Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Некоторые представления о гипергликемических состояниях 9
1.2. Роль кисломолочных продуктов в норме и патологии 18
1.3. СОг-экстракты — потенциальные лечебные препараты 26
Собственные исследования и их обсуждение
Глава 2. Материал и методы исследования 33
Глава 3. Характеристика СОг-экстрактов и эмульсий 42
3.1. Физико-химические свойства СОг-экстрактов лекарственных растений 42
3.2.Физико-химические свойства эмульсий лекарственных растений... 45
3.3. Некоторые биологические эффекты эмульсий и композиций 50
Глава 4. Влияние СОг-эмульсий на гииергликемические состояния у мышей 57
4.1. Мыши с индуцированной гипергликемией и экспериментальным дитизоновым диабетом 57
4.2. Влияние антидиабетических композиций (АДК) на транспорт углеводов 78
Глава 5. Нивелирование гипергликемии кисломолочными продуктами, обогащенными С02-эмульсиями лекарственных растений 85
5.1. Характеристика кисломолочных продуктов после введения С02-эмульсий 85
5.2. Влияние кисломолочных продуктов, содержащих АДК, на организм мышей с индуцированной гипергликемией 96
5.3. Влияние кисломолочных продуктов, обогащенных АДК, на метаболизм мышей с дитизоновым диабетом 106
5.4. Изменение транспорта глюкозы в организме мышей, потреблявших кисломолочные продукты с АДК 111
Заключение 119
Выводы 127
Практические предложения 129
Список использованных литературных источников 130
Приложения 152
- Некоторые представления о гипергликемических состояниях
- Материал и методы исследования
- Физико-химические свойства СОг-экстрактов лекарственных растений
Введение к работе
Актуальность темы. Профилактика и коррекция нарушений углеводного обмена, в том числе гипергликемических состояний, являются одной из важнейших задач современной науки. Гипергликемия развивается при панкреатитах, различных заболеваниях печени, эндокринной, нервной системы и др. При сахарном диабете, который в общей структуре заболеваемости и смертности занимает третье место, гипергликемия является ведущим фактором риска [9, 48].
Известно, что только снижение уровня глюкозы в крови при
гипергликемических состояниях существенно облегчает течение болезни.
Исходя из этого для снижения уровня глюкозы в крови, например, при
сахарном диабете используется инсулин, бигуаниды, тиазолидиндионовые
препараты, прандиальные регуляторы гипергликемии, препараты
сульфанилмочевины, настои и отвары лекарственных растений
гипогликемического действия и т.д. [11, 38, 80]. Разработка новых продуктов и методов для нивелирования гипергликемии все еще представляет весьма актуальную задачу. Одним из инновационных подходов в этом отношении может быть использование технологии ССЬ-экстрактов [60, 115].
Благодаря этой технологии из растительного сырья практически полностью извлекаются все биологически активные вещества. В результате существенно повышается терапевтическая ценность фитоэкстрактов, рентабельность производства, расширяется спектр их применения. До настоящего времени многообразие влияний СОг-экстрактов на организм человека и животных изучено недостаточно, хотя имеются отдельные наблюдения, в которых показано позитивное действие таких экстрактов [114, 129].
В литературе до сих пор отсутствуют исследования по влиянию на организм с различными формами гипергликемии диетических продуктов
питания, в первую очередь кисломолочных, обогащенных СОг-экстрактами гипогликемического действия. Между тем использование подобных СО2-экстрактов из лекарственных растений в качестве биодобавок для производства пищевых продуктов функционального назначения позволит существенно расширить ассортимент эффективно действующих и экологически чистых компонентов питания в лечебно-профилактических диетах гипогликемического назначения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка кисломолочных продуктов, обогащенных СОг-экстрактами лекарственных растений гипогликемического действия.
Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:
изучить физико-химические свойства ССЬ-экстрактов лекарственных растений гипогликемического действия;
модифицировать технологию получения С02-эмульсий, изучить их свойства и биотическое действие;
составить на основе С02-эмульсий композиции гипогликемического действия и изучить их влияние на организм мышей с индуцированной гипергликемией и дитизоновым диабетом;
разработать технологию введения СОг-композиций в кисломолочные продукты «Наринэ», «Иммунолакт» и «ЭМ-курунга»;
- изучить влияние кисломолочных продуктов, обогащенных CCV
композициями, на организм мышей с индуцированной гипергликемией и
экспериментальным диабетом.
Научная новизна. Впервые изучены физико-химические свойства
СОг-экстрактов и СОг-эмульсий лекарственных растений
гипогликемического действия. Составлены три композиции на основе С02-эмульсий мяты перечной, листьев шелковицы и грецкого ореха, лавра, эвкалипта, земляники, виноградной косточки с отчетливо выраженным гипогликемическим, гипохолестеринемическим и гипоуреоемическим
действием. Установлено, что разработанные композиции в крови у мышей с индуцированной гипергликемией и дитизоновым диабетом снижают содержание глюкозы на 14,5-21,4%, холестерина - на 4,5-22,2%, а уровень мочевины у животных с дитизоновым диабетом - на 31,0-34,5%).
Впервые выведены дозы и разработаны технологии кисломолочных продуктов, обогащенных С02-эмульсиями лекарственных растений гипогликемического действия. Установлено, что кисломолочные продукты «Наринэ», «Иммунолакт», «ЭМ-курунга», содержащие СОг-эмульсии лекарственных растений гипогликемического действия, в крови у мышей с индуцированной гипергликемией и дитизоновым диабетом снижают уровень глюкозы на 18,6-38,7%, холестерина на 8,6-27,7%», мочевины - на 8,9-38,6%» соответственно, восстанавливая при этом нарушенную толерантность мышечной и жировой ткани к углеводам.
Практическая значимость. Впервые для нивелирования различных гипергликемий предложено использовать ССЬ-эмульсии лекарственных растений гипогликемического действия. Разработаны три, наиболее эффективные в этом отношении, ССЬ-композиции. Разработаны технологии трех кисломолочных продуктов («Наринэ», «Иммунолакт», «ЭМ-курунга»), обогащенных ССЬ-композициями гипогликемического действия. Экспериментально обоснована возможность применения указанных кисломолочных продуктов для повышения в крови животных с индуцированной гипергликемией и дитизоновым диабетом содержания гемоглобина, общего белка и снижения уровня глюкозы, холестерина, мочевины. Разработаны и утверждены ТУ на кисломолочный продукт «Профилакт D» № 9222-001-00493497-2008. Результаты работы используются в производстве и подтверждены актами о внедрении на молочных заводах Саратовской и Самарской областей, а также в компании ООО «Караван» г. Краснодар, производящей С02-экстракты.
Основные положения, выносимые на защиту:
Изучены физико-химические, микроскопические и биологические свойства СОг-экстрактов и ССЬ-эмульсий лекарственных растений гипогликемического действия, созданы СОг-композиции.
Композиции на основе ССЬ-эмульсий лекарственных растений гипогликемического действия (0,1мл/20г массы мыши) снижают концентрацию глюкозы, холестерина и мочевины в крови мышей с индуцированной гипергликемией и дитизоновым диабетом, восстанавливают толерантность периферических тканей к глюкозе.
Выведены дозы и составлены технологические схемы изготовления кисломолочных продуктов, обогащенных СОг-композициями.
4. Кисломолочные продукты «Наринэ», «Иммунолакт» и «ЭМ-
курунга», обогащенные С02-композициями лекарственных растений
гипогликемического действия, у мышей с гипергликемией и дитизоновым
диабетом снижают в крови уровень глюкозы и холестерина, восстанавливают
нарушенную толерантность мышечной и жировой ткани к углеводам.
Апробация работы. Результаты научных исследований были представлены на: Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 119-й годовщине со дня рождения Н.И. Вавилова (г. Саратов, 4-8 декабря 2006 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Управление функциональными системами организма» (г. Ставрополь, 2006 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 120-й годовщине со дня рождения Н.И. Вавилова (г. Саратов, 26-30 ноября 2007 г.); научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы (г. Саратов, 2007-2008 гг.); Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию Саратовского госагроуниверситета ( г. Саратов, 26-27 ноября 2008 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, из них 4 статьи, 2 из которых — в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений и списка литературы включающего 222 наименований, в том числе 43 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 31 таблицей, 24 рисунками и изложена на 157 страницах.
Некоторые представления о гипергликемических состояниях
Нарушения углеводного обмена, характеризующиеся повышением уровня глюкозы, встречаются довольно часто. Гипергликемия развивается при многих патологических состояниях и заболеваниях: сахарный диабет, гипертоническая болезнь, различные заболевания печени, эндокринной, центральной нервной системы и др. [7, 9, 48]. Гипергликемия наблюдается в ранний период развития акромегалии, при хронических инфекциях, опухолях мозга и эндокринных желез, гипертонии и других заболеваниях. Некоторые медикаменты (никотин, кофеин, хинин) и анестезирующие средства также способны повышать уровень глюкозы в крови [48, 51, 186, 189]. По данным американских авторов, гипергликемия встречается у 6,6% населения, а 11,2% населения имеет нарушения толерантности к глюкозе. Однако, такие данные неоднозначны. Известны сведения, что гипергликемия встречается лишь у 2% населения США [180, 195, 199, 203, 208, 218].
Гипергликемия - наиболее характерное проявление сахарного диабета. У больных диабетом взаимосвязи между поджелудочной железой и обменом углеводов существенно нарушены. Это связано с тем, что у больных сахарным диабетом, инсулин либо не вырабатывается, либо организм обеспечивается этим гормоном недостаточно [9, 28, 32, 33, 44, 141]. Образуется инсулин только в секреторных гранулах в виде крупной молекулы — проинсулина, от которой для этого отщепляется пептид, содержащий 33 аминокислоты. Этот осколок молекулы получил название С-пептида. У здоровых людей наблюдают две фазы выхода инсулина из 3-клеток. Первая фаза характеризуется высвобождением инсулина в течение нескольких минут после внутривенного введения глюкозы и отражает высвобождение инсулина, хранившегося в (3-клетках. Вторая фаза секреции инсулина характеризуется выходом в кровь вновь синтезируемого инсулина. Выход в кровь инсулина регулируется содержанием в ней глюкозы. При превышении уровнем глюкозы определенного порога включается в действие система аденилатциклазы, а образующийся при этом циклический аденозинмонофосфат дает сигнал для секреции инсулина. Этот механизм определяет уровень базальной секреции инсулина и обеспечивает поддержание концентрации глюкозы крови в пределах нормы [48, 49, 79, 109, 185,222].
Взаимодействуя с рецепторами клеток, инсулин стимулирует подход к клеточным мембранам специфических белков — переносчиков глюкозы, которые и транспортируют ее в клетку. Установлено, что инсулин таким, опосредованным действием, усиливает проницаемость мышечной и жировой ткани для глюкозы и тем самым стимулирует поступление ее из крови в эти ткани. Стимулирующее влияние инсулина на проницаемость мембран клеток обусловлено связыванием его дисульфидной группы с сульфгидрильными группами мембранных белковых рецепторов. Кроме того, высказано предположение, что, инсулин может фиксироваться на молекуле гексокиназы также путем образования дисульфидных связей. Это предотвращает ингибицию гексокиназы глюкокортикоидами, которые при инсулиновой недостаточности блокируют активный центр фермента. В присутствии инсулина же глюкокортикоиды взаимодействуют с ним, образуя гормональный липопротеидный комплекс, что освобождает активный центр гексокиназы [33, 93, 183, 196, 210]. Наряду с указанными эффектами, инсулин индуцирует образование гликогенсинтетазы, способствуя биосинтезу гликогена в печени, а также тормозит активность глюкозо-6-фосфатазы — одного из ключевого фермента глюконеогенеза.
Итак, причины гипергликемии могут быть, следующие:
а) уменьшение поступления в мышечную и жировую ткань глюкозы, недостаточная ее утилизация и торможение превращения в жир;
б) избыточное поступление глюкозы из печени в кровь вследствие подавления глюкокиназной реакции; в) замедление синтеза гликогена; г) усиление образования глюкозы из аминокислот благодаря торможению синтеза белка и активации глюкокортикоидами ключевых ферментов необходимых для образования глюкозы de novo [21, 132].
Гипергликемия является важной причиной развития системных реакций на уровне целостного организма. Она сопровождается усилением генерации свободных радикалов вследствие аутоокисления глюкозы и неферментативного гликилирования, ингибицией системы антиоксидантной защиты [9, 33, 101]. Существует гипотеза, что подъемы гликемии генерируют окислительный стресс, который, однако, ослабляется под влиянием естественных защитных антиоксидантних механизмов плазмы. Эта гипотеза подтверждена тем фактом, что на другие потенциальные побочные эффекты, индуцированные гипергликемией (такие как вазоконстрикция), можно влиять антиоксидантами [101].
Влияние гипергликемии на организм широко изучено при сахарном диабете (СД). Исходя из этого, в настоящее время сахарный диабет рассматривается не как определенная нозологическая форма, а как синдром первичной гипергликемии, возникающий в результате многих- причин [21, 80]. Уже в первых эпидемиологических исследованиях, проведенных в 50-х годах XX века, были показаны различия не только распространенности, но и клинических проявлений СД в различных странах. Они позволили считать, что распространенность диабета связана с различиями факторов внешней среды, особенностями популяций (генетическими, демографическими), концентрацией факторов риска СД в популяциях (избыточная масса тела, артериальная гипертония, распространенность сердечно-сосудистых заболеваний, гиперлипидемий и др.). Эти исследования выявили четкие различия в распространенности двух основных типов СД: инсулинозависимого (ИЗСД), сегодня называемого СД типа I, и инсулиннезависимого (ИНСД), называемого СД типа II. С их помощью был идентифицирован новый тип СД - тропический диабет, включающий три подтипа: диабет, связанный с фиброкальцинозом поджелудочной железы, с недостаточным поступлением белка с пищей и нарушениями всасывания в кишечнике, постоянным употреблением в пищу кассавы (тапиоки). Этот вариант отнесен к диабету в результате поражения экзокринной части поджелудочной железы [10, 21, 48, 172, 179, 205].
Приведем современную классификацию нарушений гликемии при СД:
1. Сахарный диабет типа I (деструкция р-клеток, обычно приводящая к абсолютной инсулиновой недостаточности): а) аутоиммунный; б) идиопатический.
2. Сахарный диабет типа II (развивается в результате резистентности к инсулину или в результате резистентности к инсулину, сочетающейся с относительной инсулиновой недостаточностью).
3. Другие специфические типы диабета: а) генетические дефекты Р-клеточной функции; б) генетические дефекты в действии инсулина;
в) болезни экзокринной части поджелудочной железы;
г) эндокринопатии; д) диабет, индуцированный лекарствами или химическими реагентами; е) инфекции; ж) необычные формы иммуноопосредованного диабета; з) другие генетические синдромы, иногда сочетающиеся с диабетом.
4. Гестационный сахарный диабет.
Соотношение СД типа I и типа II составляет 1:10. СД типа I составляет в общей популяции от 0,1 до 1%, СД типа II - 2-10%. Факторы риска СД различны по природе и неодинаковы для диабета типа I и типа П. Для диабета типа I факторами риска являются: определенные вирусные инфекции (краснуха, ветряная оспа, эпидемический паротит, эпидемический гепатит), токсические вещества (N-нитрозамины, родентициды, цианистые соединения, мочевая кислота), отягощенная по СД наследственность, гаплотипы HLA В8, DW3, DWR3, В15, DW4, DRW4 и их сочетания. Патогенетическая последовательность развития СД типа 1 такова: генетическая предрасположенность—» воздействие внешней среды—» аутоиммунная деструкция Р-клеток—» сахарный диабет [48, 184, 216, 219, 220].
СД типа II представляет собой довольно гетерогенную группу нарушений углеводного обмена, которые объединяются на основании общности следующих показателей: для них характерна сниженная чувствительность тканей к инсулину (особенно клеток печени и мышц) и нарушение функции Р-клеток островков поджелудочной железы. На приведенной ниже схеме (рис. 1) видна возможная многокомпонентность механизма инсулинорезистентности. На каждом этапе прохождения глюкозы в инсулинозависимые клетки может возникать дефект. Однако, несмотря на убедительные доводы в пользу первичности секреторной дисфункции Р-клеток, многие ученые рассматривают инсулинорезистентность периферических тканей как главное патогенетическое звено СД типа II [6, 32, 190,193,195,201,209].
Материал и методы исследования
Основными задачами нашего исследования являлись: изучение физико-химических характеристик С02-экстрактов, разработка технологий изготовления С02-эмульсий и их введения в кисломолочные продукты, составление композиций гипогликемического действия на основе эмульсий С02-экстрактов лекарственных растений, изучение влияния кисломолочных продуктов «Наринэ», «Иммунолакта», «ЭМ-курунги», обогащенных С02-экстрактами, на организм здоровых мышей и мышей с индуцированной гипергликемий или дитизоновым диабетом . Для оценки биотического действия ССЬ-экстрактов лекарственных растений нами были изучены: мята перечная, шелковица, грецкий орех, лавр, эвкалипт, земляника, виноградная косточка. Для дальнейшего понимания логики эксперимента представим краткую характеристику этих растений, которые, как известно, являются сбалансированным природой источником биологически активных веществ (табл. 4).
Нами были изучены физико-химические свойства СОг-экстрактов согласно требованиям ГФ XI. С этой целью определяли относительную плотность СОг-экстрактов пикнометрическим методом, процент сухого остатка путем высушивания образца до постоянной массы при температуре 105-110С в термостате. Кроме того, определяли кислотное, перекисное, эфирное числа и число омыления изучаемых СОг-экстрактов [36].
Практическое применение цельных С02-экстрактов затруднено из-за сложности их дозирования и необходимости разработки специальных форм введения в организм. Исходя из этого нами из СОг-экстрактов мяты перечной, виноградной косточки, листьев ореха грецкого, шелковицы, земляники, лавра и эвкалипта изготавливались 3% водные эмульсии [4, 76].
В качестве эмульгаторов использовали Lamegin ZE 609 и Lamesorb SMO 20. Качество приготовленных эмульсий оценивали с помощью микроскопа (окуляр 7, объектив 8). Устойчивость эмульсий определяли путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут и термостатирования в течение 10 минут при 50С [74, 75].
Далее из 3% эмульсий нами были составлены антидиабетические композиции (табл. 5), анализ которых проводился согласно указанным выше методикам.
Последующие исследования проводили на лабораторных белых беспородных мышах, содержащихся на стандартном рационе вивария кафедры. Всего в опытах было использовано 275 животных.
Нами было изучено влияние эмульсии СОг-экстрактов мяты перечной, листьев шелковицы, грецкого ореха по отдельности, а затем их композиции (АДК-1) на организм здоровых лабораторных животных. Для этого здоровым мышам в течение двух недель два раза в день per os вводили по 0,005 г 3% эмульсии соответствующих С02-эктрактов или АДК-1. По окончании опыта, мышей взвешивали, декапитировали, взвешивали внутренние органы, а в крови определяли содержание гемоглобина, белка, мочевины, глюкозы, холестерина согласно известным методикам [13, 14, 30, 39, 45, 99, 112, 163].
В следующей серии экспериментов, было изучено влияние АДК-1,2 и 3 на организм мышей с индуцированной гипергликемией или экспериментальным дитизоновым диабетом. Гипергликемию вызывали путем ежедневного, в течение десяти дней, подкожного введения животным 0,1 мл 40% раствора глюкозы. Для моделирования экспериментального диабета было апробировано несколько способов однократного введения дитизона (ТУ 6-09-07-1684-89): подкожное, внутрибрюшинное, внутривенное. Подкожное введение дитизона практически не изменяло содержание глюкозы в крови. При внутрибрюшинном введении мышам дитизона в дозе 40 мг/кг подъем уровня глюкозы крови оказывался более существенным. Поэтому в этой серии экспериментов было несколько групп мышей. Этим животным предварительно, в течение двух недель, per OS, вводили эмульсию ССЬ-экстракта мяты перечной, шелковицы или грецкого ореха. Дозу введения СОг-эмульсий определяли исходя из того, что человек с средней массой 70 кг ежедневно в течении 6 месяцев может потреблять 2 мл эмульсии (т.е. всего 180 мл). Для мыши массой 20 г потребление СО2-эмульсий за 10 дней опыта составляет 0,1 мл. Следовательно, ежедневно мыши массой 20 г должны потреблять 0,01 мл СОг-эмульсии.
Физико-химические свойства СОг-экстрактов лекарственных растений
Физико-химическую оценку СОг-экстрактов виноградной косточки, листьев грецкого ореха, мяты перечной и шелковицы мы проводили согласно ГФ XI. С02-экстракты представляли собой жидкости, цвет которых колебался в широких пределах от светло-желтого (виноградная косточка) до темно-зеленого (шелковица). Все СОг-экстракты имели специфический запах и вкус растения, из которого были выделены. Для всех экстрактов была характерна вязкая консистенция; у СОг-экстракта грецкого ореха отмечалось наличие сплошного фона мельчайших частиц.
Плотность СОг-экстрактов колебалась от 0,8672±0,0136 до 1,1525±0,0102 г/см и была максимальной у грецкого ореха (табл. 6). В изученных С02-экстрактах в широких пределах колебался процент сухого остатка. Так, сухой остаток экстракта мяты перечной составлял 50,72 ±0,78%, виноградной косточки - 9,08 ±1,13 %, т.е. его количество было меньше в 5,6 раза.
Значительные различия мы обнаружили и при анализе кислотного числа (рис. 3). У двух видов экстрактов кислотное число находилось в близких пределах: грецкий орех - 6,17±0,47 ед., шелковица - 8,23±0,24 ед. У двух других (виноградная косточка, мята перечная) оно в несколько раз превышало предыдущие значения и составляло соответственно 66,50±0,26 и 36,08±0,05 ед. Эти результаты свидетельствуют о том, что наибольшее количество свободных жирных кислот характерно для экстракта виноградной косточки и мяты перечной. Однако, что касается общего количества жирных кислот (число омыления), то эти различия были менее значительными. Например, в экстракте шелковицы общее число жирных кислот составляло 181,42±2,36 ед., в виноградной кисточке- 197,43±1,31 ед.
Следовательно, изученные С02-экстракты существенно отличаются между собой по количеству свободных и связанных жирных кислот. Полученные нами результаты подтверждены и при исследовании эфирного числа С02-экстрактов. Оказалось, что этот показатель был максимально высоким у экстрактов виноградной косточки - 130,92±1,57 ед. и особенно шелковицы - 173,19±2,59 ед. (рис. 4).
Перекисное число, как известно, характеризует порчу жира. Во всех исследованных нами СОг-экстрактах этот показатель находился в пределах нормы, которая определена ГФ XI. Вместе с тем наибольшее значение перекисного числа было у шелковицы - 0,959 ±0,018 ед., а наименьшее - у мяты перечной-0,18±0,01 ед.
Эти данные, полученные нами впервые, характеризуют своеобразный жирно-кислотный и перекисный состав каждого экстракта. На наш взгляд, это имеет важное практическое значение, ибо очевидно, что столь разнообразные физико-химические свойства СС -экстрактов будут оказывать неодинаковое влияние на организм как в норме, так и при патологии.
