Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 6
1.1 .Актуальность работы 6
1.2. Цель и задачи исследований 10
1.3. Научная новизна 11
1.4. Практическая значимость работы 12
1.5. Основные положения диссертации, выносимые на защиту 13
1.6. Апробация работы 14
1.7. Публикации 15
1.8. Объем и структура диссертации 15
1.9 Личный вклад автора 15
1.10. Благодарности 15
2. Обзор литературы 16
2.1. Природный полисахарид ХИТОЗАН 16
2.1.1. Сырьевые источники для получения и строение хитозана 16
2.1.2. Способы получения хитозана 21
2.1.3. Свойства хитозана 26
2.1.4. Основные направления практического применения хитозана и его производных в различных областях народного хозяйства 28
2.1.4.1. Применение хитозана и его производных в пищевой промышленности 29
2.1.4.2. Применение хитозана и его производных в животноводстве и растениеводстве 32
2.1.4.3. Применение хитозана и его производных в медицине и ветеринарии 36
2.1.4.4.Применение хитозана и его производных в парфюмерно косметической промышленности 41
2.1.4.5. Другие направления практического применения хитозана и его производных 44
2.2. Протеолитический фермент ТРИПСИН 45
2.2.1. Характеристика ферментных препаратов и способы их получения 45
2.2.2.Области применения ферментного препарата трипсин 58
2.3. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) 49
2.3.1 Сырьевые источники для получения ДНК 49
2.3.2.Способы получения ДНК 51
2.3.3.Биологическая активность ДНК 56
2.3.4. Области применения ДНК 59
2.4.Мидийный гидролизат 64
2.4.1. Способы получения Мидийного гидролизата 64
2.4.2. Биологическая активность Мидийного гидролизата 65
2.4.3. Области применения Мидийного гидролизата 68
3. Собственные исследования 71
3.1. Материалы и методы исследований 71
3.1.1. Материалы исследований 72
3.1.2. Методы исследований 74
3.2. Результаты исследований и их обсуждение 90
3.2.1.Разработка промышленных технологий изготовления хитозана и его производных для практического применения в различных областях народного хозяйства 90
3.2.1.1. Разработка промышленной технологии изготовления низкомолекулярного хитозана 92
3.2.1.2. Разработка промышленной технологии изготовления натриевой соли сукцината хитозана 99
3.2.2. Изучение параметров острой и хронической токсичности хитозана 115
3.2.3. Изучение радиопротекторных свойств хитозана 121
3.2.4. Практические аспекты применения хитозана и его производных в различных областях народного хозяйства 122
3.2.4.1. Применение различных форм хитозана в ветеринарной практике 122
3.2.4.2.Изучение влияния хитозана на резистентность сельскохозяйственных животных и птицы 131
3.2.4.3. Применение хитозана в составе кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и птицы 134
3.2.4.4. Применение хитозана в качестве флокулянта при производстве вакцин 142
3.2.4.5. Применение хитозана в составе биологически активных добавок 153
3.2.4.6. Применение хитозана в технологии получения протеолитического ферментного препарата трипсин 162
3.2.5. Разработка промышленной технологии изготовления дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и практические аспекты ее применения 170
3.2.5.1. Разработка промышленной технологии изготовления ДНК 170
3.2.5.2. Практические аспекты применения ДНК
3.2.5.2.1. Применение ДНК в составе биологически активных добавок (БАД) 175
3.2.5.2.2. Применение ДНК в составе парфюмерно-косметической
продукции 177
3.2.6. Разработка промышленной технологии получения Мидийного гидролизата и изучение эффективности его применения для
повышения резистентности молодняка сельскохозяйственных животных и птиц 181
4. Выводы 201
5. Практические предложения 203
6. Список литературы 206
- Цель и задачи исследований
- Свойства хитозана
- Методы исследований
- Разработка промышленной технологии изготовления дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и практические аспекты ее применения
Введение к работе
1.1.Актуальность работы. Разработка промышленной технологии производства биологически активных веществ из сырья природного происхождения является важной задачей биотехнологии, позволяющей осуществить более полное и комплексное использование биоресурсов.
В настоящее время вопросами разработки препаратов на основе переработки морепродуктов в различных областях народного хозяйства занимаются многие научные коллективы как в нашей стране, так и за рубежом (Новикова М.В. с соавт., 1997; Самуйленко А.Я. с соавт.,2003; Быкова В.М. с соавт.,2003; Гамзазаде А.И. с соавт.,2003; Большаков И.Н. с соавт.,2003; Фомичев Ю.П. с соавт., 2006; Wall D. et al., 2001; Chaidedgumjorn et al., 2002; Muzzarelli R.A.A. et al., 2005).
Хитозан привлекает внимание широкого круга исследователей и практиков благодаря комплексу физико-химических и биологических свойств и неограниченной воспроизводимой сырьевой базе. Полисахаридная природа хитозана обусловливает его сродство к живым организмам, а наличие реакционноспособных функциональных групп обеспечивает возможность разнообразных химических модификаций, позволяющих усиливать присущие ему свойства или придавать новые в соответствии с предъявленными требованиями.
Значительный вклад в изучение хитина и хитозана внесли ученые: Быков В.П., Рогожин С.В., Гамзазаде А.И., В.П., Варламов В.П., Албулов А.И., Немцев С.В., Нудьга Л.А., Скрябин К.Г., Сафронова Т.М., Быкова В.М., Вихорева Г.А., Феофилова Е.П., Маслова Г.В., Новиков В.Ю., Куприна Е.Э., Михайлов С.Н., Кильдеева Н.Р., Липатова И.М., Александрова В.А., Комаров Б.А., Марквичева Е.А., Урьяш В.Ф., Братская С.Ю., Тихонов В.Е., Лопатин С.А., Велешко А.Н., Ежова Е.А., Акопова Т.А и другие исследователи, работы которых направлены на изучение свойств хитина и хитозана, способов их получения из разных видов сырья и применения в различных областях народного хозяйства.
Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в современной биотехнологии. Ежегодный мировой прирост объема их производства в настоящее время составляет 10-15 %. Наибольший удельный вес среди выпускаемых ферментных препаратов (до 60% общего объема) занимают протеиназы и амилазы. В настоящее время отечественная промышленность заметно отстает по объему производства ферментов от ведущих зарубежных стран, а высокие цены на коммерческие трипсины зарубежных производителей стимулируют интерес к разработке и усовершенствованию технологических процессов его получения.
Применяемые в настоящее время методы выделения ДНК из сырья животного происхождения многостадийны, трудоемки и требуют дорогостоящего оборудования и реактивов. У нас в стране и за рубежом она производится в небольших объемах. Основным недостатком большинства способов получения ДНК является дороговизна и сложность их воспроизведения в промышленных условиях. В связи с этим, разработка промышленной технологии получения дезоксирибонуклеиновой кислоты для практического применения актуальна.
Одним из современных подходов к решению проблемы иммунной недостаточности у молодняка сельскохозяйственных животных является разработка, производство и применение новых экологически безопасных эффективных препаратов, таких как пробиотики и пребиотики, которые в малых малых дозах способны существенно изменять обмен веществ и повышать общую резистентность организма (Панин А.Н., 1997; Субботин В.В. с соавт.,1998; Тараканов Б.В., 1998; 2002; Малик Н.И., 2002; Архипов А.В., 2010).
Богатейший источник биологически активных веществ – обитатели Мирового океана, в частности моллюски, в мясе которых обнаружены соединения, обладающие широким спектром биологической и фармакологической активности. Способность повышать общую резистентность организма связывают с наличием в мидийных препаратах липидных антиоксидантов, меланоидинов и микроэлементов.
1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы – разработка промышленных технологий изготовления биологически активных веществ из сырья природного происхождения и создание на их основе новых экологически безопасных эффективных биопрепаратов для применения в различных отраслях народного хозяйства.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
- проанализировать современное состояние производства биологически активных веществ;
-разработать технологические процессы производства производных хитозана, протеолитического ферментного препарата трипсина, дезоксирибонуклеиновой кислоты и мидийного гидролизата;
-изготовить опытные образцы препаратов, изучить их физико-химические свойства, биологическую активность и эффективность применения в различных отраслях народного хозяйства;
- разработать нормативную документацию на препараты и освоить их промышленный выпуск.
1.3. Научная новизна. Впервые разработаны промышленные технологии получения хитозана с заданными характеристиками для практического применения.
Установлена профилактическая и терапевтическая эффективность низкомолекулярного хитозана (ММ 5-10 кДа) при гамма-облучении мышей радиоцезием в летальных дозах.
Научно обоснована и экспериментально доказана целесообразность использования хитозана для терапии и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных.
Показана высокая ростостимулирующая активность хитозана при введении его в рацион подсосным свиноматкам и поросятам, при этом у животных отсутствовала стрессорная реакция адаптационного синдрома.
Установлены высокие сорбционные свойства хитозана в отношении бактерий P.multocida и показана возможность его использования в качестве флокулянта в технологическом процессе концентрирования бакмассы.
Научно обоснована и экспериментально доказана эффективность влияния комплекса пробиотика «Проваген» с хитозаном на микробиоценоз толстого кишечника, динамику живой массы и морфо-биохимические показатели гомеостаза телят.
Экспериментально доказана эффективность выпаивания раствора хитозана из расчета 5 мг/голову начиная с 32-х дневного возраста в составе рациона кормления на среднесуточный прирост и живую массу цыплят-бройлеров.
Включение в рецептуру лечебно-профилактической зубной пасты низкомолекулярного водорастворимого хитозана (ММ 10-40 кДа) позволило получить пасту с противовоспалительным и кариеспрофилактическим действием, а также высокими очищающими и дезодорирующими свойствами (Патент РФ № 2328267).
Впервые разработана промышленная технология изготовления протеолитического ферментного препарата трипсина, отличающаяся экологической безопасностью производства, с применением адсорбента - природного полисахарида хитозана (Патент РФ № 2265053; Патент РФ № 2437936).
Впервые разработана промышленная технология изготовления дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из молок лососевых рыб с использованием ферментного препарата трипсина.
Впервые разработана экологически безопасная промышленная технология получения Мидийного гидролизата–биологически активной пищевой добавки из мяса мидий «Мидийный соус». (Патент РФ № 2284708).
Экспериментально обоснованы схемы применения Мидийного препарата при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных и птицы для увеличения интенсивности роста и уровня естественной резистентности.
1.4. Практическая значимость работы
Результаты исследований использованы при разработке технологий изготовления: различных форм и модификаций хитозана («Хитозан пищевой»; лекарственного средства для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных «Хитозан»; косметического сырья «Сукцинат хитозана», «Ламихит» - экстракта ламинарии с хитозаном, «Фукохит» - экстракта фукуса с хитозаном); протеолитического ферментного препарата трипсина; дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых; мидийного гидролизата – биологически активной пищевой добавки из мяса мидий «Мидийный соус».
Промышленный выпуск разработанных препаратов освоен на производственном участке отдела получения биологически активных веществ ВНИТИБП и в ЗАО «Биопрогресс».
Создание новых технологий и организация промышленного выпуска биологически активных веществ дали возможность их применения:
- в ветеринарии (лекарственное средство «Хитозан»);
- в пищевой промышленности («Хитозан пищевой», биологически активная добавка «Кислота дезоксирибонуклеиновая из молок лососевых рыб», биологически активная пищевая добавка «Мидийный соус»);
- в биологической промышленности (ферментный препарат трипсин);
- в парфюмерно-косметической промышленности (косметическое сырье «Сукцинат хитозана», «Ламихит», «Фукохит», «Кислота дезоксирибонуклеиновая из молок лососевых рыб»).
Годовой объем выпуска биологически активных веществ в зависимости от вида продукции и потребностей составляет от 800 кг до 3-5 тонн.
1.5 Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-промышленные технологии изготовления низкомолекулярного хитозана и сукцината хитозана;
-параметры острой и хронической токсичности хитозана;
-радиопротекторные и флоккулирующие свойства хитозана;
- различные формы хитозана в ветеринарной практике;
-оценка эффективности влияния препаратов хитозана на резистентность сельскохозяйственных животных и птицы;
-хитозан в составе кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и птицы;
-хитозан в технологии получения протеолитического ферментного препарата трипсина;
-хитозан в составе парфюмерно-косметической продукции;
-промышленная технология изготовления дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и практические аспекты ее применения;
-промышленная технология получения Мидийного гидролизата;
-эффективность применения мидийного гидролизата для повышения резистентности молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.
1.6. Апробация работы. Основные материалы доложены и обсуждены:
- в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий на заседаниях ученого совета и методических комиссий ВНИТИБП (1996-2011 гг.); на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2008-2011 гг.); на Международных конгрессах в Москве, Санкт-Петербурге, Минске, Ялте, Алуште,Харькове, Всесоюзных, Республиканских и Всероссийских конференциях в Москве, Санкт-Петербурге, Орле, Черноголовке, Щелково, Ставрополе, Казани, Пущино, Махачкале, Луганске, Светлогорске, Нижнем Новгороде, Ярославле, Воронеже, Боровске, Южно-Сахалинске, Уфе, Армавире, Краснодаре (1996-2012 гг.).
Разработки демонстрировались на выставках: II Международная выставка «Инновации 99. Технологии живых систем» (Москва, 1999); VIII выставка «Медицина для Вас» (Москва, 2001); Международная выставка «Биотехника» (Ганновер, 2001); II Международная выставка «Планета и здоровье» (Москва, 2001); «Биотехнологии России» (Берлин, 2001); «Лаборатория-Экспо» (Москва, 2009-2011); «Биоиндустрия-биотехнологические решения для здравоохранения» (С.-Петербург, 2011); Российская агропромышленная выставка «Золотая осень» (Москва, 2002-2011 гг.). Разработки по материалам диссертационной работы были награждены 16 дипломами, 7 золотыми, 3 серебряными и 1 бронзовой медалью ВДНХ СССР и ВВЦ. За разработку промышленных технологий изготовления биологически активных препаратов и внедрение их в производство автором получены 4 медали «Лауреат ВВЦ» и серебряная медаль РАЕН имени Е. Дашковой.
1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 101 научной работе, в том числе в 1 монографии и 19 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России. По материалам исследований получено 4 Патента РФ на изобретения.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 324 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 42 таблицы и 33 рисунка. Список литературы включает 442 наименования, из которых 299 отечественных и 143 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность работы, ее научную и практическую значимость.
Цель и задачи исследований
Кроме того, в хитинсодержащих организмах хитин чаще всего ковалентно связан с другими биополимерами: с белками (ракообразные), с глюканами (грибы), с меланинами (насекомые). В панцире ракообразных и в меньшей степени насекомых хитин также связан с минеральными веществами. В наиболее чистом виде в природе хитин встречается в гладиусе кальмаров.
Хитозан содержит 5-15% ацетамидных групп, а также до 1% групп, соединенных с аминокислотами и пептидами (6).
Имеются сведения о надмолекулярной и морфологической структуре хитина и хитозана, полученные с помощью различных современных методов исследований: ЯМР (378), ЭПР (112, 379), ИК-спектроскопии (379, 380), рентгенографии (379, 113-115), рассеяния электронов (381), хроматографии (382), пиролитической масс-спектрометрии (383), электронной сканирующей спектроскопии (379). Кроме того, применяются методы термического анализа (379, ИЗ, 116), термомеханического анализа (115), оптические (117) и по-тенциометрического титрования (111).
Многочисленные исследования позволяют сделать вывод о том, что хитин и хитозан, подобно целлюлозе, обладают стереорегулярной высокоупо-рядоченной структурой и являются аморфно-кристаллическими полимерами.
С помощью рентгеновской спектроскопии было выявлено, что хитин обладает высокой степенью кристалличности (до 85%). Установлено, что хитин существует в трех кристаллографических формах (а-, (3- и у-хитин), отличающихся пространственным расположением молекулярных цепей в элементарной ячейке кристаллита и присутствием связанной воды. Так, в а- хитине цепи расположены антипараллельно по отношению друг к другу, в Р-хитине они расположены параллельно друг другу, при этом цепи направлены в одну сторону, а в у-хитине две цепи расположены в одну сторону параллельно относительно друг друга, а следующая цепь расположена в антипараллельном направлении (384, 385).
По данным (377), наиболее распространенная кристаллическая модификация а-хитина является орторомбической, её элементарная ячейка содержит фрагменты двух цепей, которые антипараллельны и за счет этого плотно упакованы, а-хитин присутствует в панцире ракообразных и моллюсков, кутикуле насекомых, клеточной стенке грибов, а-хитин характеризуется высокой химической стабильностью, так как в его структуре реализуется образование максимально возможного числа водородных связей.
В (3-хитине кристаллы могут подвергаться обратимой внутрикристалли-ческой гидратации (377). Эта форма хитина встречается у каракатицы, в гла-диусе кальмара. (З-хитин имеет более низкую химическую стабильность за счет меньшего числа водородных связей, поэтому он легче подвергается различным модификациям, у-модификация хитина присутствует в коконах насекомых.
Все формы хитина стабильны в кипящем 5 %-ном растворе КОН или NaOH, но при обработке их концентрированной соляной кислотой при комнатной температуре происходит превращение [3- и у-форм в а-форму (377).
Таким образом, для хитина характерно высокое содержание внутри- и межмолекулярных водородных связей, что обуславливает его жесткую кристаллическую структуру, малую активную поверхность (118) и, как следствие, низкую реакционную способность в гетерогенных процессах.
Рентгенографические исследования хитозана (119) показывают, что он имеет ту же кристаллическую решетку, что и хитин, но меньшую упорядоченность макромолекул (111), то есть дезацетилирование хитина приводит к уменьшению общего порядка структуры (степень кристалличности снижается до 40 - 50%). Снижение степени кристалличности может быть обусловлено как аморфизацией структуры вследствие внутрикристаллического набухания при дезацетилировании, так и нарушением регулярности строения полимерной цепи в случае неполного отщепления N-ацетильных групп.
Хитозан, в отличие от хитина, растворяется в разбавленных растворах органических и минеральных кислот, буферных системах, поэтому легко может быть охарактеризован по величине вязкости и степени полидисперсности с помощью различных физико-химических методов (111). Свободные аминогруппы хитозана являются гораздо более эффективными для образования хелатных комплексов с ионами металлов, чем ацетамид-ные группы хитина. Взаимодействие хитозана со сложными органическими молекулами, такими как белки, липиды, пестициды, красители определяется не только наличием высокого положительного заряда, но и, в большей степени, вторичной и третичной структурой полимера.
Химические свойства хитина определяются только наличием двух гидро-ксильных групп в его элементарном звене. Более реакционноспособная аминогруппа хитозана дает возможность осуществления значительно большего количества, по сравнению с хитином, химических модификаций (111).
Сырьем для получения хитозана служит хитин, который в живой природе присутствует в виде комплексов с другими веществами, поэтому для его выделения проводят последовательное удаление сопутствующих веществ. В зависимости от вида исходного сырья и требуемого качества хитина и хитозана количество, последовательность и технологические параметры процесса получения хитина и хитозана могут быть различными. Принципиальная схема процесса получения хитина и хитозана из панцирьсодержащего сырья представлена на рисунке 4.
Процесс дезацетилирования проводят обычно с помощью концентрированных щелочей при повышенных температурах (6, 9, 11, 22, 23, 24, 25, 304). Наиболее распространено дезацетилирование растворами щелочей 30-50%-ной концентрации при температуре 100-140С, времени реакции 0,5-10 часов и гидромодуле 10:1 (127). При получении хитозана в указанных условиях одновременно с реакцией дезацетилирования идет деструкция хитина, т.е. разрыв его цепей по гликозидным связям, что приводит к уменьшению молекулярной массы хитозана и снижению его вязкости.
Свойства хитозана
Из научных источников известно, что наиболее нативные препараты ДНК с минимальным содержанием белковых примесей могут быть получены при использовании детергентов, которые ингибируют ДНК-азы и эффективно диссоциируют дезоксирибонуклеопротеидные комплексы. Учеными ТИБОХ ДВО РАН предложена методика получения ДНК, включающая использование детергента с последующей температурной обработкой раствора ДНК и добавление к раствору хлорида натрия. На этой стадии смесь может храниться в обычных условиях без потери активности ДНК. Последующая обработка хлороформом позволяет эффективно депротеинизировать ДНК. Полученные данным методом препараты ДНК являются достаточно высокомолекулярными (ММ 6 106Да), имеют высокую степень нативности, что подтверждается значительным гиперхромным эффектом, достигающим 36%, содержат незначительное количество белка (менее 1%) и РНК (менее 0,5%) (243).
Наряду с детергентным методом получения ДНК теми же авторами разработан метод выделения ДНК, основанный на использовании протеолитиче-ских ферментов морского происхождения. Окончательное освобождение ДНК от пептидов достигалось ультрафильтрацией или обработкой хлороформом. Препараты ДНК, выделенные таким методом, приближались по таким свойствам, как степень полимерности, активность и содержание примесей, к препаратам, полученным детергентным методом (243).
Учитывая тот факт, что в ряде случаев для практических целей используются низкополимерные препараты ДНК, не отличающиеся высокой степенью нативности, был опробован и несколько модифицирован щелочной метод выделения ДНК. С этой целью после гомогенизации молоки заливали слабоконцентрированным раствором щелочи и инкубировали около суток при комнатной температуре. Из полученного гидролизата ДНК осаждали двумя объемами этанола. Метод отличается достаточно полным выходом ДНК (70 54 80 % от общего содержания ДНК в молоках). При этом препараты ДНК отличаются относительно небольшим содержанием белка - 8% (243).
Исследования показали, что для получения биологически активного продукта пригодна и низкомолекулярная ДНК (ММ 2-5-105), значительно более дешевая и доступная из-за упрощенного технологического процесса выделения. Учеными ТИНРО-Центра совместно с сотрудниками НПО «Биолар» (Латвия) разработан способ получения препарата ДНК, разрешенного к применению как биологически активная добавка к пище для лечения и профилактики ряда заболеваний и для повышения умственной и физической работоспособности, который включает две стадии - экстракцию и осаждение препарата. Содержание нуклеиновых кислот в препарате достигает 70-80%, молекулярная масса 270-500 кДа. Препарат растворим в воде при нагревании и не растворим в органических растворителях (109).
Известны способы получения нуклеиновых кислот из биомассы микробных клеток, заключающиеся в выращивании максимального количества биомассы, полного разрушения бактериальных клеток с последующим отделением нуклеиновых кислот от белков, полисахаридов и других клеточных элементов (145, 148, 149, 150, 151, 152,156).
Для получения ДНК, пригодной для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР), используют разделение компонентов предварительно разрушенных бактериальных клеток электрофорезом, в результате чего удается очистить ДНК от примесей, способных ингибировать реакцию (153, 154, 155).
Дрожжи и мицеллярные грибы широко распространены в природе и имеют большое практическое значение. В настоящее время для исследования биологии, генетики и эволюции этих организмов привлекаются современные молекулярно-генетические методы. Одним из таких методов является поли-меразная цепная реакция (ПЦР).
При постановке ПЦР необходимо иметь в наличии в достаточном количестве ДНК с минимальным содержанием белков и других примесей. Основная проблема при выделении ДНК из грибного материала - как наиболее эффективно разрушить их клеточные стенки, для того чтобы с максимальным выходом экстрагировать ДНК. Как известно, дрожжи и мицеллярные грибы обладают прочной клеточной стенкой, которая устойчива к действию большинства литических агентов, выдерживает обработку растворами детергентов, щелочей и солей-хаотропов.
Известны следующие традиционные методы разрушения дрожжевых клеток и грибного мицелия при выделении ДНК: интенсивное встряхивание со стеклянными щариками, размалывание с помощью ступки и пестика, механическая гомогенизация, ультразвуковая обработка, обработка литическими ферментами, использование пресса Френча (435, 436).
Известен также метод экстракции ДНК из дрожжей и мицеллярных грибов путем прогрева клеток (мицелия) при 65С в буфере с 3% SDS с последующей депротеинизацией ДНК смесью фенола с хлороформом (437).
Другой подход для приготовления ДНК из дрожжей и мицелиальных грибов для ПЦР-амплификации основан на получении из этих микроорганизмов неразрушенных клеточных оболочек, содержащих ДНК и частично РНК. Такие ДНК-содержащие препараты легко приготовить путем экстрагирования из клеток белков, липидов и других низкомолекулярных компонентов буферными растворами, содержащими соли-хаотропы (244).
Описан способ получения дезоксиробонуклеиновых кислот, включающий адсорбцию дезоксирибонуклеиновых кислот на силикатном сорбенте в присутствии хаотропного агента, отделение и промывку сорбента с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента (158).
Известен также способ получения нуклеопротеинового комплекса из рыбных молок с использованием этапов термообработки измельченного исходного сырья в растворе хлорида натрия, отделение экстракта ДНК от осадка, ультрафильтрацию с концентрированием экстракта, его сушку, обработку этанолом и окончательное высушивание. Выход ДНК по этому способу составляет 4,5-6,0%, содержание ДНК в препарате - не менее 65%.
Методы исследований
Разработка промышленной технологии изготовления натуральных комбинированных препаратов на основе экстрактов бурых водорослей -ламинарии («Ламихит») и фукуса («Фукохит»), ассоциированных с природным полисахаридом хитозаном.
В последнее время в косметической промышленности все более широкое применение находят морские водоросли.
Известно, что население стран Восточной Азии регулярно употребляет в пищу как дикорастущие, так и культивируемые морские водоросли. По-видимому, интерес к ним обусловлен не только пищевым фактором, но и интуитивной потребностью человека в водорослях для поддержания своего здоровья. Уже давно отмечено, что использование морских водорослей в питании приводит к омолаживающему воздействию на организм, усилению обменных процессов, а также к положительному эффекту при многих дерматологических заболеваниях.
Морские водоросли имеют неповторимый биохимический состав, который практически идентичен составу крови и плазмы человеческого организма. Они насыщены витаминами, микро- и макроэлементами, полисахаридами и аминокислотами в соотношениях, адекватных потребностям организма. Кроме того, морские водоросли содержат альгинаты и фукоиды, которые улучшают регенерацию соединительнотканных структур кожи, что и позволяет так широко использовать их в косметических целях.
Каковы факторы вредного воздействия на кожу? Это - замедление обменных процессов в клетках кожи, приводящее к ее старению, солнечное излучение и т.д. Чтобы вернуть коже способность нормально функционировать, необходимо применять препараты с биологически активными веществами, главным образом, витаминами С и Е.
В силу своего метаболизма морские водоросли содержат весь витаминный спектр (90). Они характеризуются необычайно высоким содержанием витаминов С и Е (91). Многочисленные научные исследования доказали, что витамин С влияет на синтез гиалуроновой кислоты, отвечающей за построе no ниє основного вещества дермы. Некоторые исследователи считают, что витамин С также предотвращает процесс пигментации. Кроме того, он дополняет действие витамина Е и стимулирует производство коллагена в соединительной ткани. А витамин Е, в свою очередь, активно тормозит окислительные процессы в организме, способствует увлажнению кожи, препятствует образованию морщин и возрастных пигментных пятен. Он обладает свойством защищать кожу от ультрафиолетовых лучей, облегчает последствия солнечных ожогов, повышает активность ферментов кожи.
Биохимический состав морских водорослей меняется в зависимости от места обитания и времени года, при этом последний фактор наиболее значительный. Приближение зимнего периода вынуждает их синтезировать ряд запасных веществ: маннит и его производные, ламинарии, альгинаты и т.д., поэтому наиболее оптимальным периодом для сбора водорослей является октябрь-ноябрь. Именно в этот период идет добыча сырья.
В последнее время препараты из морских водорослей включают в рецептуру косметической продукции (кремов, шампуней, лосьонов и др.), в составе которой они оказывают сильное антиоксидантное действие, способствуют увлажнению кожи за счет стимуляции синтеза коллагена и гиалуроной кислоты, вследствие чего замедляется образование морщин и пигментных пятен. Кроме того, они обладают антицеллюлитным действием, защищают кожу от УФ-лучей, облегчают последствия солнечных ожогов.
По мере повышения интереса производителей и потребителей косметической продукции к уникальным свойствам морских водорослей расширяется ассортимент производимого из них косметического сырья. Наряду с жидкими формами (пропиленгликолевые и другие экстракты) появляются и сухие формы препарата, отличающиеся от жидких более длительными сроками хранения, удобствами применения и транспортировки.
Нами разработана промышленная технология изготовления натуральных комбинированных препаратов на основе экстрактов бурых водорослей - ламинарии («Ламихит») и фукуса («Фукохит»), ассоциированных с природным
Ill полисахаридом хитозаном. Препараты отличаются значительно более высокой биологической активностью благодаря синергизму компонентов, входящих в их состав. Они обладают не только свойствами хитозана повышать влагоудерживающие свойства кожи и формировать защитную пленку на поверхности волос и кожи, но и содержат мощный биологически активный комплекс, включающий аминокислоты, в том числе незаменимые, и йодами-нокислоты ( моно- и дийодтирозин, дийодтиронин и др.), водорастворимые белки, полисахариды, ненасыщенные жирные кислоты, макро- и микроэлементы, причем в более высоких, чем у наземных растений, концентрациях, комплекс витаминов ( Вь В2, Bi2,A, Е, С и др.), хлорофилл, каротиноиды, растительные стеарины и др.
Разработка промышленной технологии изготовления дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и практические аспекты ее применения
Аналогичные препараты, но с более дифференцированными областями применения, зарегистрировали фирмы из США, Франции, Германии, Китая, Нидерландов и других стран. Американские компании внедряют на российский рынок БАДы из хрящей и органов акулы, стимулирующие фитосоставы для спортсменов, препараты «комплексного ежедневного питания» и др. Франция сделала упор на антиоксиданты растительного происхождения, Норвегия тестировала различные варианты рыбьего жира, Германия - противоалкогольные таблетки, Нидерланды - антистрессовые препараты и т.д. Из числа зарегистрированных БАД доля российских составляет не более 40%, что свидетельствует об экспансии зарубежных производителей на российский рынок.
Публикации зарубежных и отечественных специалистов, а также материалы научных конференций на тему «Эффективность применения БАД в различных областях медицины» однозначно констатируют, что для населения планеты единственной альтернативой достижения оптимального пищевого баланса является использование БАД в различных вариациях. Хотя до сих пор специалистами не решены некоторые вопросы в отношении БАД, многие врачи-практики уже разрешили их для себя и своих пациентов. Они видят в этих средствах ряд преимуществ перед традиционными методами лечения, а именно: БАД обладают более мягким, многосторонним действием и, как правило, имеют очень ограниченный спектр противопоказаний. Профилактика многих заболеваний с помощью БАД дешевле и безопаснее, чем их лечение. Таким образом, осознание необходимости вести здоровый образ жизни, широкое внедрение БАД на основе естественных продуктов позволило существенно расширить адаптационные возможности человека в условиях нарастающего техногенного, эмоционального и экологического стресса.
Как известно, в настоящее время ожирение является одним из наиболее распростарененных заболеваний обмена веществ и остается серьезной социальной проблемой, поражая все более широкие слои населения экономически развитых стран. По данным эпидемиологического исследования, в городах России ожирением страдает 10-20% мужчин и 30-40% женщин трудоспособного возраста, а около 25% населения имеет избыточную массу тела. Несмотря на трудности как экономического, так и социального плана, количество тучных людей в нашей стране не только не уменьшается, но даже имеет тенденцию к росту. Ожирение является фактором риска таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, гиперлипопротеидемия, гипертоническая болезнь (ИБС, ГЛП, ГБ), сахарный диабет, желчнокаменная болезнь и др. Так, атеросклероз встречается у 52% больных ожирением, гипертоническая болезнь - у 60%, сахарный диабет - у 7-40%. Увеличение массы тела при ожирении сопровождается нейроэндокринными расстройствами и серьезными нарушениями липидного обмена с повышением синтеза холестерина и триглицеридов в печени, что приводит к развитию гиперлипопротеидемии с возрастанием уровня мочевой кислоты и инсулина в крови, снижением толерантности к углеводам и повышением резистентности жировой ткани к инсулину. В связи с этим предупреждение и лечение ожирения рассматривается как ключевое мероприятие в системе профилактики и лечения атеросклероза, ишемической болезни сердца, гипертонической болезни, сахарного диабета и других заболеваний.
В то же время регуляция аппетита и поддержание оптимальной массы тела является сложным процессом, на который оказывают влияние внутренние и внешние факторы. К первым относятся генетические, физиологические, метаболические, ко вторым - психосоциальные и факторы окружающей среды. Лишь у 5% больных ожирением избыточная масса тела детерминирована генетически, а у 95% - обусловлена особенностями питания.
Анализ динамики питания населения России свидетельствует об усугублении его дисбаланса. Характерно более высокое потребление энергоемких продуктов (мучных, кондитерских изделий, животных жиров), недостаточное потребление полноценных белковых продуктов, растительных масел, свежих овощей и фруктов, молочных продуктов. В связи с этим коррекция режима питания, приведение химического состава и энергетической ценности рациона в соответствие с потребностью организма в пищевых веществах и энергии является наиболее важным и физиологичным методом лечения и профилактики ожирения. С другой стороны, диетическая терапия больных ожирением является и средством предупреждения развития осложнений со стороны сер-десчно-сосудистой системы. Особое значение при этом имеет использование на фоне гипокалорийного рациона гиполипидемических биологически активных добавок к пище (БАД).
На экспериментальной базе ВНИТИБП-ЗАО «Биопрогресс» созданы участки по разработке и получению биологически активных веществ из сырья естественного происхождения. В настоящее время во ВНИТИБП - ЗАО «Биопрогресс» освоен промышленный выпуск разработанных во ВНИРО биологически активных добавок на основе хитозана - «ХитАН» и «Поли-хит». В Институте питания РАМН проведены их клинические испытания.
В контролируемых уловиях стационара Клиники лечебного питания Института питания РАМН проводилось наблюдение над 30 больными ожирением и сердечно-сосудистой патологией (ишемической болезнью сердца, гипо-липопротеидемией, гипертонической болезнью), среди которых было 9 мужчин и 21 женщина в возрасте от 30 до 63 лет. Больные контрольной группы (13 человек) в течение 3 недель получали редуцированную по калорийности гипонатриевую противоатеросклеротическую диету Ар. 17, пациентов опытной группы в течение такого же срока получали такую же диету с включением БАД «ХитАН».
