Введение к работе
Актуальность работы
Мясная промышленность – крупнейшая отрасль пищевой индустрии, выпускающая широкий ассортимент продукции пищевого, технического и медицинского назначения. Основными задачами производства мяса и мясных продуктов являются улучшение качественных показателей продукции (пищевая ценность, органолептика); создание новых видов продуктов питания с заданными свойствами; увеличение объемов производства.
Один из путей решения такой проблемы – создание и использование для производства мясных изделий биологически активных веществ на основе продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Установлено, что стартовые культуры, посредством ферментов, изменяют состав и структуру мясных продуктов, образуя новые вещества, способствующие улучшению их качественных показателей.
Исследования применения стартовых культур при переработке пищевого сырья животного происхождения широко рассматриваются во всем мире (Ганина В.И., Костенко Ю.Г., Липатов Н.Н. (мл), Рогов И.А., Семенихина В.Ф., Соловьев В.И., Хорольский В.В., Bover-Cid S., De Vuyst L., Eerola S., Klaenhammer T.R., Leroy F., Niinivaara F., Tanous C., Vandamme E.J. и др.). Ферментированные мясные продукты относительно недавно стали относить к пробиотическим продуктам, усиливающим иммунную систему организма человека. Применение стартовых культур в мясной промышленности является современной тенденцией получения новых видов мясных, в том числе национальных, продуктов с высокой пищевой ценностью, гарантированной безопасностью и специфическими органолептическими показателями.
Вьетнам – аграрная страна с развивающейся промышленностью. Основными сельскохозяйственными продуктами страны являются рис, кукуруза, батат, кофе, чай, маниока, бананы, ананасы, арахис, цитрусовые, сахарный тростник и др. Также разводят крупный и мелкий рогатый скот, свиней и домашнюю птицу, ведется промысел рыбы.
Степень разработанности проблемы В настоящее время, благодаря развитию биотехнологии и применению новых технологических методов, начато производство высококачественных мясных продуктов с повышенной пищевой ценностью. Наравне с новыми видами мясных продуктов большую роль в жизнь людей играют национальные продукты. Сегодня национальные ферментированные продукты востребованы потребителем и занимают отдельный сегмент в пищевой промышленности страны. В действительности процесс ферментации национальных мясных продуктов нестабилен, и вьетнамские производители часто сталкиваются с проблемами контроля качества в связи с ростом нежелательных гетероферментативных микроорганизмов, образующих, помимо молочной кислоты, другие кислоты, что ведет к резкому снижению рН среды, кислому вкусу, неприятному аромату, жесткой консистенции. На наш взгляд, одним из путей решения данной проблемы является использование в рецептуре такого продукта стартовых культур.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационной работы является разработка бактериальной композиции для контроля процесса ферментации и стабилизации качества мясного продукта.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Изучить состав микрофлоры и выделить новые микроорганизмы из колбасы, выработанной во Вьетнаме;
-
Провести исследование фенотипических, молекулярно-генетических и технологических свойств выделенных микроорганизмов и идентифицировать их до вида;
-
Провести ПЦР-генотипирование генов патогенности в геноме энтерококков;
-
Изучить пробиотические свойства, в т.ч. адгезивную способность, выделенных микроорганизмов на эпителиальных клетках человека;
-
Провести паспортизацию промышленно-ценных штаммов с помощью ДНК-фингерпринта (геномной дактилоскопии) методом ПЦР с использованием штаммоспецифических праймеров;
-
Разработать бактериальную композицию стартовых культур для ферментированных мясных продуктов и проект технической документации на бактериальный препарат;
-
Провести оценку влияния бактериальной композиции на качественные показатели национального ферментированного мясного продукта;
-
Сформулировать научно-практические рекомендации для реализации технологического процесса производства ферментированных мясных продуктов в условиях Вьетнама.
Научная новизна работы
С помощью метода T-RFLP, основанного на анализе вариабельности генов 16S ДНК бактерий, произведена оценка состояния микрофлоры мясного продукта «Нем-Чуа». Установлено, что микрофлора продукта включает 18 видов лактобактерий, бифидобактерии Bifidobacterium indicum, Bacillus sp., буркхольдерии Burkholderia tropica.
Из национального вьетнамского мясного продукта «Нем-Чуа» были выделены новые штаммы; проведена их идентификация с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ: Pediococcus pentosaceus КПБ-1, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Enterococcus thailandicus КПБ-2.
Установлено отсутствие трансмиссивной антибиотикоустойчивости у штаммов Pediococcus pentosaceus КПБ-1, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Enterococcus thailandicus КПБ-2 – при устойчивости всех трех штаммов к антибиотику ко-тримоксазолу и умеренной устойчивости штаммов КПБ-1 и КПБ-2 к эритромицину плазмидной ДНК в геноме микроорганизмов не обнаружено.
Исследования на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу) показали отсутствие факторов вирулентности у штамма Enterococcus thailandicus КПБ-2. Поиск генов, отвечающих за признаки патогенности энтерококков: прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки (agg, 1553 п.н.); синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов (gelE, 419 п.н.); синтез сериновой протеиназы (sprE, 233 п.н.); активация цитолизина (cylA, 517 п.н.); внеклеточный поверхностный протеин (esp, 933 п.н.), необходимый для колонизации мочевыводящих путей и образования биопленок (fsrВ 316 п.н.), показал отсутствие этих генов в геноме штамма Enterococcus thailandicus КПБ-2.
Разработан оригинальный способ определения адгезивных свойств микроорганизмов с помощью клеточной линии СаCо-2 (эпителеподобные клетки аденокарценомы ободочной кишки человека), на который оформлена заявка № 2012119278 от 12.05.2012 на выдачу патента РФ, положительное решение, май 2013.
Установлено, что E. thailandicus КПБ-2 имеет высокоадгезивную способность, которая является одним из важнейших свойств пробиотических штаммов.
Практическая значимость работы
Установлено, что по своим технологическим свойствам (активная и предельная кислотность в процессе сквашивания молока, время образования сгустка в молоке, устойчивость к различным концентрациям NaCl, не способность образовывать биогенные амины выше допустимого уровня 350 мг/л, антагонистическая активность по отношению к санитарно-показательной микрофлоре) штаммы Pediococcus pentosaceus КПБ-1, Pediococcus pentosaceus КПБ-3 и Enterococcus thailandicus КПБ-2 могут быть использованы в мясной промышленности в качестве стартовых культур. Штаммы депонированы в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами В-10983, В-10985, В-10984 соответственно.
По совокупности технологических свойств, с учетом отсутствия антагонизма между штаммами, разработана бактериальная композиция, содержащая штаммы Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-3 и микроорганизмы из коллекции ФГБОУ ВПО МГУПП Staphylococcus carnosus 108 (В-8953), Lactobacillus curvatus LCR-2 (В-8906), и проект технической документации ТУ 9229-048-0206840-13 на бактериальный препарат «Немчуа-Н» на ее основе.
Проведена паспортизация промышленно-ценных штаммов Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Enterococcus thailandicus КПБ-2, Staphylococcus carnosus 108 и Lactobacillus curvatus LCR-2 с помощью ДНК-фингерпринта методом ПЦР с использованием штаммоспецифических праймеров.
Установлено, что введение бактериальной композиции в рецептуру ферментированного мясного продукта Вьетнама позволяет контролировать технологический процесс, длящийся 5 сут, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту и обеспечивает его микробиологическую стабильность.
Сформированы научно-практические рекомендации для производства вьетнамского ферментированного мясного продукта со стартовыми культурами.
Основные положения, выносимые на защиту
Анализ структуры микробного сообщества мясного продукта «Нем-Чуа» и идентификация трех новых промышленно-ценных штаммов Pediococcus pentosaceus КПБ-1 (В-10983), Pediococcus pentosaceus КПБ-3 (В-10986) и Enterococcus thailandicus КПБ-2 (В-10984) из национальной вьетнамской колбасы «Нем-Чуа».
Создание бактериальной композиции на основе стартовых культур Enterococcus thailandicus КПБ-2, Pediococcus pentosaceus КПБ-3, Lactobacillus curvatus LCR-2, Staphylococcus carnosus 108 для производства ферментированных мясных продуктов Вьетнама.
Оценка влияния разработанной бактериальной композиции на качественные и микробиологические показатели ферментированного продукта и рекомендации по ее использованию для контроля процесса ферментации мясного продукта Вьетнама.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы проводились совместно с научными сотрудниками лаборатории Современных методов биотехнологической экспертизы пищевых продуктов, лаборатории Пищевой биотехнологии, кафедры «Технология мяса и мясных продуктов» ФГБОУ ВПО МГУПП.
Апробация работы. Основные положения работы и результаты исследований были представлены на следующих конференциях: V Международной научно-технической конференции «Низкотемпературные и пищевые технологии в ХХI веке» (Санкт-Петербург, 2011 г.); IX, X Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2011 г, 2012 г); Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 2012 г, 2013 г); II-ой Международной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Киев, 2012 г); VIІI Международной научно-практической конференции «Наука и технологии: шаг в будущее – 2012» (Прага, 2012 г); IX, X научно-практической конференции с международным участием «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва, 2011 г, 2012 г); Международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, МГУ, 2013).
Публикации научных исследований. По результатам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 14 печатных работ, в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК – 3, в других изданиях – 11.
Объем и структура диссертации. состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, изложена на 115 страницах основного текста, содержит 17 таблиц и 18 рисунков. Список литературы состоит из 104 источников.
Благодарности. Автор выражает благодарность директору Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» ГНЦ РФ, д.б.н., профессору Синеокому С.П., заведующей отделом микробиологии ОАО «ГосНИИсинтезбелок» ГК Ростехнологии, д.б.н. Ботиной С.Г., директору ООО «Биотроф», д.б.н. Лаптеву Г.Ю. и главному специалисту Никонову И.Н., научному сотруднику ФГБОУ ВПО, к.т.н. Колотвиной С.В.
