований подобными препаратами.
Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ им. М. В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы № 1Б-5-856 «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств», а также по грантам президента РФ по поддержке ведущих научных школ № HIII-2329.2003.4 и № РИ-112/001/609. гт постати жжаргшещюш пщпщу&т&ъ во многом &0Ш7СШЩНЄЙ. вещества п липоахшльнш бислое при включетт гидрофильных (и), гидрофобных (ф г амфыфиямтх Щ вщеежв. мшбраны например ВВОДІ холестерин nsm шшщашыс фосфмшшды с ДЛШШЬШЙ апильными цепями, либо, наоборот, увеличить ее проницаемость (например, используя природные еРС или sPC), Также возможно получение термо- и рН-чувствительных липосом, которые при нормальных условиях имеют достаточно жесткую мембрану, а при повышении температуры (в случае термочувствительных липосом) или понижении рН среды (для рН-чувствительных) проницаемость мембраны резко увеличивается. Известно, что повышенная температура и ацидоз свойственны опухолевым тканям. Также известно, что в эндосомах поддерживается уровень рН около 5, таким образом, при попадании рН-чувствительной липосомы внутрь эндосомы может произойти слияние их мембран, обеспечивая выход лекарственного вещества в цитозоль, минуя лизосому (тем самым, избегая разрушения вещества). Термочувствительные липосомы состоят, как правило, из таких липидов как DPPC, DSPC, DOPC и др. [1, 2], для рН-чувствительных липосом -фосфолшшды, подобные плазменилФХ [3] (Рис. 2), или содержащие амфифильные карбоновые кислоты [4].
Липидный состав мембраны влияет и на ее заряд, что также имеет большое значение для свойств липосомалыюй лекарственной формы и применения ее в определенных условиях, Так, Nakanishi с сотр- [5, 6] изучали влияние заряда поверхности линосом на эффективность их поглощения макрофагами, а также на индуцирование липосомами (с включенными в них антигенами) иммунного ответа. В работах сравнивали поглощение макрофагами незагруженных нейтральных, положительно и отрицательно заряженных липосом, а также аналогичных липосом с одинаковым количеством загруженного в них яичного альбумина. Выяснилось, что поглощение макрофагами положительно заряженных липосом происходит значительно быстрее, чем нейтральных и отрицательно заряженных. Также было показано, что положительно заряженные липосомы с яичным альбумином функционировали как более мощный индуктор иммунного ответа, чем отрицательно заряженные и нейтральные липосомы, содержащие одинаковое количество яичного альбумина. Данные результаты говорят о том, что положительно заряженные липосомы могут использоваться как эффективное средство доставки белковых антигенов в макрофаги (или в другие антиген-представляющие клетки).
Однако зачастую активное поглощение макрофагами липосомальных препаратов нежелательно (например, требуется длительное время циркуляции вещества в кровотоке для реализации эффекта пассивного или активного нацеливания). В таких случаях мембрану липосом модифицируют встраиванием в нее PEG, получая так называемые стелс-липосомы (Stealth-liposomes). Также для направленной доставки мембрана липосом модифицируется путем введения молекулярного адреса (антитела или лиганда, специфического для клеток ткани-мишени) [7], часто эти две модификации используются совместно.
Свойства мембраны
Существуют разные способы получения липосом, кавдый из которых имеет свои преимущества и недостатки, поэтому выбор метода, л основном, зависит от задач, поставленных при разработке той или иной липосомалыюй формы.
Наиболее просто получаются мультиламеллярные липосомы, однако их значительный размер (до 100 мкм) ограничивает их применение, так, например они не могут использоваться для внутривенного введения.
Широко распространен способ получения липосом из мультиламеллярных везикул путем экструзии через ядерные фильтры (пожалуй, самый распространённый в настоящее время способ), В данном случае размер частиц будет зависеть от размера лор мембраны. При применении пресса Френча получают липосомы, размер которых зависит от липидного состава [8]. Иногда вместо экструзии применяют ультразвуковую обработку, однако этот метод может привести к попаданию в дисперсию частиц металла с наконечника диспергатора, индуцированию окисления липидов (по сравнению с предыдущим методом); этот способ также нежелателен при введении в липосомы биополимеров (белков, ДНК), В случае использования перечисленных методов лекарственное вещество в основном вносится при получении мультиламеллярных везикул: в органическом растворителе при получении липидной пленки (гидрофобное вещество), либо в водном растворе (гидрофильное вещество) на стадии гидратировапия липидной пленки.
Однако существует и другой способ введения вещества в липосомы - активная загрузка. В этом случае вещества вносится в уже сформированные липосомы под воздействием градиента рН [9] или сульфата аммония [10]. В этом случае процент включившегося вещества достигает 99% от исходного количества. Т. Ishida с сотр. [11] использовали активную загрузку (под воздействием градиента сульфата аммония и градиента рН) в Лс для лекарственного вещества фасудила для возможной доставки в мозг. В результате наилучшая эффективность включения вещества выше 95% была достигнута с использованием градиента сульфата аммония при соотношении вещество/липид 0.364 моль/моль,
В основном, способ активной загрузки известен для пизкомолекулярпых веществ небелковой природы, однако S.IL Hwang с сотр. [12] изучали активную загрузку бычего сывороточного альбумина (BSA) и инсулина в нейтральные и положительно заряженные липосомы при трансмембранном градиенте рН и при традиционной для белкиъий загрузки методике обращения фаз. Выяснилось, что:
инсулин лучше включается в положительно заряженные липосомы, чем в нейтральные, особенно при рН-градиентном методе;
при использовании рН-градиентного метода инсулин распределен по поверхности лииосом больше, чем при использовании метода обращения фаз;
ВЗА проявляет большее сродство к положительно заряженным, чем к нейтральным липосомам при любом методе получения липосом;
рН-градиентный метод не увеличивает загрузку BSA по сравнению с методом обращения фаз.
Иногда не удается добиться желаемой загрузки вещества в липосомы. Так, например, М. Ceruti с сотр. [13] сообщают об исследовании солюбилизации плохо растворимого в воде противоопухолевой субстанции паклитаксела. Для этого вещества не удалось добиться удовлетворительной эффективности включения, однако эта проблема была успешно решена включением в Лс растворимых prodrugs паклитаксела, наилучшим из которых было 2-mPEG производное (6,5 мг/мл). Полученные липосомы были стабильны и при исследовании активности in vitro не уступали исходному лекарственному средству.
Одним из перспективных способов получения липосом является получение липосом из пролипосом. Пролипосомы это субстанция, которая при разбавлении водой дает Лс без дополнительных обработок ультразвуком, экструзией и т.д. Пролнпосомы могут быть как жидкими (липосомы из них получают при разбавлении водой) [14] так и твердыми, обычно в этом случае как вспомогательное вещество применяют сорбит, (линидный слой на порошок сорбита наносится выпариванием из раствора липидов органического растворителя) [15].
Оптимизация полупромышленного метода получения стерически стабилизированных термочувствительных активно загруженных доксорубицином липосом
В ходе данного исследования были оптимизированны условия для получения стерически стабилизированных липосом, активно загруженных доксорубицином, причем особое внимание было уделено простоте и технологичности разрабатываемого метода, который позволял бы нарабатывать липосомальный препарат в количествах, необходимых для доклинических и клинических испытаний, а в перспективе и для терапии. Многие приемы и методы, используемые в условиях лабораторных наработок препаратов, не могут быть применены для полупромышленного производства, из-за сложности технического воспроизведения в увеличенных масштабах. Основной задачей данной части работы была разработка схемы производства липосомалыюго препарата максимально простой по исполнению и, вместе с тем, обеспечивающей приемлемые потребительские качества готового препарата.
Выбор метода получения первичной дисперсии мультиламеллярных липосом с сульфатом аммония
Необходимость проявления термочувствительных свойств получаемыми липосомами определила используемый липидный состав, а требования к наличию стернческой стабилизации обуславливают наличие пегелироваппого DSPE. Поскольку формирование липосом в растворе включаемого вещества не обеспечивает высокого соотношения доксорубицин/липиды, для адаптации под полупромышленную схему выбирали методы, основанные на т. п. активной загрузке.
В качестве базовой была выбрана методика загрузки с использованием градиента сульфата аммония (NHO2SO4 [10]. Первоначально использовалась схема, по которой спиртовой раствор липидов смешивается с водным раствором сульфата аммония, после чего спирт удаляется на роторном испарителе, в результате формируется исходная дисперсия мультиламеллярных везикул. Данный подход прост в техническом смысле, однако существенным недостатком такого подхода являеіся необходимость заранее добавлять некоторый избыток воды, так как спирт испаряется в виде азеотропной смеси. Кроме того, некоторая часть спирта при использовании такого метода неизбежно сохраняется в исходной дисперсии, что неконтролируемым образом негативно влияет на степень загрузки целевого вещества. Для дисперсий, полученных с использованием данного подхода, степень загрузки колебалась от 18% до 60% при весовом соотношении субстанция/липиды 0.14. Кроме того, снижается и стабильность липосомальной дисперсии в целом (образование агрегатов, видимых невооруженным глазом, происходит в течение первых суток хранения).
После анализа возможных причин неудовлетворительной воспроизводимости методики использовали следующую схему получения исходной дисперсии. Из раствора липидов в хлороформе на роторном испарителе формируется липидная пленка, которая впоследствии высушивается в вакууме лиофильной сушки (0.04-0.05 мбар) для максимального удаления органического растворителя. Недостаточное высушивание, как и в описанном выше случае, приводит к снижению степени загрузки целевого вещества до значений--40%.
Использование серии циклов замораживания-оттаивания, хотя и описывается в классических методиках получения липосом, как процедура, увеличивающая монодисперсность, а для некоторых веществ и эффективность включения [69], является при получении сравнительно больших объемов трудоемким и нетехнологичным этапом. В лабораторных условиях замораживание дисперсии можно проводить в жидком азоте, и при объемах порядка 1-3 мл сделать это достаточно просто, но увеличение объема хотя бы на порядок создает серьезные трудности.
В серии экспериментов мы показали, что для данного липидного состава отсутствие указанной стадии не влияет ни на величину загрузки, ни на стабильность дисперсии, что позволило нам исключить данную манипуляцию из технологической схемы.
Гидратацию липидной пленки проводили 250 мМ раствором сульфата аммония при механическом встряхивании выше температуры фазового перехода используемой смеси липидов (50С).
Материалы и методы
Еще одним методом увеличения эффективности является комбинированное применение препаратов различной природы и/или механизма действия. Перспективным, по нашему мнению, может быть одновременное применение цитотоксических и аитиангиогенных субстанций, В качестве цитотоксической составляющей использовался доксорубицин, в качестве антиангиогенной — белок ангиостатин. Применение этого белка существенно замедляет рост опухоли и вызывает устойчивую ремиссию, но отмена терапии может привести к рецидиву заболевания и повторному развитию опухоли. Однако использование ангиостатина затруднено недостаточным временем жизни белка в кровеносном русле. Учитывая преимущества пассивного нацеливания и защиты от преадевременной деградации, которую обеспечивают липосомы, идея использовать липосомальный препарат ангиостатина совместно с липосомальным препаратом доксорубицина кажется привлекательной.
В рамках совместных исследований с Московским научно-исследовательским институтом медицинской экологии испытывались липосомальные препараты с ангиостатином и доксорубицином для сравнения их активности с активностью растворов этих веществ ш vivo.
Для биологических испытаний были приготовлены липосомальные препараты:
Ангиостатин в липосомах; концентрация липидов 25 мг/мл, размер частиц 100 нм, концентрация ангиостатина б мг/мл;
Доксорубицин в липосомах: концентрация липидов 50 мг/мл, размер частиц 100 им, концентрация доксорубицина 0,95 мг/мл;
Контроль пустые липосомы, концентрация липидов 25 мг/мл, размер частиц 100 нм.
Липидный состав для всех образцов — ePC/Chol 7/3. Липосомы с доксорубицином получали активной загрузкой против градиента сульфата аммония. Дисперсию мультиламеллярных везикул получали гидратацией липидной пленки 250 мМ раствором сульфата аммония, Моноламеллярные везикулы получали экструзией через мембрану с диаметром пор 100 нм.
Лигтосомы с ангиостатином получали экструзией через такие же мембраны дисперсии мультиламеллярпых везикул, полученных гидратацией липидной пленки водным раствором белка.
Совместное применение двух липосомальиых препаратов, полученных раздельно, предпочтительно с нескольких точек зрения:
1) Различия в методиках получения липосомальиых препаратов, вызванные природой загружаемых веществ, могут существенно усложнить технологию получения препарата, частицы которого будут одновременно содержать обе субстанции,
2) Решается проблема возможной химической несовместимости действующих веществ.
3) Более гибкая методика применения, позволяющая варьировать соотношение применяемых субстанций в каждом конкретном случае.
4) Мишени используемых субстанций могут иметь различную локализацию в опухоли,
Эффективность включения веществ в липосомы определяли через сутки после получения, для доксорубицина степень загрузки составила 85%, для ангиостатана — 14%.
Испытания противоопухолевой активности полученных липосомальиых препаратов проводились на мышах С57В1/6 с привитой меланомой линии В165. Результаты испытаний приведены в Табл. 4.
Таким образом, на 38 день эксперимента объем опухоли у животных для лечения которых применялся раствор доксорубицина совместно с раствором ангиостатана, на 12% меньше, чем в случае применения только доксорубицина; тогда как объем опухоли у животных, для лечения которых применялся липосомальный доксорубицина совместно с липосомалъным ангиостатином, на 30% меньше, чем в случае применения только липосомального доксорубицина (Рис. 35).
