Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТРЫ 13
1.1 Принципы включения в липосомы веществ различной химической природы и стабилизации липосом. Влияние ли-пидных везикул на гомеостаз макроорганизма 13
1.2 Использование липосом для конструирования вакцин и лечения особо опасных инфекций 22
1.2.1 Липосомы в иммунологических исследованиях 22
1.2.2 Лечение особо опасных зоонозных инфекций липо-сомальными формами антибиотиков 29
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1 Материалы исследования 35
2.2 Методы исследования 37
3 ВЫДЕЛЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО
ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЛИПОСОМ 43
3.1 Разработка биотехнологии экстракции и очистки фосфоли-пидов из головного мозга крупного рогатого скота 43
3.2 Основные физические параметры липосом, полученных различными методами 50
4 БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ АНТИБИОТИКОВ И АНТИГЕНОВ, ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА 54
4.1 Разработка биотехнологии получения липосом с антигена ми чумного микроба 54
4.1.1 Включение в липосомы Ф1 чумного микроба 54
4.1.2 Включение в липосомы ЛПС чумного микроба 56
4.2 Оптимизация включения антибиотиков в липосомы 57
4.2.1 Оценка влияния полученных липосом и липосомальных
форм антибиотиков на факторы неспецифической рези
стентности макроорганизма в эксперименте 58
5 СТАБИЛИЗАЦИЯ ЛИПОСОМ С ВКЛЮЧЕННЫМИ АНТИБИОТИКАМИ И ОЦЕНКА ИХ БЕЗВРЕДНОСТИ ДЛЯ МАКРО ОРГАНИЗМА 79
5.1 Стабилизация липосомальных форм антибиотиков методом лиофильного высушивания 79
5.2 Изучение защитного действия а-токоферола ацетата от перекисного окисления свободных и липосомальных липидов на разных стадиях их приготовления и хранения 86
5.3 Оценка безвредности полученных липосом и липосомаль
ных антибиотиков для макроорганизма в эксперименте 91
ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СКОНСТРУИРОВАННЫХ ЛИПОСОМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АНТИБИОТИКАМИ, РАЗРАБОТКА СХЕМ ЛЕЧЕНИЯ 107
6.1 Лечение экспериментальной сибиреязвенной инфекции ли-посомальными антибиотиками 107
6.2 Лечение экспериментальной туляремийной инфекции ли-посомальными антибиотиками 111
6.3 Лечение экспериментальной чумы липосомальным и свободным стрептомицином 115
6.4 Лечение экспериментального бруцеллеза липосомальными антибиотиками 117
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛИПОСОМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АНТИГЕНАМИ ЧУМНОГО МИКРОБА В РАЗРАБОТКЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК И ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧУМЫ 127
7.1 Биотехнология получения гипериммунных кроличьих антифракционных сывороток 127
7.2 Применение сконструированных липосомальных форм антигенов чумного микроба в специфической профилактике экспериментальной чумы 133
7.2.1 Оценка протективного действия липосомальной фракции 1 чумного микроба в эксперименте 134
7.2.2 Оценка гуморального ответа при иммунизации липосомальными формами антигенов чумного микроба в эксперименте 144
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 151
ВЫВОДЫ 178
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 182
- Принципы включения в липосомы веществ различной химической природы и стабилизации липосом. Влияние ли-пидных везикул на гомеостаз макроорганизма
- Материалы исследования
- Разработка биотехнологии получения липосом с антигена ми чумного микроба
Введение к работе
Возрастающий интерес к разработке биотехнологий получения различных липосомальных форм БАВ обусловлен значительным расширением использования липосом во многих областях медицинской науки и практики. Существуют методы изготовления липосом, позволяющие получать везикулы различного размера, состава, структуры и внутреннего объема. Тем не менее, в зависимости от цели конструирования липосомальных форм биологически активных веществ необходима разработка технологий включения в липосомы конкретных препаратов. Важную роль также играет разработка биотехнологии получения и очистки сырья для производства липосом - фосфолипидов.
В специальной литературе достаточно широко представлены результаты лечения особо опасных зоонозных инфекций липосомальными антибиотиками [43, 66, 98, 99, 129, 141, 153, 156, 160, 192, 193, 294]. Однако не удалось найти сведений о разработке унифицированной биотехнологии включения различных антибиотиков в липидные везикулы с проведением оценки включения материала, сохранения специфической активности и эффективности in vivo на модели экспериментальных инфекций. Кроме того, известно, что антибиотики с высокой антибактериальной активностью часто оказывают иммунодепрессивное действие на организм [138]. Поэтому значительный интерес представляет оценка влияния полученных липосомальных антибиотиков на факторы неспецифической резистентности макроорганизма.
Срок хранения липосомальных препаратов в жидком виде ограничен, так как липосомальные формы БАВ в процессе их приготовления и длительного хранения подвергаются воздействию целого ряда физических и химических факторов, способствующих деградации бислойных фосфо-
липидных мембран и вытеканию инкапсулированного материала. Следовательно, разработка технологий стабилизации липосом с целью сохранения биологических свойств материала и увеличения срока годности приобретает особое значение.
Вступая в различные взаимодействия с клетками макроорганизма, компоненты бислойной мембраны липосом активно включаются в метаболические процессы, вызывая определенные изменения функционального состояния отдельных органов и систем организма [56, 94]. Однако в доступной литературе практически отсутствуют данные о морфологических изменениях в макроорганизме при поступлении липосом и липосомальных антибиотиков. Таким образом, значительный интерес представляет оценка возможных повреждений макроорганизма в ответ на введение сконструированных липосом и липосомальных форм антибиотиков.
Актуальной остается проблема получения иммунных чумных сывороток как сырья для производства МИБП [89]. В литературе представлены лишь единичные работы, где для получения иммунных сывороток предприняты попытки использования липосом в качестве адъювантов и контейнеров для антигенов [55, 196, 197].
Липосомальные вакцины, содержащие различные антигены, активно влияют на клеточные и гуморальные факторы иммунитета [93, 124, 269]. Создание новых типов иммунопрофилактических препаратов на основе включенных в липосомы видоспецифических и протективных антигенов чумного микроба представляет одно из перспективных направлений в области разработки способов эффективной защиты от чумной инфекции [49, 71, 188]. Поэтому разработка биотехнологии получения липосомальных композиций антигенов чумного микроба, эффективных в специфической профилактике чумной инфекции, представляется необходимой и своевременной.
Цель исследования: разработать биотехнологию получения и стабилизации липосомальных форм антигенов чумного микроба, пригодных в качестве сырья для производства МИБП, и антибиотиков, эффективных в лечении экспериментальных особо опасных инфекций.
Основные задачи исследования:
1. Разработать биотехнологическую схему выделения и очистки
фосфолипидов из животного сырья для приготовления липосомальных
препаратов
Разработать биотехнологию приготовления липосом с эффективным включением антигенов чумного микроба во внутренний объем и на наружную поверхность мембраны
Разработать биотехнологию включения в липосомы антибиотиков, отличающихся по структурным, химическим особенностям и свойствам. Оценить влияние полученных липосомальных антибиотиков на неспецифическую резистентность макроорганизма в эксперименте
Разработать биотехнологические приемы стабилизации липосомальных композиций и оценить безвредность полученных липосомальных форм БАВ для лабораторных животных
Оценить биологическую эффективность полученных липосомальных форм антибиотиков при лечении особо опасных зоонозных инфекций в эксперименте и разработать схемы адекватной терапии.
Отработать с использованием липосомальной формы фракции 1 чумного микроба биотехнологию получения гипериммунных сывороток, оценить протективную и гуморальную активность полученных липосомальных антигенных композиций в эксперименте
Научная новизна работы. Разработаны новые способы получения комплекса фосфолипидов и ганглиозидов из головного мозга крупного ро-
гатого скота и методы их очистки, подтверженные патентами РФ № 2000109191/14 и №2000109192/14.
Впервые изучено влияние липосомальных форм антибиотиков на показатели неспецифической резистентности макроорганизма, определены механизмы иммуностимулирующего действия липосом с антибиотиками на уровне интралейкоцитарных микробицидных и энергетических систем ПМЯЛ крови. Разработана биотехнология стабилизации липосомальных форм антибиотиков, сохраняющих специфическую активность инкапсулированных антибиотиков в течение 2 лет хранения, включающая использование антиоксиданта и лиофильного высушивания, позволяющая уменьшить экономические и временные затраты. Впервые по патоморфо-логическим критериям доказана относительная безвредность длительного введения липосомальных антибиотиков для экспериментальных животных.
Результаты проведенных исследований являются научно-экспериментальным обоснованием усовершенствования существующих в практическом здравоохранении средств антибактериальной терапии чумы, туляремии, сибирской язвы и бруцеллеза. Приоритетность подтверждена положительным решением о выдаче патентов РФ по заявкам №2002133738/14 от 19.03.04 «Способ лечения бруцеллеза» и №2002133737/14 от 21.05.04 «Способ лечения бруцеллеза».
При использовании Ф1 чумного микроба, инкапсулированной в ли-посомы из ДМФЭ и СА, разработана биотехнология получения гипериммунных сывороток, соответствующих требованиям экспериментально-производственного регламента [1987], предъявляемым к оценке сырья для производства МИБП. Результаты иммунопрофилактики экспериментальной чумы сконструированными липосомальными формами антигенов чумного микроба являются научно-экспериментальным обоснованием для
создания липосомальных химических вакцин для парентерального и перо-рального использования.
Практическая и теоретическая значимость работы. Результаты исследования имеют как теоретическое, так и практическое значение, поскольку впервые в рамках одной работы представлены новые аспекты биотехнологии получения, оценки эффективности и использования липосомальных форм БАВ. Разработана технологическая схема экстракции фос-фолипидов из головного мозга крупного рогатого скота, позволяющая исключить из технологического процесса токсичные вещества, повысить выход продукта и обеспечивающая достижение сбалансированного экви-молярного соотношения фосфолипидов с липидами мембран клеток макроорганизма. По предложенной биотехнологии экстракции липидов составлены Технические условия ТУ- 9154-001-01897080 - 2004 «Фосфо-липиды для получения липосом», утвержденные заместителем главного государственного санитарного врача РФ Беляевым Е.Н. (письмо № 12 ФЦ/2514 А от 19 августа 2004 г.). На разработанную биотехнологию получения липосомальных форм антибиотиков и антигенов чумного микроба составлен регламент производства «Липосомальная основа для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов», утвержденный директором института проф. Ефременко В.И. (протокол Ученого совета № 4 от 20 апреля 2004 г.).
Теоретические положения и практически значимые результаты диссертационной работы включены в цикл лекций по лечению, профилактике, диагностике особо опасных инфекций на курсах подготовки специалистов: «Курсы усовершенствования биологов службы ГСЭН по особо опасным и природноочаговым зоонозам»; «Курсы первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям»; «Подготовка личного состава учреждений сети наблюдения и лабораторного контроля по про-
тивоэпидемическому обеспечению населения в условиях возникновения чрезвычайных ситуаций».
Результаты выполненных исследований легли в основу 10 методических рекомендаций, 2 из которых утверждены Первым заместителем министра здравоохранения РФ, главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко.
Основные положения, выносимые на защиту
Замена метанола на этанол для экстракции фосфолипидов с последующим их осаждением охлажденным ацетоном позволяет получать липидныи комплекс, пригодный для приготовления липосом различными методами
Методы «обращения фаз» и «замораживания-оттаивания» в использованной модификации позволяют получать липосомы с максимальным включением Ф1 чумного микроба и обеспечивают адсорбцию значительного количества антигена на наружной поверхности мембран.
Включение антибиотиков методом «замораживания-оттаивания» без ультразвуковой обработки в «пустые» липосомы, полученные методом «обращения фаз», обеспечивает высокий процент иммобилизации антибиотиков с сохранением их биологической активности.
Разработанная биотехнология лиофилизации с использованием а-токоферола ацетата в концентрации 0,5 мг на 1 г липидов и защитной сахарозо-желатиновой среды позволяет получить липосомальные формы антибиотиков, сохраняющие специфическую активность в течение 2 лет.
Разработанные схемы этиотроппого лечения экспериментальной сибирской язвы, туляремии, чумы, бруцеллеза липосомальными антибиотиками для парентерального и перорального путей введения, позволяют уменьшить кратность лечения, снизить курсовые дозы препаратов и
повысить эффективность терапии по сравнению с использованием их свободных форм.
6. Разработанная биотехнология получения гипериммунных сывороток к Ф1 чумного микроба, инкапсулированной в липосомы из ДМФЭ и СА, обеспечивает получение антифракционных кроличьих сывороток, удовлетворяющих требованиям оценки сырья, предъявляемым экспериментально-производственным регламентом [1987].
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговых научных конференциях Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (г. Ставрополь, 1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001 гг.), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию санэпидслужбы России «Здоровье населения и среда обитания» (г. Ставрополь, 1997), на научной конференции Ставропольской государственной медицинской академии (г. Ставрополь, 1997 г.), на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998), на научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (г. Киров, 2001г.), на научно-практической конференции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (г. Астрахань, 2001 г.), на научно-практической конференции «Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане» (г. Алма-Ата, 2001 г.), на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ «Актуальные аспекты природно-очаговых болезней» (г. Омск, 2001 г.), на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2002 г.), на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (г. Ставрополь, 15-16
октября 2002 г.), на Всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологической безопасности Российской Федерации», посвященной 75-летию образования НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003).
Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 10 НИР, отражено в 45 опубликованных научных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей, депонированных - 9 статей, в иностранных журналах - 5 публикаций). Получено 2 патента на изобретения и 2 положительных решения о выдаче патента на изобретение.
Объем и структура работы. Работа изложена на 212 страницах
компьютерного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 22 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 216 отечественных и 125 зарубежных источников.
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Принципы включения в липосомы веществ различной химической природы и стабилизации липосом. Влияние липидных везикул на гомеостаз макроорганизма
В настоящее время предложены сотни разнообразных методов приготовления липосом, позволяющих получать везикулы различного размера, состава, структуры и внутреннего объема, а также способы иммобилизации в них веществ различной химической природы. Выбор того или иного метода получения липосом определяется целью работы, природой включаемого вещества и его расположением в липосомах (во внутреннем водном объеме или в бислойной мембране).
Существуют довольно простые приемы изготовления липосом при гидратации пленки фосфолипидов, в результате чего получаются "гигантские" моноламеллярные везикулы, диаметр которых составляет от 1 до 50 мкм [268]. Аналогичный процесс образования липосом из альвеолярного сурфактанта, частиц угольной, кремниевой пыли и сульфамеразина воспроизводится на границе раздела фаз "жидкость-воздух" [239]. Метод получения моноламелляр-ных липосом со средним диаметром 230 нм при смешивании различных дисперсий фосфолипидов описан Pnisieux F., Beau D. [311].
Включение в липосомы различных ингредиентов (противоопухолевых лекарственных веществ, антибиотиков, белков, нуклеиновых кислот) удается осуществить в процессе их дегидратации - регидратации. Диспергирование лиофильно высушенных липосом в водной фазе, содержащей включаемый ингредиент, сопровождается его иммобилизацией во внутренний объем бислой-ных везикул. Таким путем удается включить в липосомы до 70 % иммобили-зируемых веществ в зависимости от их природы и физико-химических свойств [260,271].
Большие многослойные везикулы в зависимости от целей исследования готовят из фосфатидилхолина и его производных или смеси липидов, в состав которой могут входить фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфати-
дилсерин, фосфатидилинозитол, кардиолипин, холестерин, фосфатидная кислота, диацетилфосфат, стеариламин.В состав липосомальной мембраны могут быть включены и другие липиды, наличие и количество которых определяется специальными целями исследования [56]. Медленное перемешивание в течение длительного времени или введение в состав липидной смеси 10-20 % отрицательно заряженного липида, в отличие от кратковременного энергичного встряхивания, ведет к образованию везикул с увеличенным внутренним объемом [90, 271, 289].
Под воздействием ультразвуковых волн мультиламеллярные липосомы, полученные методом встряхивания, или набухшая в водной фазе фосфолипид-ная пленка нарушают свою первоначальную структуру с образованием моно-ламеллярных везикул. В ряде случаев ультразвуковую обработку осуществляют в присутствии органического гидрофобного растворителя, который затем удаляют [211]. При этом размеры липосом уменьшаются и становятся более однородными пропорционально мощности и времени озвучивания [232].
Ультразвуковой метод получения липосом используют для иммобилизации в них самых различных веществ, т.к. он легко воспроизводим и отличается простотой осуществления [37, 182, 271]. Иногда кратковременное озвучивание применяют для включения веществ в уже готовые липосомы [56]. При тщательно контролируемых условиях озвучивания негативное воздействие ультразвука на иммобилизируемые в липосомы вещества удается максимально нивелировать [46, 231].
Растворенные в некоторых органических растворителях фосфолипиды при впрыскивании различными способами в водную фазу способны образовывать моноламеллярные липосомы различных размеров. В качестве органических растворителей для этих целей используют как смешивающиеся, так и практически несмешивающиеся с водой вещества, имеющие невысокую температуру кипения, что позволяет их легко удалять из реакционной смеси под вакуумом или при незначительном нагревании [56, 325, 340]. Основным недостатком данных методов приготовления липосом является то, что в получаемых препаратах удерживаются остатки органического растворителя, от ко-
торого не удается полностью избавиться даже при использовании растворителей с низкой температурой кипения.
Стабильные, свободные от посторонних веществ моноламеллярные липосомы с высокой концентрацией липидов удается получать путем экструзии, пропуская водную дисперсию мультиламеллярных липосом под давлением через узкие отверстия (пресс Френча). Уже после первого пропускания 70 % липидов приходится на моноламеллярные липосомы, при вторичной экструзии их выход превышает 95% [56].
Близким к экструзионным методам получения бислойных везикул относится способ приготовления липосом с большим внутренним объемом при использовании мембранных ультрафильтров "Синпор" фирмы "Хемапол" (Прага). По мере пропускания жидкости через фильтр с нанесенными фосфолипи-дами идет формирование липосом с увеличением концентрации липидов в препарате до 70 мкг/мл после 100 повторяющихся процедур [199].
По механизму формирования липосом близким методу инжекции фос-фолипидов в водную фазу является метод "выпаривания в обращенной фазе". Полученные данным методом липосомы характеризуются большими размерами (до 1,2 мкм) и высокой эффективностью иммобилизации в них материала, процент включения которого в бислойную мембрану и внутренний объем липосом зависит от гидрофильности, гидрофобности и прочих его свойств [52, 69, 119]. Так, этим методом в липосомы удается иммобилизовать от 67 до 78 % гидрофильных антибиотиков (канамицина, карбенициллина, гентамицина, стрептомицина, тетрациклина, эритромицина) и сульфаниламидов и только в пределах 11 % липофильного левомицетина [157, 161].
В процессе многократно повторяющихся циклов замораживания фо-софлипидных дисперсий с последующим оттаиванием формируются липосомы с высоким процентом включения иммобилизируемых веществ. При этом происходит слияние липосом и увеличение их размеров [81, 83, 84, 308]. Такие методические приемы используют при включении в липосомы чувствительных к воздействию ультразвука веществ, например, ДНК. В этом случае вещества вносят в предварительно озвученную липидную суспензию, после
чего ее подвергают нескольким циклам "замораживания-оттаивания" [92]. В ряде случаев липосомы получают, комбинируя метод "замораживания-оттаивания" с другими способами, позволяющими формировать фосфолипид-ные бислойные везикулы [179].
Способность смеси фосфолипидов, белка и детергентов, при удалении последних диализом, формировать бислойные везикулы послужила разработке метода получения липосом в присутствии детергентов с их последующим удалением. В таких условиях образование липосом происходит постепенно по мере удаления детергента. При этом гидрофильный включаемый материал попадает во внутреннюю полость везикул, а материал, имеющий гидрофобные участки, встраивается в липосомальную мембрану [56, 111]. Применительно к различным по природе и свойствам веществам, иммобилизируемым в липосомы, разработаны варианты данного метода, позволяющие получать бислойные везикулы в широком диапазоне размеров и степени включения этих веществ [22, 320]. Данный метод позволяет получать липосомы с высокой степенью включения необходимого материала, однако, они удерживают и некоторое количество детергента, который может оказывать неблагоприятное воздействие на включаемые вещества [232].
Полученные различными методами липосомы при определенных условиях могут сливаться, формируя более крупные везикулы с объединением их внутреннего содержимого [231, 283]. Липосомы, имеющие в своем составе отрицательно заряженные фосфолипиды (фосфатидную кислоту, фосфатидил-серин, фосфатидилглицерин), в присутствии ионов кальция способны сливаться с образованием цилиндрических складчатых мультиламеллярных структур, которые при последующей обработке этилендиаминтетрауксусной кислотой переходят в большие моноламеллярные везикулы, включающие до 10-15 % растворенных веществ [69, 252].
Способность ряда фосфолипидов и других амфифильных соединений при определенных условиях полимеризоваться предопределила разработку способов получения полимеризованных липосом, отличающихся повышенной стабильностью их мембран [313]. Полимеризованные липосомы имеют жест-
кую, но вместе с тем хрупкую структуру, легко разрушающуюся при внешних воздействиях. По сравнению с неполимеризованными липосомами они мало чувствительны к действию детергентов и изменениям осмотического давления, менее проницаемы для воды и других соединений, при введении в макроорганизм плохо биодеградируются [249]. Такие липосомы находят применение в качестве различных биосенсоров, материалов для преобразования энергии, контейнеров лекарств, компонентов искусственной крови, искусственных клеток и т.д. [65].
Степень включения различных веществ во внутренний объем липосом зависит от природы и свойств включаемого вещества, состава компонентов липидной бислойной мембраны и способа приготовления липосом. Количество включаемого вещества увеличивается с возрастанием водного пространства, заключенного в липосому. В связи с этим в мультиламеллярные липосомы можно включить больше растворенного в воде вещества, чем в малые монола-меллярные везикулы. Растворимость иммобилизируемых в липосомы веществ в водной и органической фазах также влияет на степень их включения [56]. На процесс взаимодействия различных веществ с липосомами оказывают существенное влияние состав липосомальной мембраны, условия и способ приготовления липосом, а также температура и наличие в окружающей среде различных химических соединений [120, 132, 199].
Эффективным способом иммобилизации на поверхности липосом различных биополимеров является ковалентное связывание. Этим методом вещества присоединяются к липидам с помощью различных агентов, имеющих не менее двух реакционноспособных групп. Для придания липосомам биоспецифических свойств на их поверхность ковалентно фиксируют биополимеры, чаще всего белки, используя для этого различные методические приемы и способы [23, 286]. В качестве реагентов, способных ковалентно связываться с компонентами мембраны липосом и с иммобилизируемым биополимером, используют глютаровый альдегид, диметилсуберимидат [155]; триоксиметил-фосфин [64]; N-гидроксисукцинимидил-дитиопропионат, образующий ковалентную триэфирную связь [233] и другие.
Способность гликопротеида авидина формировать очень прочную связь с биотином, являющимся биологически активным веществом из группы витаминов, предопределила разработку методов фиксации на поверхности липосом различных веществ при формировании комплекса "авидин-биотин". С этой целью биотилированные липиды встраивают в мембрану липосом, а авидин конъюгируют с веществом (чаще всего с белком), которое предполагают иммобилизовать на поверхности липосом [92]. В некоторых случаях биотилиру-ют как липосомы, так и белки, а авидин используют для фиксации на бислой-ных везикулах модифицированных биотином белков, сохраняющих при этом свои функции [92, 286, 310, 314].
Для решения ряда прикладных задач разработаны способы иммобилизации в липосомы катализаторов (коллоидные платина и золото), полупроводников и магнитных частиц. Считают, что эти липосомы могут найти применение при осуществлении фотолиза, фотовосстановления воды и в ряде других процессах [249]. Включение в липосомы магнитных материалов делает их магнитоуправляемыми [7, 171].
Высокая биологическая эффективность действия инкапсулированных веществ определяется стабильностью липосом при введении в организм. Наиболее приемлемой во многих отношениях формой готовых препаратов является лиофилизированный биоматериал [144]. Проницаемость липосомальных мембран для воды обеспечивает возможность лиофильного высушивания липосом с последующей регидратацией, позволяющей не только получать исходную форму липосом, но и включать при этом в их внутренний объем водную фазу с растворенными в ней различными веществами [260]. Лиофильно высушенные липосомы длительно сохраняют свои исходные свойства и мало подвержены воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, приводящих к нарушению структурной целостности липидных мембран [82].
Лиофилизация липосом предусматривает предварительное их низкотемпературное замораживание, которое проводят в присутствии различных криопротекторов, стабилизирующих внешний и внутренний слои липосомаль-ной мембраны. С этой целью в качестве стабилизаторов используют трегалозу
[318], сахарозу, глюкозу или маннит [132, 150]. Последующий режим лиофи-лизации липосом, как правило, мало чем отличается от технологии высушивания различных биологических препаратов [46].
Таким образом, используя описанные методические приемы, удается получать стабильные мульти- и моноламеллярные липосомы, имеющие широкий спектр липидного состава мембран, содержащих во внутреннем объеме или на поверхности различные по природе и свойствам вещества. Однако в каждом случае, в зависимости от целей, необходима разработка технологии получения и стабилизации конкретных препаратов.
Конструирование различных липосомальных форм БАВ предопределяет необходимость исследования механизмов их взаимодействия с различными клетками и тканями макроорганизма [19, 21, 56, 177, 246].
Механизм взаимодействия различных клеток организма с липосомами зависит от их химического состава [56, 304], от наличия различных веществ внутри липосом или на поверхности их мембран [92, 113, 198, 314], от присутствия в реакционной среде ионов кальция [248], сыворотки крови [233, 234] и ряда других факторов. Так, «жидкие» липосомы, независимо от величины их заряда, хорошо связываются с клеточными мембранами в отличие от «твердых», положительно заряженных липосом, которые фиксируются клетками гораздо эффективнее нейтральных и отрицательно заряженных липидных везикул [297]. Из-за возможного липидного обмена между клетками и липосомами последние могут изменить исходный липидный состав, а следовательно свое фазовое состояние и механизм взаимодействия с клеткой [137, 178].
Вступая в различные взаимоотношения с клетками макроорганизма, подвергаясь биодеградации, компоненты бислойной мембраны липосом активно включаются в метаболические процессы, вызывая определенные изменения биохимических показателей и функционального состояния отдельных органов и систем организма в ответ на введение липидных везикул [1, 3, 80, 205]. Так, при внутривенном введении 2 мг липосом, состоящих из сфинго-миелина и фосфатидилхолина (молярное соотношение 4:1), уже после двух инъекций обнаруживается гранулематозная реакция в печеночной паренхиме,
исчезающая вскоре после прекращения введения [220]. Липосомы, изготовленные на основе гидрогенизированного соевого лецитина, вызывают при введении животным лейкоцитоз и тромбопению. В меньшей степени такой эффект оказывают везикулы, приготовленные на основе синтетического дистеа-рилфосфатидилхолина [315].
Опубликованы интересные данные о способности липосом снижать явления отека и альтерации мягких тканей при воспалительных процессах и подавлять рост условно-патогенной микрофлоры, что позволяет рассматривать липосомы как перспективное самостоятельное противовоспалительное средство [56, 31]. Следует также учитывать, что поверхность липосом может связывать из сыворотки как токсичные метаболиты и токсины, так и вещества, реализующие защитные реакции при ряде патологических процессов [172, 182].
Процесс слияния липосом с митохондриальной мембраной сопровождается возрастанием активности таких ферментов, как НАДН-дегидрогеназа, ци-тохром-С-оксидаза и АТФ-аза. В то же время, скорость переносов электронов от НАД-Н и сукцината на цитохром С уменьшается с ростом поверхности мембраны [224, 232, 279].
Скорость окисления экзогенного арахинодата гомогенными препаратами липоксиназы из цитозоля ретикулоцитов кролика существенно возрастает в присутствии различных биомембран, в том числе липосом, состоящих из различных фосфолипидов [106]. Установлено влияние липосом разного липидно-го состава (фосфатидилхолиновых и кардиолипиновых) на активность цито-плазматических, митохондриальных и мембрано-связанных ферментов животных in vivo и in vitro. Фосфатидилхолиновыс липосомы снижают активность трансаминазы аспартата и глутаматдегидрогеназы, не изменяя активности трансаминаз аланина [13].
Изучение длительного подкожное введение "пустых" липосом, состоящих из фосфатидилхолина и холестерина в молярном соотношении 7:5, выявило повреждение печеночных клеток, что выражается в изменении различных биохимических показателей сыворотки крови и гомогената печени экспериментальных животных. Однако одно- и двукратное введение препарата не
вызывает токсического поражения внутренних органов [24, 209]. Десятикратное внутривенное введение мышам на протяжении 3 недель липосом, содержащих сфингомиелин, вызывает блокаду ретикулоэндотелиальной системы, наименьшим эффектом при этом обладают бислойные везикулы, состоящие из яичного фосфатидилхолина и холестерина [219].
Мисетовой Е.Н. [128, 129] показано, что введение интактных липосом из фосфолипидов мозга крупного рогатого скота и коммерческого холестерина различными путями в организм экспериментальных животных вызывает у них функциональные изменения ряда биохимических, цитохимических и морфологических показателей, восстанавливающихся к норме в течение 10 сут после отмены препарата. В ответ на введение интактных липосом белым мышам в сыворотке крови на фоне гипогликемии увеличивалось содержание общего белка, достигая максимального значения на 9-11 сутки эксперимента, а при внутрибрюшинном и внутримышечном введении препаратов и мочевины. Во всех случаях, кроме перорального способа введения препаратов, отмечались гипертриглицеринемия и повышение в крови уровня липопротеинов очень низкой плотности. Приведенные данные свидетельствуют о том, что введение липосом в организм сопровождается активным включением компонентов их мембран в различные обменные процессы, которые следует дополнительно изучать и учитывать при использовании липосомальных препаратов.
В заключение необходимо отметить, что, несмотря на большое количество литературных данных о методах получения липидных везикул, при конструировании липосомальных форм БАВ с заданными физико-химическими и биологическими свойствами необходима разработка конкретных технологий их изготовления и стабилизации. В доступной литературе практически не представлены вопросы изучения патогистологических изменений макроорганизма в ответ на введение липосом, влияния липосом с лекарственными препаратами на полиморфноядерные лейкоциты, которые имеют большое значение в борьбе с инфекционными агентами. Решению этих актуальных проблем мы решили посвятить соответствующие разделы настоящей работы.
1.2. Использование липосом для конструирования вакцин и лечения особо опасных инфекций
1.2.1 Липосомы в иммунологических исследованиях
Установлено, что включение разнообразных белков, пептидов и нуклеиновых кислот в липосомы значительно повышает иммуногенность этих макромолекул [17, 260, 291,330].
Иммунный ответ организма в значительной степени зависит от состава липидов липосом, определяющих заряд, жесткость и другие физико-химические показатели бислойной мембраны, от размера везикул и способа иммобилизации иммуногенов, их природы, расположения и количества в ли-посомах, путей и кратности введения препаратов в организм [29, 68, 277, 322].
Иммунный ответ наиболее выражен при внутрибрюшинной и подкожной иммунизации, в меньшей степени при внутривенном введении препарата. Промежуточный иммунный ответ вызывает внутримышечное введение иммобилизованного в липосомы антигена [30, 68, 282].
Способность бислойных липидных везикул при определенных условиях преодолевать желудочно-кишечный барьер, сохраняя нативность иммобилизованных в них веществ, создает возможность пероральной иммунизации липо-сомальными антигенами и вакцинами, которые при таком способе введения в свободной форме инактивируются [292, 324]. Получен липосомальный интер-лейкин-1 и инактивированная гриппозная вакцина, которые были эффективны при пероральном введении белым мышам [97, 184, 226]. По данным Wachsmann D. et al. [337] пероральная иммунизация липосомами, содержащими антигены Streptococcus mutans, формирует местный и системный иммунный ответ.
Усиление иммунного ответа липосомальной гриппозной тривакцины удалось получить после ее интраназального введения волонтерам одновременно с мукозальным адъювантом - термолабильным токсином Escherichia coli.
Двукратное интраназальное введение этой вакцины индуцировало гуморальный иммунный ответ, сравнимый с ее однократным парентеральным введением. При этом в слюне был обнаружен более высокий титр вирус-специфического иммуноглобулина А [259].
Заряд мембраны липосом также оказывает влияние на иммуногенные свойства антигенов. Отрицательно заряженные липосомы стимулируют более высокие показатели титров антител, особенно при однократной иммунизации [68]. По данным Закревского В.И., Плехановой Н.Г. [71] введение в состав липосом положительно заряженного амфифила - стеариламина способствует увеличению иммуногенности липосом, содержащих антигены чумного микроба.
Для проявления иммунологической активности включенного в липосомы антигена требуется гораздо меньшее его количество по сравнению с интактным препаратом [302]. При этом наибольшей иммуногенностью обладают липосомы, содержащие антиген в оптимальном количестве на наружной поверхности [36, 68, 256, 316]. По данным же Davis D. et al., [240, 241] локализация столбнячного анатоксина во внутренней полости или на поверхности липосом не влияет на иммуногенность препарата, а этот процесс зависит от соотношения массы липосомальных фосфолипидов и антигена. Одновременное введение животным липосомальных препаратов столбнячного анатоксина и бычьего сывороточного альбумина в одной или разных липосомах, по сравнению с инъекцией одного липосомального антигена, значительно повышает иммуногенность каждого препарата [260].
Иммуногенные свойства липосомальной формы анатоксина синегнойной палочки при парентеральном введении превышают аналогичное действие ин-тактного препарата, что характеризуется уровнем накопления антитоксических иммуноглобулинов IgG. Адъювантным действием обладают также пустые липосомы, вводимые в сочетании с анатоксином. При нанесении липосом, содержащих анатоксин синегнойной палочки, на ожоговую поверхность кожи экспериментальных животных иммуногенные свойства препарата также оказываются в 6-18 раз выше по сравнению с нативным анатоксином [125, 126,
127].
Адъювантное действие антигенсодержащих липосом усиливает липид А или его производные, включаемые в мембрану везикул. При этом формируется длительный иммунный ответ с образованием клеток памяти [253, 339]. Имму-ногенность холерного энтеротоксина (холерогена) возрастает в 17 раз, если антиген вводят животным в составе липосом. При включении в мембрану ли-пидных везикул дополнительно липида А иммунологическая активность токсина увеличивается в 629 раз, что эквивалентно или выше эффекта, получаемого при использовании полного адъюванта Фрейнда [222]. Адъювантное действие липосом, содержащих иммуноген, возрастает также с присоединением к поверхности везикул лигандов, имеющих рецепторы на поверхности макрофагов, играющих важную роль в иммунной системе организма [29]. В качестве такого рецептора может быть использован альбумин, связанный с манно-зой [255], хемотаксический пептид [87].
С помощью липосом удается ввести антигены в Т-лимфоциты [261, 276], при этом антигены, связанные с липосомами, активируют Т-клетки при наличии в липидной везикуле молекул главного комплекса гистосовместимо-сти (комплекс Н-2). Степень активации этих клеток зависит от липидного состава и концентрации липосом, а также от природы включенного в них антигена [338]. На процесс взаимодействия иммунокомпетентных клеток с липосомами существенную роль оказывает природа белка, фиксированного на их поверхности. Так, покрытие липосом альбумином или инактивированным а-химотрипсином не влияет на их захват макрофагами, в отличие от везикул, содержащих у -глобулин [251, 333] или моноклональные антитела [233].
Бислойные липидные везикулы способны также взаимодействовать с хелперными Т-клетками и даже выполнять их функции [221]. По данным Молочной СВ., Прищепа И.В. [131] введение больным интратрахеально липосо-малы-юй формы гидрокортизона сопровождается значительным увеличением фракции клеток Т-супрессоров.
Повышенная чувствительность к антигенным субстанциям - гиперчувствительность замедленного типа проявляется более выраженно, если
антигены вводят внутрикожно в липосомальной форме. Так, низкомолекулярные белки туберкулина, инкапсулированные в бислойные везикулы, состоящие из фосфатидилхолина и фосфатидилсерина в молярном соотношении 7:3, при внутрикожном введении обладают более высокой активностью по сравнению с препаратом в свободной форме [309]. По данным же Федосеевой В.Н. с соавт. [202] включение аллергенов пыльцы тимофеевки и овальбумина в липо-сомы позволяет снизить их аллергенные свойства и повысить иммуногенность. Спектр иммуноадъювантных свойств липосом можно расширить путем дополнительного включения в них различных иммуномодуляторов [20, 269, 285, 301]. Иммуномодуляторы, включенные в липосомы, не только активируют макрофаги, но свое биологическое действие реализуют более длительное время и в значительно меньших дозах, чем в интактной форме [93, 221, 306, 307]. Синтетический аналог мурамилдипептида в липосомальной форме при внутривенном введении за 2-4 суток до заражения мышей Candida albicans полностью защищает животных от инфекции в дозе в 16 раз меньшей, чем интактный иммуностимулятор [68].
По мнению Карсоновой М.И. с соавт. [86] перспективным направлением в создании иммунотропных лекарственных средств мурамилдипептидной природы является разработка их липофильных производных, когда к мурамилди-пептиду присоединяются жирные кислоты или фосфолипиды. Свойства липосом, содержащих иммуномодуляторы, зависят от состава фосфолипидов, определяющих заряд мембраны, поскольку отрицательно заряженные везикулы эффективнее фагоцитируются макрофагами [300, 317]. На биологическое действие иммуномодуляторов влияет также способ их иммобилизации в липосомы. На примере интерлейкина-1 показано, что связанный с внешней поверхностью липидных везикул препарат стимулирует соответствующие клетки-мишени, в отличие от интерлейкина-1, инкапсулированного во внутренний объем липосом [230]. Интактные липосомы способны усиливать зависимую от интерлейкина-2 пролиферацию цитотоксических лимфоцитов. При этом, взаимодействие in vitro липосом с иммуномодулятором происходит только в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки [290].
Бислойные липидные везикулы, содержащие антигены, также влияют на продукцию различных иммуномодуляторов иммунокомпетентными клетками макроорганизма. Бислойные липидные везикулы с инкапсулированным гемоглобином при введении животным вызывают увеличение через 6-8 часов содержания в сыворотке крови интерлейкина-6 [319]. Гликолипид из непатогенной бактерии Gordona aurantiaca, включенный в липосомы, придает им способность активировать макрофаги, убивающие раковые клетки у мышей [254]. Под действием липосомального анатоксина синегнойной палочки в плазме крови иммунизированных мышей увеличивается синтез лейкотриена, синтезирующегося в иммунокомпонентных клетках и участвующего в воспалительных и аллергических реакциях немедленного типа [127].
Выраженной активностью обладают липосомы, содержащие антиген во внутренней полости везикул, а на поверхности холерный энтеротоксин или его рецепторную В-субъединицу, за счет которых происходит их прочная фиксация на ганглиозиде, входящем в структуру мембран клеток слизистой [250, 262].
Бислойные липидные везикулы, содержащие ДНК-репарирующий фермент, при накожном применении предотвращают, в некоторой степени, изменения морфологии иммунокомпетентных клеток кожи, облучаемых ультрафиолетовым светом [341].
Иммобилизованные в липосомы липополисахариды менингококков се-рогруппы В обладают выраженным адъювантным действием по сравнению с нативным препаратом при разных способах введения животным, но самые высокие уровни иммунного ответа наблюдаются при внутрибрюшинном и внутривенном способе введения иммуногенов, при этом ответ регистрируется более напряженным и продолжительным. Данный липосомальный препарат стимулирует образование антителообразующих клеток в-селезенке, индуцирует накопление иммуноглобулинов IgM и IgG и не вызывает эффекта иммунологической памяти [67].
С целью получения новых вакцинных препаратов против чумы проводятся исследования по оптимизации методов включения в липосомы антиге-
нов чумного микроба различной природы [30, 70, 188]. При этом наблюдается снижение общей токсичности липополисахарида Yersinia pestis [54]. Увеличению иммуногенности антигеносодержащих липосом способствует обеспечение им положительного заряда и повышение жесткости мембран везикул за счет введения соответствующих липидных компонентов [71].
Гусевой Н.П. с соавт. [49] получены липосомальные формы липополисахарида, капсульного и основного соматического антигенов чумного микроба. Липосомирование липополисахарида позволило снизить его цито-токсическое действие в отношении лимфоцитов крови в 5-8 раз. Высокой про-тективной активностью против чумы обладают липосомы, содержащие фракцию I и иммуностимулятор сальмозан, а также липид А, выделенный из липополисахарида чумного микроба [49, 188]. Бямбаагийн А. [30] в эксперименте на белых мышах показано, что липосомы, содержащие фракцию 1 чумного микроба, основной соматический антиген и липополисахарид чумного микроба, обеспечивают более высокий уровень протективного ответа по сравнению с препаратами свободных антигенов.
Вместе с тем, пустые липосомы, состоящие из фосфатидилхолина и холестерина в соотношении 4:1, вводимые в смеси с чумной живой вакциной, существенно повышают ее протективность, не влияя на уровень титров специфических антител [26]. Перспективным в качестве химической вакцины считается белково-полисахаридный комплекс бруцелл, иммобилизованный различными способами в липосомы, введение которых животным вызывает более длительный иммунитет, по сравнению с интактным препаратом. При этом отрицательно заряженные липосомы с антигенным комплексом в большей степени стимулируют гуморальный ответ, чем везикулы, имеющие нейтральный заряд [101,210].
Адъювантное действие бислойных липидных везикул, содержащих поверхностный гликопротеин вируса бешенства, обнаруживается при введении такого препарата белым мышам, титры специфических иммуноглобулинов у которых оказываются при этом гораздо выше, чем при введении интактного антигена [45].
В различных странах ведутся исследования по созданию липосомальных вакцин против гриппа [217, 140]. Наибольший интерес у исследователей для реконструкции очищенных вирусных антигенов в липосомы привлекли поверхностные гликопротеины вируса гриппа — гемагглютинин и нейраминида-за, которые являются его основными протективными антигенами, но в очищенном виде обладают низкой иммуногенностью [258, 335]. Поверхностные белки вируса гриппа относительно легко встраиваются в липидные везикулы благодаря амфифильности их белковой молекулы. Образованные структуры при электронном микроскопировании имеют сходство с оригинальным вирусом. Такие вирионоподобные структуры были названы виросомами. Виросомы были использованы в дальнейшем в качестве уникальной модельной системы для изучения вирусных мембран, белков и липидов, а также для разработки липосомальных вакцин [266, 267, 273, 303, 305].
В 1993 г. в Швейцарии была разработана трехвалентная гриппозная ли-посомальная вакцина, которая испытана в Италии на людях, проживающих в домах для престарелых [257, 258, 259]. При этом не отмечено побочных местных и общих реакций, а также не обнаружено антител к липидным компонентам виросомной вакцины [238, 259].
Виросомы, содержащие гриппозные антигены [гемагглютинин и нейра-минидазу], можно использовать в качестве носителя других вирусных и бактериальных антигенов, а также пептидов и нуклеиновых кислот [258, 312]. В такой конструкции гемагглютинин играет ключевую роль как компонент, облегчающий транспортировку антигена и инициирующий слияние виросом с им-мунокомпетентными клетками. Кроме того, гемагглютинин служит антигеном «узнавания», так как многие люди "праймированы" к гемагглютинину благодаря вакцинации или через заболевание.
Эффективность гриппозных виросом в качестве носителя антигена вируса гепатита А была продемонстрирована в экспериментах на мышах, "прайми-рованных" цельновирионной гриппозной вакциной [257]. Разработанная в 1995 г. вакцина против гепатита А была первой вакциной, полученной на основе гриппозных виросом и разрешенной для применения на людях [223, 265,
287]. В качестве липидной фазы виросом в этой вакцине была использована смесь натуральных и синтетических фосфолипидов: 70% яичного ФХ, 20% ФЭ и 10% ФЛ, выделенных из оболочки вируса гриппа. Испытания на волонтерах продемонстрировали высокую иммуногенность этой вакцины по сравнению с другими коммерческими вакцинами против гепатита А после однократного внутримышечного введения.
На основе гриппозных виросом была получена вакцина, содержащая не только вирусные, но и бактериальные антигены [258, 295]. Эта мультивалент-ная вакцина содержит ковалентно связанные антигены гепатита А и В, дифтерийные, а- и (3-столбнячные антигены, а также гемагглютинин и нейраминида-зу различных штаммов вируса гриппа. Испытания такой вакцины показали, что одновременное введение всех антигенов может привести к супрессии гуморального иммунного ответа, особенно при повторной иммунизации. Это ограничивает применение таких вакцин и требует тщательного подбора доз для каждого антигена [124].
Итак, анализ литературы за последние 25 лет позволил нам сделать следующее заключение. Липосомы и их уникальные свойства продолжают оставаться объектом внимания ученых разных стран как перспективная модель для разработки вакцин нового поколения. Многие исследователи считают, что включение иммуногенов в везикулы позволит обеспечить не только эффективную адресную доставку антигена к иммунокомпетентным клеткам, но и сбалансированную стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета с расширенным спектром защиты на длительный срок.
Таким образом, вопросы разработки новых вакцинных препаратов против особо опасных инфекций и, в частности, чумы, остаются актуальными и требуют дополнительных исследований.
1.2.2 Лечение особо опасных зоонозных инфекций ли-посомальными формами антибиотиков
Лидирующее положение в ряду объектов иммобилизации в липосомы
занимают антибиотики [47, 160, 166]. Применение липосомальных препаратов при лечении различных инфекционных заболеваний повышает их эффективность за счет снижения токсичности лекарств, пролонгации действия, возможности создания его высокой концентрации в месте нахождения возбудителя и способности липосом доставлять лекарства внутрь клеток макроорганизма, где локализуются некоторые простейшие, микроорганизмы и вирусы [68, 103, 108, 111].
Эффект понижения токсичности при иммобилизации в липосомы описан для стрептомицина [34, 35, 104, 162], тетрациклина [157, 159, 165], сульфазина [158,], амфотерицина В [68, 331].
Липосомальный генноинженерный человеческий интерферон (реофе-рон), наносимый на пораженные места, обеспечивает наилучший эффект при лечении экспериментального генитального герпеса по сравнению с неинкап-сулированной формой лекарства. Аналогичный эффект при этой инфекции обнаружен также и у других противовирусных препаратов, включенных в липосомы [119, 74].
При введении в макроорганизм липосомальных антибиотиков они захватываются клетками мононуклеарной фагоцитарной системы и в органах, содержащих большое количество макрофагов, создается повышенная концентрация препарата, причем, на более длительный промежуток времени, чем при использовании свободного антибиотика [158, 160, 162]. Установлено, что сами по себе "пустые" липосомы оказываются эффективными при лечении экспериментального эшерихиозного перитонита у мышей [207], обеспечивают коррекцию активности мембраносвязанных ферментов митохондрий печени при сальмонеллезе [170]. Однако при включении в бислойные липидные везикулы антимикробных препаратов их антибактериальное действие возрастает.
Антимикробная терапия при заболеваниях, вызванных возбудителями инфекционных заболеваний, которые паразитируют внутри клеток хозяина, зачастую оказывается неэффективной. Хотя такие бактерии, как бруцеллы, псевдомонады, микобактерии и др., чувствительны к ряду антибиотиков и сульфаниламидов in vitro, внутриклеточная локализация in vivo защищает их
от обычных доз лекарств и иммунных сил организма. Способность липосом обеспечивать доставку лекарств внутрь клетки предопределяет их успешное использование при лечении заболеваний, вызванных такими возбудителями.
Кузяковой Л.М. [100] получены положительные результаты использования липосомального стрептомицина для профилактики туберкулеза крупного рогатого скота. Стрептомицин и дигидрострептомицин, включенные в липо-сомы, обладают эффективным действием при лечении экспериментального туберкулеза [35, 104], азиатиозид в липосомальной форме проявляет бактерицидную активность по отношению к возбудителям туберкулеза и лепры гораздо выше, чем интактный препарат [294]. Однако по данным Курунова Ю.Н. с соавт. [102], при лечении туберкулеза у мышей стрептомицин, заключенный в бислойные липидные везикулы, состоящие из фосфатидилхолина, не имел существенных преимуществ перед свободным антибиотиком. Эффективным средством при этой инфекции является липосомальный стрептомицидилени-зоникотиноилгидразон, представляющий продукт конденсации стрептомицина с изониазидом.
Бруцеллез по-прежнему не утратил своей значимости в связи с масштабами экономического ущерба животноводству и здоровью населения [5, 8, 9, 143, 187]. Возбудитель бруцеллезной инфекции является факультативным внутриклеточным паразитом, эволюционно сложившиеся взаимоотношения его с макроорганизмом характеризуются малой сопротивляемостью последнего на внедрение микроба. Эти особенности и определяют бруцеллез как хроническое рецидивирующее заболевание. При лечении данного заболевания показана высокая эффективность липосомального гентамицина по сравнению со свободным антибиотиком или его смесью с пустыми липосомами [192, 193]. Бислойные липидные везикулы, содержащие этот аминогликозид, активно уничтожают бактериальные клетки В. abortus внутри мононуклеарных клеток и фагоцитов, не оказывая на них выраженного токсического действия [243, 244, 245].
Преимущества липосомальной формы рифампицина, иммобилизованного в мембрану везикул, перед интактным антибиотиком при лечении экспери-
ментального бруцеллеза выявлены Самариной И.В., Тараном И.Ф. [173]. Для полного освобождения от бруцелл всех подопытных белых мышей, инфицированных вирулентной культурой В. melitensis в дозе 16055 м.к., достаточно одного курса лечения, состоящего из 6 инъекций липосомальной формы рифам-пицина в дозе 0,5 мг/мышь внутрибрюшинно или 1,2 мг/мышь внутримышечно с интервалом в 48 часов, начатого через 20 сут после заражения. Для достижения аналогичной терапевтической активности свободным антибиотиком необходимо проведение трех циклов лечения [58]. Исследованиями Мисето-вой Е.Н. [129] показана эффективность лечения экспериментального бруцеллеза липосомальным азитромицином. Вводимый перорально трехкратно с интервалом 48 часов и курсовой дозой 2,0 мг/мышь он оказывал аналогичный терапевтический эффект по сравнению с интактным препаратом азитромицина у животных, получавших per os антибиотик шестикратно с интервалом 24 часа и курсовой дозой 3,9 мг/мышь.
При лечении экспериментального мелиоидоза высокая эффективность по сравнению с интактными препаратами выявлена при использовании липо-сомальных форм сульфазина и тетрациклина [163, 164], применение которых позволило достичь полного излечения всех экспериментальных животных. Те же авторы [166] позже сообщили, что при лечении легочной формы острого мелиоидоза иммобилизация цефазолина в липосомы способствовала повышению выживаемости белых мышей на 25 %. Кузнецовым СМ. с соавт. [98] отмечено, что использование пефлоксацина, включенного в липосомы, позволяет увеличить срок жизни животных при экспериментальном сапе и мелиоидо-зе.
При изучении лечебных свойств липосомальных форм антибиотиков при туляремии также выявлены их преимущества по сравнению с обычными препаратами. Иммобилизованные в бислойные липидные везикулы гентами-цин и рифампицин были примерно в 1,5 раза эффективнее интактных антибиотиков, а липосомальный стрептомицин - в 2-4 раза, обеспечивая при этом практически полную излечиваемость экспериментальных животных от туляремии [66, 189, 190, 191]. Позднее Ротов К.А. с соавт. [160], Тихонов Н.Г. с со-
авт. [192] также при экспериментальной туляремм подтвердили, что протек-тивные свойства липосомальных форм стрептомицина и гентамицина в два раза выше по сравнению со свободными формами.
Романов В.Е. с соавт. [156] при лечении поздних стадий чумы получил положительный эффект в результате комбинированного применения гентамицина и липосомальной формы полимиксина М. При этом выживаемость животных возросла на 90 % по сравнению с группой животных, получавших свободную форму полимиксина М. Поярков А.Я. с соавт. [153] отметили преимущество липосомальных форм рифампицина и пефлоксацина при лечении экспериментальной чумы белых мышей. Выживаемость животных при этом возросла соответственно на 20 и 30 % по сравнению с их свободными формами. По данным Тихонова Н.Г. с соавт. [192] иммобилизация стрептомицина в липосомы повысила его эффективность при экспериментальной чуме в 3 раза, клафорана - в 2,5 - 4 раза.
Рядом авторов изучены липосомальные формы антибиотиков при сибирской язве в эксперименте [59, 192]. При сибиреязвенной инфекции лечебное действие липосомальных форм цефалоспоринов (клафорана, цефалекси-на), а также рифампицина, сизомицина, ампициллина и доксициклина не отличается от применения интактных антибиотиков за исключением липосомальной формы кефзола, имеющей преимущества перед использованием обычной формы этого лекарства [42, 59]. В результате дальнейших исследований выявлено преимущество липосомальной формы кефзола для лечения сибирской язвы в эксперименте [43]. Двукратное введение липосомальной формы кефзола и интервалом в 48 ч в дозах 1 мг/мышь и 2 мг/мышь способствовало повышению выживаемости животных на 30 %. При пятикратном введении препарата с интервалом в 48 ч количество защищенных животных увеличилось соответственно на 70 % и 80 %. Аналогичные данные позже были получены Тихоновым Н.Г. с соавт. [192].
Исследованиями Оверченко В.В. [141] показано, что активизация неспецифической резистентности белых мышей к возбудителю сибирской язвы под действием коммерческих иммуномодуляторов, повышение эффективности ан-
тибиотикотерапии путем иммобилизации ампициллина и кефзола в липосомы, а также путем сочетанного применения свободных форм кефзола с лейкинфе-роном, ампициллина - с амиксином или лейкинфероном иллюстрирует реальные пути усовершенствования существующих средств и схем лечения данного заболевания.
В настоящее время продолжаются исследования по конструированию различных липосомальных препаратов, изучению их фармакокинетики и использованию при лечении целого ряда заболеваний.
Результаты многочисленных исследований по совершенствованию способов получения липосомальных форм различных лекарственных препаратов, их стандартизации и стабилизации, выяснению механизмов взаимодействия бислойных липидных везикул с клетками, органами и тканями макроорганизма, изучению фармакокинетики липосомальных лекарств, а также эффективности их действия при различных заболеваниях с полным правом дают основание считать, что практическая биология и медицина получат новые возможности в лечении многих болезней с помощью липосомальных лекарственных препаратов направленного действия.
Подводя итог вышесказанному, можно заключить, что поиск адекватной липосомальной рецептуры для инкапсулирования антибактериальных препаратов с целью повышения эффективности средств лечения особо опасных инфекционных заболеваний представляет собой как теоретический, так и практический интерес. Актуальность выбранного направления исследований не вызывает сомнений и является основанием для выполнения соответствующих разделов настоящей работы.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Материалы Биологические модели
Животных получали из питомника СтавНИПЧИ. Работа выполнена на нелинейных белых мышах массой 18-20 г обоего пола, морских свинках обоего пола массой 300-400 г и кроликах-самцах породы "шиншилла" массой 3-3,5 кг. Всего использовано 3000 белых мышей, 30 морских свинок и 12 кроликов. Штаммы микроорганизмов
При выполнении работы использовали вакцинный штамм Yersinia pestis Е V линии НИИЭГ, полученный из коллекционного центра СтавНИПЧИ, культуральные и морфологические свойства которого характерны для чумного микроба океанической разновидности. Показатель ЕД50 данного штамма для белых мышей составил 1-Ю м.к. Микроб разлагает глицерин, рамнозу, сахарозу, лактозу, дульцит; ферментирует глюкозу, мальтозу, арабинозу, ксилозу, маннит; обладает способностью продуцировать пестицин 1, фибринолитической и плаз-мокоагулирующей активностями.
Для заражения животных использовали вирулентный штамм чумного микроба Y. pestis 461, полученный из коллекционного центра СтавНИПЧИ. 1 DCL вирулентного штамма находилась в пределах от 6 до 16 м.к.; высоковирулентный тест-заражающий штамм сибиреязвенного микроба Bacillus anthracis 81/1 (1 LD5o = МО1 спор); вирулентный штамм туляремийного микроба Fransisella tularensis 144/713; вирулентный штамм бруцеллезного микроба Brucella melitensis 565. Референтный штамм B.melitensis 565 (биовар 2) выделен из плода овцематки на Пятигорской бруцеллезной станции в 1953 г. По Граму не окрашивается, находится в S-форме. На агаре растет в виде круглых, вы-
пуклых колоний с ровными краями, в мясопептонном бульоне дает гомогенный рост. Разлагает фуксин и тионин. При росте продуцирует сероводород. Характеризуется повышенной потребностью в углекислоте. Дает агглютинацию с моноспецифической сывороткой anti-melitensis. Питательные среды и химические реактивы
В работе использованы плотные и жидкие питательные среды (агар Хоттингера рН 7,2, бульон Хоттингера рН 7,2, среда Гисса с глюкозой и реактивом Андреде, рН 7,2, 2 % агар Альбими рН 7,2), изготовленные в лаборатории питательных сред Ставропольского научно-исследовательского противочумного института в соответствии с действующей документацией.
Для приготовления липосом использовали фосфатидилхолин (L-a-phosphatidylcholine, p-diarachidoyl, молекулярная масса 846,3; "Sigma", США); фосфатидилглицерин (L-a-phosphatidyl-a-glycerol, di-palmitoyl, молекулярная масса 740,0; "Sigma", США), сфингомиелин ("Sigma", США); димиристоилфосфатидилэтаноламин (L-a-phosphatidylethanolamine, dimyristoyl, молекулярная масса 635,9; "Sigma", США); дицетилфосфат (dicetylphosphate, молекулярная масса 546,9; "Sigma", США); стеариламин (stearylamine, молекулярная масса 269,5; "Sigma", США), холестерин (5-Cholesten-3-[3-ol; 3-|3-Hydroxy-5-cholestene, молекулярная масса 386,7; "Sigma", США). В качестве органических растворителей применяли метанол, этанол, хлороформ, ацетон, н-бутанол (Россия). Растворы готовили на бидистиллированной воде (ГОСТ 6709-72) или 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2 (ГОСТ 4233-77 ХЧ-99,8 %). При определении удельного внутреннего объема липосом использовали набор реактивов «Фотоглюкоза» (Россия).
Антибиотики. Тетрациклин — тетрациклина гидрохлорид во флаконах по 0,1 г (ОАО «Биосинтез», г. Пенза, Россия). Стрептомицин — стрептомицина сульфат во флаконах по 0,5 г (ОАО «Биосинтез», г.
Пенза, Россия). Гентамицин - гентамицина сульфат, порошок по 0,08 г во флаконах (Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез», г. Курган, Россия). Сизомицин - сизомици-на сульфат, в ампулах по 2 мл 5 % (50 мг/мл) раствора (Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез», г. Курган, Россия). Кефзол (цефазолин). Белая лиофилизированная масса натриевой соли, растворима в воде. Коммерческий препарат, выпускаемый ELILILLY S.p.A.-Sesto Fiorentinq (Florence), Italy в герметически закрытых флаконах по 1 г для инъекций. Ломефлоксацин (Maxaquin), таблетки по 0,4 г, ампулы по 5 мл, содержащие 0,4 г ло-мефлоксацина («Searle», Франция). Ампициллин (ампициллина натриевая соль) во флаконах по 0,5 г (Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез», г. Курган, Россия). Оксациллин (оксациллина натриевая соль) во флаконах по 0,5 г для инъекций (ОАО «Биосинтез», г. Пенза, Россия).
Приборы. Испаритель ротационный ИР-1 М2 (Россия). Спектрофотометр БИАН-120 (Россия). Ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т (Россия). Электронные весы «Sartorius» (США). Электронный микроскоп JEM - 100SX «JEOL» (Tokyo, Japan). Световой микроскоп бинокулярный, БИОЛАМ-Л-211 (Россия). Ультрацентрифуга, центрифуги (США, Россия). Холодильник низкотемпературный «ARDO» (Италия). Фотометр КФК-3 (Россия). Анализатор "ЭКСАН-Г" (Россия).
2.2. Методы исследования
Бруцеллезную инфекцию моделировали у белых мышей путем подкожного введения по 0,5-105 м.к. высоковирулентного штамма В. melitensis 565. Использовали взвесь двухсуточной культуры возбудителя бруцеллеза, выращенную на агаре Альбими, рН 7,2 при 37 С, приготовленную по ОСО для визуального определения мутности бактери-
альных взвесей ГИСК им. Л.А. Тарасевича, 10 ед. которого эквивалентны 1,65-10 бруцелл. [77]. Туляремийную инфекцию моделировали путем внутрибрюшинного введения животным вирулентного штамма возбудителя туляремии F. tularensis 144/713 в дозе 100 м.к. Каждая исследуемая группа включала по 10 животных. Сибиреязвенную инфекцию моделировали с помощью типичного высоковирулентного тест-заражающего штамма В. anthracis 81/1, вводимого подкожно во внутреннюю поверхность бедра в дозе 10 ЛД 50 (1 ЛД5о=Ю спор). Каждая исследуемая группа включала по 10 животных. В качестве контрольных групп служили инфицированные животные — контроль заражения; инфицированные животные, получавшие пустые липосомы, -контроль липосом; инфицированные животные, получавшие свободную форму антибиотиков, - контроль антибиотика. Наблюдение за животными проводили в течение 30 суток после окончания лечения.
Капсульний антиген чумного микроба получали по методу Baker Е.Е. et. al. [229] из ацетонвысушенной бактериальной массы Y. pestis ЕВ линии НИИЭГ, выращенной на агаризованной среде Хоттингера рН 7,2 при 37 С в течение 48 часов. ЛИС чумного микроба получали по методу Бахрах Е.Э. с соавт. [18]. РИГА, РИГА, ИФА, НРИФ, РИД проводили общепринятыми способами.
Определение концентрации продуктов перекисной деградации липосомальных фосфолипидов. Степень ПОЛ оценивали по содержанию МДА в тесте с тиобарбитуровой кислотой [38].
Для получения липосом использовали метод этанольной инжек-ции [280], метод ручного встряхивания [293], метод «озвучивания мультиламеллярных везикул» [263], метод "выпаривания в обращенной фазе" [235, 327, 329] и метод "замораживания-оттаивания" [308].
Расчет удельного внутреннего объема липосом осуществляли по включению глюкозы как электронейтрального гидрофильного неизко-
молекулярного вещества. Определение глюкозы для расчета удельного внутреннего объема липосом производили на анализаторе "ЭКСАН-Г" (Россия) глюкозооксидазным методом (123). Элекронно-микроскопический контроль образования, размеров и структуры липосом осуществляли при исследовании нативных препаратов и их ультратонких срезов [69].
Для характеристики степени чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратові вычисляли МПК антибиотиков и определяли диапазон ее колебания [134].
Методы лечения экспериментальных зісивотньїх
Лечение животных проводили в среднетерапевтических дозах [114], пересчитанных для белых мышей [122]. Лечение бруцеллезной инфекции, начиная с 21 суток после инфицирования, проводили 2 десятидневными курсами с интервалом 10 суток. Лечение свободным и ли-посомальным ломефлоксацином проводили перорально в разовых дозах 1 и 2 мг/мышь, сизомицином - внутримышечно и перорально в разовых дозах 2 мг/мышь, тетрациклином - внутримышечно в дозах 1 и 2 мг/мышь. Свободные антибиотики вводили с интервалом 24 ч, липосо-мальные - 48 ч. Контрольным группам лечение не проводили.
Лечение белых мышей, инфицированных туляремией, начинали через 24 ч после заражения. Липосомальный стрептомицин в дозах 0,75 и 1,5 мг/мышь вводили внутримышечно пятикратно в объеме 0,2 мл с интервалом 24 ч. Другим двум группам животных вводили свободный стрептомицин в тех же дозах и с той же продолжительностью лечения. Липосомальный гентамицин вводили внутримышечно в дозах 0,5, 1,0 и 1,5 мг/мышь в объеме 0,5 мл с интервалом в сутки в течение пяти дней. Свободные формы антибиотиков вводили соответствующим группам животных в том же дозо-временном режиме.
При экспериментальной сибирской язве лечение белых мышей липосомальным ампициллином (100, 1000 мкг/мышь) или липосомаль-ным кефзолом (200, 2000 мкг/мышь) начинали через 24 ч после подкожного заражения вирулентным штаммом 81/1 сибиреязвенного микроба в дозе 10 ЛД50 и проводили внутримышечно с интервалом в 24 ч в течение 3 сут (для кефзола) и в течение 2 или 3 сут (для ампициллина) в объеме 0,2 мл. Липосомальный оксациллин вводили соответствующим группам животных внутрибрюшинно через 24 часа после заражения в течение 3 и 5 суток в дозах 2 и 8 мг/мышь с интервалом введения 24 часа. В качестве контрольных групп служили инфицированные животные - контроль заражения; инфицированные животные, получавшие пустые липосомы, - контроль липосом; инфицированные животные, получавшие свободную форму антибиотиков, - контроль антибиотика. Наблюдение за животными проводили в течение 30 сут после окончания лечения.
Критериями протективного эффекта апробируемых препаратов при лечении экспериментальных туляремийной и сибиреязвенной инфекций являлись увеличение средней продолжительности жизни животных, павших от специфических причин, и показатель выживаемости белых мышей. Последний характеризуют по проценту защиты, представляющему разность между процентом выживших животных, леченных липосомальными антибиотиками, и процентом выживших, леченных интактными антибиотиками. Препарат считали эффективным, если он обеспечивал возрастание выживаемости на 20 % и более.
Учет результатов лечения экспериментальной бруцеллезной инфекции белых мышей производили на 14 сутки после окончания лечения. Об эффективности лечения судили по данным бактериологического исследования, которое осуществляли путем посева паховых, ак-силлярных, подчелюстных, парааортальных лимфоузлов и селезенки,
взятых от умерщвленных животных, на агар Альбими, рН 7,2. Критерием интенсивности обсемененности бруцеллами организма мышей служили: ИВ - частное от деления количества органов с положительными результатами бакисследования на количество всех исследованных органов; ИО - отношение суммы баллов, характеризующих рост к сумме возможного максимального количества баллов; количество свободных от инфекции животных.
Иммунизацию белых мышей осуществляли путем однократного введения препаратов в объеме 0,2 мл белым мышам и 0,5 мл морским свинкам подкожно, внутримышечно, перорально. Через 21 сутки после иммунизации животных заражали подкожным введением вирулентного штамма Y. pestis 461 в дозах 100, 1000, 10 000, 100 000 м.к. На каждую дозу заражения брали по 10 животных. Эффективность иммунизации оценивали по изменению величины ЛД5о вирулентного штамма и увеличению СШК павших белых мышей. Иммунизацию морских свинок осуществляли путем однократного введения препаратов в объеме 0,5 мл Критериями протективного эффекта апробируемых препаратов являлись увеличение СПЖ животных, павших от специфических причин, и показатель выживаемости морских свинок. Последний характеризуют по проценту защиты, представляющему разность между процентом выживших животных, иммунизированных липосомальными антигенами, и процентом выживших, привитых интактными Ф1 и ЛПС. Иммунизирующий препарат считали эффективным, если он обеспечивал возрастание выживаемости на 20 % и более.
Цитоэнзимохимические методы исследования ПМЯЛ крови Гликоген обнаруживали по методу Мс. Manus G и Хочкисса Р. в модификации Сафроновой В.М. с соавт. [176]. МПО определяли по методу Лилли Р. [107]. КБ выявляли по методу. Пигаревского В.Е [148] в модификации Сафроновой В.М. с соавт. [176]. Помимо вышеперечис-
ленных реакций, проводилась обзорная окраска мазков азур-эозином [149]. Оценку ферментативной активности МПО и содержания гликогена и КБ в нейтрофилах крови проводили полуколичественным методом по Kaplow L. [275] в модификации Astaldi G., Verga Z. [225].
Гистоморфологический метод. На всех этапах эксперимента животных опытной и контрольной групп умерщвляли декапитацией. Гистоморфологическому исследованию подвергались лимфатические узлы: паховые (регионарный 1-го порядка), парааортальные (регионарный И-го порядка), кусочки печени, селезенки, почки. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заключали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином, эозином. Для выявления жиров и жироподобных веществ часть материала после фиксации резали на замораживающем микротоме с последующей окраской Суданом Ш. Препараты изучали при увеличении 7x20 и 7x40. Исследование проводилось в динамике (через сутки), а также на 3, 7, 10 сутки после отмены введения липосом. На каждый срок забора материала исследовали по 10 животных, в качестве контроля служили органы и ткани 10 интактных животных и 10 белых мышей, получавших свободные антибиотики.
ГС/Глипидов осуществляли в специальной камере с растворителем (хлороформ : метанол : вода в соотношении 65:25:4) с использованием в качестве свидетелей тест-набора стандартов фосфолипидов («Sigma», USA) на пластинке с силуфолом («Kavalier», Czechoslovakia) размером 15x15 см [88].
Методы статистической обработки материала. Для статистической обработки материала использовали методы Ашмарина Г.П. и Воробьева А.А. [14] и Ойвина И.А. [166]. Результаты исследования обрабатывались на IBM PC 550 с использованием пакета прикладных программ EXCEL.
Принципы включения в липосомы веществ различной химической природы и стабилизации липосом. Влияние ли-пидных везикул на гомеостаз макроорганизма
В настоящее время предложены сотни разнообразных методов приготовления липосом, позволяющих получать везикулы различного размера, состава, структуры и внутреннего объема, а также способы иммобилизации в них веществ различной химической природы. Выбор того или иного метода получения липосом определяется целью работы, природой включаемого вещества и его расположением в липосомах (во внутреннем водном объеме или в бислойной мембране).
Существуют довольно простые приемы изготовления липосом при гидратации пленки фосфолипидов, в результате чего получаются "гигантские" моноламеллярные везикулы, диаметр которых составляет от 1 до 50 мкм [268]. Аналогичный процесс образования липосом из альвеолярного сурфактанта, частиц угольной, кремниевой пыли и сульфамеразина воспроизводится на границе раздела фаз "жидкость-воздух" [239]. Метод получения моноламелляр-ных липосом со средним диаметром 230 нм при смешивании различных дисперсий фосфолипидов описан Pnisieux F., Beau D. [311].
Включение в липосомы различных ингредиентов (противоопухолевых лекарственных веществ, антибиотиков, белков, нуклеиновых кислот) удается осуществить в процессе их дегидратации - регидратации. Диспергирование лиофильно высушенных липосом в водной фазе, содержащей включаемый ингредиент, сопровождается его иммобилизацией во внутренний объем бислой-ных везикул. Таким путем удается включить в липосомы до 70 % иммобили-зируемых веществ в зависимости от их природы и физико-химических свойств [260,271].
Большие многослойные везикулы в зависимости от целей исследования готовят из фосфатидилхолина и его производных или смеси липидов, в состав которой могут входить фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфати- дилсерин, фосфатидилинозитол, кардиолипин, холестерин, фосфатидная кислота, диацетилфосфат, стеариламин.В состав липосомальной мембраны могут быть включены и другие липиды, наличие и количество которых определяется специальными целями исследования [56]. Медленное перемешивание в течение длительного времени или введение в состав липидной смеси 10-20 % отрицательно заряженного липида, в отличие от кратковременного энергичного встряхивания, ведет к образованию везикул с увеличенным внутренним объемом [90, 271, 289].
Под воздействием ультразвуковых волн мультиламеллярные липосомы, полученные методом встряхивания, или набухшая в водной фазе фосфолипид-ная пленка нарушают свою первоначальную структуру с образованием моно-ламеллярных везикул. В ряде случаев ультразвуковую обработку осуществляют в присутствии органического гидрофобного растворителя, который затем удаляют [211]. При этом размеры липосом уменьшаются и становятся более однородными пропорционально мощности и времени озвучивания [232].
Ультразвуковой метод получения липосом используют для иммобилизации в них самых различных веществ, т.к. он легко воспроизводим и отличается простотой осуществления [37, 182, 271]. Иногда кратковременное озвучивание применяют для включения веществ в уже готовые липосомы [56]. При тщательно контролируемых условиях озвучивания негативное воздействие ультразвука на иммобилизируемые в липосомы вещества удается максимально нивелировать [46, 231].
Растворенные в некоторых органических растворителях фосфолипиды при впрыскивании различными способами в водную фазу способны образовывать моноламеллярные липосомы различных размеров. В качестве органических растворителей для этих целей используют как смешивающиеся, так и практически несмешивающиеся с водой вещества, имеющие невысокую температуру кипения, что позволяет их легко удалять из реакционной смеси под вакуумом или при незначительном нагревании [56, 325, 340]. Основным недостатком данных методов приготовления липосом является то, что в получаемых препаратах удерживаются остатки органического растворителя, от ко торого не удается полностью избавиться даже при использовании растворителей с низкой температурой кипения.
Стабильные, свободные от посторонних веществ моноламеллярные липосомы с высокой концентрацией липидов удается получать путем экструзии, пропуская водную дисперсию мультиламеллярных липосом под давлением через узкие отверстия (пресс Френча). Уже после первого пропускания 70 % липидов приходится на моноламеллярные липосомы, при вторичной экструзии их выход превышает 95% [56].
Близким к экструзионным методам получения бислойных везикул относится способ приготовления липосом с большим внутренним объемом при использовании мембранных ультрафильтров "Синпор" фирмы "Хемапол" (Прага). По мере пропускания жидкости через фильтр с нанесенными фосфолипи-дами идет формирование липосом с увеличением концентрации липидов в препарате до 70 мкг/мл после 100 повторяющихся процедур [199].
Материалы исследования
Животных получали из питомника СтавНИПЧИ. Работа выполнена на нелинейных белых мышах массой 18-20 г обоего пола, морских свинках обоего пола массой 300-400 г и кроликах-самцах породы "шиншилла" массой 3-3,5 кг. Всего использовано 3000 белых мышей, 30 морских свинок и 12 кроликов. Штаммы микроорганизмов
При выполнении работы использовали вакцинный штамм Yersinia pestis Е V линии НИИЭГ, полученный из коллекционного центра СтавНИПЧИ, культуральные и морфологические свойства которого характерны для чумного микроба океанической разновидности. Показатель ЕД50 данного штамма для белых мышей составил 1-Ю м.к. Микроб разлагает глицерин, рамнозу, сахарозу, лактозу, дульцит; ферментирует глюкозу, мальтозу, арабинозу, ксилозу, маннит; обладает способностью продуцировать пестицин 1, фибринолитической и плаз-мокоагулирующей активностями.
Для заражения животных использовали вирулентный штамм чумного микроба Y. pestis 461, полученный из коллекционного центра СтавНИПЧИ. 1 DCL вирулентного штамма находилась в пределах от 6 до 16 м.к.; высоковирулентный тест-заражающий штамм сибиреязвенного микроба Bacillus anthracis 81/1 (1 LD5o = МО1 спор); вирулентный штамм туляремийного микроба Fransisella tularensis 144/713; вирулентный штамм бруцеллезного микроба Brucella melitensis 565. Референтный штамм B.melitensis 565 (биовар 2) выделен из плода овцематки на Пятигорской бруцеллезной станции в 1953 г. По Граму не окрашивается, находится в S-форме. На агаре растет в виде круглых, вы пуклых колоний с ровными краями, в мясопептонном бульоне дает гомогенный рост. Разлагает фуксин и тионин. При росте продуцирует сероводород. Характеризуется повышенной потребностью в углекислоте. Дает агглютинацию с моноспецифической сывороткой anti-melitensis. Питательные среды и химические реактивы
В работе использованы плотные и жидкие питательные среды (агар Хоттингера рН 7,2, бульон Хоттингера рН 7,2, среда Гисса с глюкозой и реактивом Андреде, рН 7,2, 2 % агар Альбими рН 7,2), изготовленные в лаборатории питательных сред Ставропольского научно-исследовательского противочумного института в соответствии с действующей документацией.
Для приготовления липосом использовали фосфатидилхолин (L-a-phosphatidylcholine, p-diarachidoyl, молекулярная масса 846,3; "Sigma", США); фосфатидилглицерин (L-a-phosphatidyl-a-glycerol, di-palmitoyl, молекулярная масса 740,0; "Sigma", США), сфингомиелин ("Sigma", США); димиристоилфосфатидилэтаноламин (L-a-phosphatidylethanolamine, dimyristoyl, молекулярная масса 635,9; "Sigma", США); дицетилфосфат (dicetylphosphate, молекулярная масса 546,9; "Sigma", США); стеариламин (stearylamine, молекулярная масса 269,5; "Sigma", США), холестерин (5-Cholesten-3-[3-ol; 3-3-Hydroxy-5-cholestene, молекулярная масса 386,7; "Sigma", США). В качестве органических растворителей применяли метанол, этанол, хлороформ, ацетон, н-бутанол (Россия). Растворы готовили на бидистиллированной воде (ГОСТ 6709-72) или 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2 (ГОСТ 4233-77 ХЧ-99,8 %). При определении удельного внутреннего объема липосом использовали набор реактивов «Фотоглюкоза» (Россия).
Разработка биотехнологии получения липосом с антигена ми чумного микроба
Проведена оценка методов «замораживания-оттаивания» и «выпаривания и обращения фаз» в плане эффективного включения Ф1 чумного микроба с сохранением биологических свойств и количества антигена, связанного с наружной поверхностью мембран.
Липосомы готовили из ФХ, ФГ и X в молярном соотношении 2:2:1 с общей концентрацией 10 мкмоль липидов на 1 мл включаемой водной фазы. В качестве включаемого материала использовали раствор капсульного антигена чумного микроба в буфере с концентрацией 350 мг%.
После удаления свободного антигена в надосадке и в осадке (липо-сомах) определяли количество Ф1 по специфической активности в РНГА с антительным чумным эритроцитарным диагностикумом. Количество антигена, связанного с липосомами, определяли после разрушения последних 1 % раствором дезоксихолата натрия. Величина титров при этом условно принималась за 100 %. Наличие Ф1 чумного микроба, связанной с поверхностью липидной мембраны, оценивали по способности интактных (неразрушенных) липосом давать положительную РНГА. Количество капсульного антигена чумного микроба, содержащегося во внутреннем объеме липосом, определяли по разнице этих двух величин. Результаты общего включения капсульного антигена и распределения Ф1 чумного микроба на поверхности и во внутреннем объеме липосом представлены в таблице 3.
Метод получения липосом Уровень общего включения Ф1 в липосомы Количество Ф1 на поверхности липосом % г/10 моль липидов % от общего включения г/10 моль липидов Выпаривание и обращение фаз 85 50 37,5 18,75 Замораживание-оттаивание 90 56,7 50 28,35 Известно, что полученные методом «выпаривания в обращенной фазе» липосомы характеризуются высокой эффективностью иммобилизации в них материала, процент включения которого в бислойную мембрану и внутренний объем липосом зависит от гидрофильности, гидрофобности и прочих его свойств [56].
Для исключения негативного влияния на включаемый материал ультразвука перемешивание растворенных в хлороформе липидов (30 мг/мл) с водной фазой осуществляли при помощи скоростной мешалки до образования эмульсии типа "вода в масле" (около 10-12 минут). Данная методика, позволяющая обходиться без ультразвуковой обработки, предотвращает окисление фосфолипидов и разрушение антигена. При использовании метода "обращения фаз" в описанной модификации получены липосомы с уровнем включения капсульного антигена чумного микроба 85 %, а содержание Ф1 в липосомах составило 50 г на 10 моль липидов.
В процессе многократно повторяющихся циклов замораживания фосфолипидных дисперсий с последующим оттаиванием происходит формирование липосом с высоким процентом включения инкапсулируемых веществ. При этом происходит слияние липосом и увеличение их размеров [321]. Мы использовали этот метод в модификации, предложенной Клиба новым А.Л. с соавт. [92] для включения в липосомы материала, чувствительного к воздействию ультразвука. Раствор капсульного антигена вносили в предварительно кратковременно озвученную в течение 3 минут с частотой 22 кГц дисперсию липидов в 0,15 молярном растворе маннита, после чего ее подвергали шести циклам "замораживания-оттаивания". Включение Ф1 чумного микроба в результате достигло 90 %, а содержание капсульного антигена в липосомах составило 56,7 г на 10 моль липидов.
