Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Химическая, фармакологическая и клиническая характеристика тритерпеновых гликозидов 13
1.2. Химическая, фармакологическая и клиническая характеристика флавоноидов 26
1.3. Специфические ферментные биотест-системы in vitro 40
Глава 2. Организация проведения экспериментов, объекты, материалы и методы исследования 59
2.1. Организация работы и планирование эксперимента 59
2.2. Объекты изучения и оборудование 61
2.3. Методы исследования 65
Глава 3. Результаты и их обсуждение 79
3.1. Отработка методических подходов и принципов биохимического тестирования 79
3.2. Изучение молекулярных механизмов действия тритерпеновых гликозидов с использованием специфических ферментных биотест-систем in vitro 83
3.2.1. Изучение адаптогенных, антиоксидантных, противомикробных свойств тритерпеновых гликозидов 83
3.2.2. Изучение иммуномодулирующих свойств тритерпеновых гликозидов 84
3.2.3. Изучение дофаминергических свойств тритерпеновых гликозидов 88
3.2.4. Изучение энергизирующих свойств тритерпеновых гликозидов 90
3.2.5. Изучение антитоксических свойств тритерпеновых гликозидов 91
3.3. Изучение молекулярных механизмов действия флавоноидов с использованием специфических ферментных биотест-систем in vitro 94
3.3.1. Изучение адаптогенных, антимикробных и антиоксидантных свойств флавоноидов 94
3.3.2. Изучение иммуномодулирующих свойств флавоноидов 95
3.3.3 Изучение дофаминергических свойств флавоноидов 97
3.3.4. Изучение энергизирующих свойств флавоноидов 98
3.3.5. Изучение антитоксических свойств флавоноидов 99
3.4. Сравнительное изучение биологической активности тритерпеновых гликозидов и флавоноидов с использованием специфических ферментных биотест-систем in vitro 102
3.4.1. Сравнительное изучение адаптогенных, антимикробных и антиоксидантных свойств тритерпеновых гликозидов и флавоноидов 102
3.4.2. Сравнительное изучение иммуномодулирующих свойств тритерпеновых гликозидов и флавоноидов 103
3.4.3. Сравнительное изучение дофаминергических свойств тритерпеновых гликозидов и флавоноидов 104
3.4.4. Сравнительное изучение энергизирующих свойств тритерпеновых гликозидов и флавоноидов 105
3.4.5. Сравнительное изучение антитоксических свойств тритерпеновых гликозидов и флавоноидов 106
Заключение 108
Выводы 111
Список литературы 113
Приложения 129
- Химическая, фармакологическая и клиническая характеристика флавоноидов
- Специфические ферментные биотест-системы in vitro
- Изучение иммуномодулирующих свойств тритерпеновых гликозидов
- Изучение антитоксических свойств флавоноидов
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время чрезвычайно актуальны биотехнологические разработки, позволяющие оптимизировать создание и производство новых лекарственных препаратов. Одной из задач современной биотехнологии является поиск новых методов и подходов для изучения механизмов действия лекарственных препаратов на организм, а также поиск новых веществ, обладающих биологической активностью. Перспективным направлением научных исследований является биотехнологическое изучение препаратов, созданных на основе растений.
Проведение такого рода исследований требует адекватного инструмента для оценки тонких механизмов действия этих объектов на молекулярном уровне. В качестве одного из таких инструментов исследования молекулярных механизмов действия биологически активных веществ (БАВ) мы предлагаем применение нанобиотехнологических подходов в условиях опытов in vitro, к которым можно отнести разработанные в ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии специфические ферментные биотест-системы - нанобиотехнологические модели, позволяющие на молекулярном уровне избирательно выявлять корреляты фармакологической активности.
Применение специфических ферментных биотест-систем in vitro в первую очередь направлено на определение эффективности воздействия исследуемых веществ на ключевые регуляторные процессы, поддерживающие гомеостаз организма. Использование такого инструмента позволяет расширить наши знания о существующих и потенциальных возможностях БАВ растительного происхождения, а также фитопрепаратов, созданных на их основе; целенаправленно проводить поиск новых биологических свойств фитообъектов с учетом понимания взаимодействия «структура – действие» на молекулярном уровне.
Для России с ее богатейшими растительными ресурсами, где к медицинскому применению разрешено более 200 видов растительного сырья, характерен широкий масштаб производства фитопрепаратов, которые составляют около 40% номенклатуры лекарственных средств, выпускаемых в нашей стране (Уминский А.А. и соавт., 2007). Как правило, в состав действующих веществ фитопрепаратов входят представители таких широко распространенных в растительном мире классов химических соединений, как тритерпеновые гликозиды и флавоноиды. Эти соединения хорошо изучены, обладают, как правило, высокой биологической активностью различной направленности и низкой токсичностью, что дает основание рассматривать их в качестве веществ, перспективных для создания высокоэффективных полифункциональных лекарственных препаратов. Поэтому в рамках данной диссертационной работы мы применяли разработанный биотехнологический подход для исследования молекулярных механизмов действия БАВ растительного происхождения на примере тритерпеновых гликозидов и флавоноидов, зависимости биологической активности веществ от характеристики их углеводной составляющей и строения агликона.
Известно, что тритерпеновые гликозиды обладают нейротропными, адаптогенными, антимикробными, иммуномодулирующими, противоопухолевыми, противовоспалительными, гепатопротекторными и др. свойствами (George F. et al., 2002). Благодаря широкому спектру биологической активности и низкой токсичности в медицинской практике применяется большое число лекарственных средств и биологически активных добавок (БАД), созданных на основе тритерпеновых гликозидов: Глицерам, Ликвиритон, Флакарбин, Эскузан, Аэсцин, Патримин, Гербион Женьшень, Геримакс и др. Не менее популярны и флавоноидные гликозиды, которые обладают антиоксидантными, противовоспалительными, капилляроукрепляющими, желчегонными, противолучевыми, иммуномодулирующими и другими свойствами (Уминский А.А. и соавт., 2007). Являясь малотоксичными, лекарственные средства, имеющие в своем составе флавоноиды, проявляют высокую эффективность и широко применяются в медицине. Так, при лечении нарушений мозгового кровообращения с успехом используют препараты, содержащие флавоноидный экстракт из листьев Гинкго Билоба (Милопольская И.М., 2001), в качестве антиоксиданта, ангиопротектора и препарата с противовоспалительным действием – Диквертин, как кардиопротекторное средство – Корвитин, для укрепления сосудов – Аскорутин - комбинированный препарат, обладающий антиоксидантными свойствами и способностью депонировать аскорбиновую кислоту в тканях. Показан ингибирующий эффект кверцетина на рост меланомы и образование метастазов (Cook N. C. et al., 1996).
Вместе с тем, как свидетельствует анализ литературы, до сих пор систематического изучения молекулярных механизмов действия тритерпеновых гликозидов и флавоноидов не проводилось. Это связано со сложной структурой молекулы тритерпеновых гликозидов и флавоноидов, недостаточной изученностью характера их воздействия на органы, ткани и другие мишени в организме; в процессе изучения таких фитообъектов исследователи сталкиваются с проблемой их биодоступности и прохождения через биологические мембраны, испытывают затруднения в определении вектора биологического воздействия. В настоящее время появились публикации, посвященные определению взаимосвязи между строением углеводного остатка в молекуле некоторых гликозидов и их биологической активностью (Cook N. C. et al., 1996; George F. et al., 2002), что весьма актуально.
Учитывая вышеизложенное, исследование молекулярных механизмов действия биологически активных веществ на примере тритерпеновых и флавоноидных гликозидов представляет значительный теоретический и практический интерес.
Цель работы
Системное изучение молекулярных механизмов действия фитопрепаратов и фитообъектов, содержащих тритерпеновые гликозиды и флавоноиды, с применением биотехнологических методов тестирования в условиях опытов in vitro, основанных на специфических ферментных биотест-системах, и исследование зависимости их биологической активности от строения углеводного остатка и агликона.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать методические биотехнологические подходы и принципы биохимического тестирования для выявления веществ, обладающих адаптогенными, антиоксидантными, антимикробными, иммуномодулирующими, дофаминергическими, антитоксическими и энергизирующими свойствами.
2. Изучить молекулярные механизмы действия индивидуальных тритерпеновых гликозидов: биколорозида А и В (БКА, БКВ) из качима двуцветного (Gypsophila bicolor), патринозида Д из патринии средней (Patrinia Intermedia), а также сухих экстрактов корней женьшеня (Panax ginseng), содержащих сумму тритерпеновых гликозидов – панаксозидов.
3. Изучить молекулярные механизмы действия индивидуальных флавоноидов: кверцетина, дигидрокверцетина, рутина, а также флавоноидной фракции из Гинкго Билоба (Ginkgo biloba).
4. Исследовать роль строения углеводной составляющей и/или генина в молекулах тритерпеновых гликозидов для проявления их фармакологической активности.
5. Исследовать роль строения углеводного остатка и/или агликона в молекулах флавоноидов для проявления их фармакологической активности.
6. Разработать методические рекомендации для выполнения биохимических исследований с применением специфических ферментных биотест-систем с целью выявления дофаминергических, энергизирующих и венотонизирующих свойств у изучаемого объекта.
Научная новизна
-
Впервые в одном исследовании изучены молекулярные механизмы действия тритерпеновых гликозидов и флавоноидов, а также некоторых растительных экстрактов, перспективных для создания на их основе новых оригинальных фитопрепаратов, с применением биотехнологических подходов, используя в качестве тест-объектов ключевые ферменты гомеостаза.
-
Впервые установлено, что гликозиды, имеющие различия в строении агликона и/или углеводного остатка, оказывают прямое, неодинаковое влияние на скорость ферментативных реакций, различаясь по знаку и выраженности проявляемого эффекта.
-
Доказано, что от строения углеводной части тритерпеновых гликозидов зависит их влияние на активность ключевых ферментов иммунной и антиоксидантной систем - НАДФН-оксидазы, каталазы и глутатионредуктазы, различающееся по степени выраженности эффекта.
-
Показано, что тритерпеновые гликозиды и флавоноиды обладают различным сродством к тирозингидроксилазе, что также может определять характер их фармакологической активности.
-
Установлена энергизирующая активность исследуемых соединений, а также количественно и качественно различное действие на ферменты биотрансформации и детоксикации – цитохром Р450 и глутатионтрансферазу.
Практическая значимость работы
Настоящая работа является частью комплексных научных исследований, проводимых в отделе экспериментальной и клинической фармакологии (руководитель – д.м.н. В.К.Колхир) ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии) (директор – академик РАМН и РАСХН В.А. Быков) по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2011 гг.», задание 04.13. - разработка технологии производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья.
Благодаря результатам биотехнологического изучения молекулярных механизмов действия тритерпеновых гликозидов и флавоноидов с применением специфических ферментных биотест-систем в опытах in vitro, установлены направления расширенного фармакологического изучения тритерпен- и флавоноидсодержащих фитообъектов.
Предложенные и усовершенствованные в работе специфические ферментные биотест-системы in vitro могут использоваться не только для изучения молекулярных механизмов действия БАВ и выявления сходства и различия в фармакологической активности между близкими по структуре соединениями, но и в качестве экспресс-тестов при первичном скрининге БАВ с целью выбора перспективных объектов для углубленного изучения и разработки оригинальных лекарственных препаратов.
Подготовлены и утверждены на секции по поиску БАВ, технологии получения лекарств, фармацевтической химии, фармакогнозии Ученого совета (ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии) методики определения дофаминергических, энергизирующих и венотонизирующих свойств изучаемых фитообъектов.
Внедрение полученных результатов в практику
Алгоритм изучения новых БАВ с использованием биотехнологических приемов в условиях опытов in vitro одобрен на заседании секции по поиску БАВ, технологии получения лекарств, фармацевтической химии, фармакогнозии Ученого Совета (ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии) и реализуется в отделе экспериментальной и клинической фармакологии Центра медицины ВИЛАР при проведении научно исследовательской работы по поиску и разработке фитопрепаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Изучение молекулярных механизмов действия фитообъектов, содержащих тритерпеновые гликозиды и флавоноиды, возможно с применением биотехнологического подхода, включающего специфические ферментные биотест-системы in vitro, где в качестве тест-объектов используются ключевые ферменты гомеостаза.
2. Специфическая фармакологическая активность тритерпеновых гликозидов и флавоноидов изменяется в зависимости от химической характеристики их углеводной составляющей и строения их агликона.
3. Применение биотехнологических подходов (специфических ферментных биотест-систем in vitro) позволяет выявить сходства и различия в молекулярных механизмах действия тритерпеновых гликозидов, в том числе различающихся на одну молекулу глюкозы в гликозидной части, и объяснить различия в их биологической активности.
4. Флавоноиды, различающиеся между собой строением агликона и/или наличием гликозидного остатка, оказывают непосредственное неодинаковое влияние на скорость глутатионредуктазной, каталазной, НАДФН-оксидазной, тирозингидроксилазной, пируваткиназной реакций, а также реакций с участием ферментов биотрансформации и детоксикации - цитохрома Р450 и глутатионтрансферазы, различаясь по знаку и выраженности проявляемого эффекта, что отражается в различиях спектров их фармакологического действия.
Личное участие автора являлось основополагающим на всех этапах работы и состояло в постановке цели исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов при выполнении эксперимента и обобщении полученных результатов.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на второй научно-практической конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России», приуроченной к 25-летию организации кафедры клинической фармакологии ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 7-8 сентября 2009) и (Москва, 12-16 марта 2010), на секции «Современная фитофармакология и фитотерапия»
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 работ, в том числе в научных изданиях, входящих в перечень ВАК по теме диссертационной работы, 3 статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 131 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 20 рисунков. Список литературы содержит 155 наименований, из которых 77 на иностранных языках.
Химическая, фармакологическая и клиническая характеристика флавоноидов
Все природные флавоноиды являются О-гетероциклическими соединениями, структурную основу которых составляет трициклическая молекула флавона или флавина, состоящая из двух бензольных колец, обозначаемых А и В, соединенных Сз-фрагментом, который вместе с кислородным атомом образует у-пироновое кольцо (рис. 4). Также иногда в молекуле флавоноида присутствуют сахара более чем в одном положении, а также гликозилирование флавоноидной молекулы ди- или три-сахаридами.
Также иногда в растительных экстрактах обнаруживают свободные флавоноиды (агликоны). Флавоноиды характеризуются числом и положением заместителей в ароматических кольцах. Обычно этими заместителями являются ОН-группы, которые могут быть метилированными или гликозилированными [1].
Сообщений о присутствии флавоноидов у животных очень мало. Флавоноиды и флавонолы обнаруживаются у личинок и взрослых особей отряда Lepidopfera, особенно у белых и кремовых бабочек. Эти соединения насекомые, вероятно, получают из растений, которыми они питаются. Флавоноиды и флавоноидоподобные соединения были идентифицированы в тканях виноградной улитки Helix pomatia (флавон), у морского гидроида Serturella и пресноводного жука-плавунца Dytiscuss (аурон) [51].
Флавоноиды являются почти исключительно пигментами высших растений. Они могут синтезироваться и накапливаться во всех растительных тканях - в листьях, древесине, корнях, плодах, семенах и во всех частях цветков, главным образом в лепестках. Природные гликозиды растворимы в воде и обнаруживаются обычно в клеточном соке или в вакуолях.
Одним из самых заметных с точки зрения медицины и наиболее полезных свойств флавоноидов является их способность утилизировать свободные радикалы [53]. Флавоноиды обеспечивают защиту от свободных радикалов благодаря их утилизирующей способности (рис. 5). .
В настоящее время еще нет какого-либо единого стандартизованного метода оценки антиоксидантной активности биообъектов: существует большое разнообразие используемых моделей окисления, выбора инициирующих реагентов, способов измерения результатов эксперимента [54].
В условиях in vitro была изучена антирадикальная способность большого числа флавоноидных соединений разнообразного строения и установлены основные закономерности во взаимосвязи «структура - антирадикальная активность» [55].
Способность уменьшать проницаемость сосудистой стенки было первым свойством, обнаруженным у флавоноидов, благодаря которому они получили свое первоначальное название - Р-витаминные средства. Капилляропротекторное действие флавоноидов рассматривается как компонент их противовоспалительной активности [73]. Наличие этого эффекта обеспечивает способность биофлавоноидов уменьшать экссудативную фазу воспалительной реакции. В качестве капиляропротекторных средств флавоноиды часто применяют совместно с их синергистом по данному виду активности - аскорбиновой кислотой [54]. Некоторые флавоноиды стимулируют макрофаги; останавливают дальнейшую выработку эйкозаноидов, некоторые из которых выделяют вызывающие боль пептиды, например, вещество Р и брадикинин, и уничтожают избыточные оксиданты. Таким образом, они поддерживают восстановление нормального состояния в воспаленной ткани.
Флавоноиды легко невозвратно окисляются в п-гидрохинон, который в ходе обратимой реакции далее окисляется до п-хинона. Окисление флавоноидов катализируется ионами тяжелых металлов и светом.
Многие ферменты ингибируются флавоноидами. Они включают в себя гидролазы, оксидоредуктазы, ДНК-синтетазы, РНК-полимеразы, фосфотазы, протеин-фосфокиназы, оксигеназы и оксидазы аминокислот. В некоторых случаях тип ингибирования является конкурентным, но чаще всего оно бывает аллостерическим [1, 56, 57].
Среди гидролаз, которые ингибируются флавоноидами, наиболее яркой является гиалуронидаза из-за ее важности для целостности рыхлой волокнистой соединительной ткани [1]. Важным подклассом гидролаз, которые ингибируются флавоноидами, являются фосфолипазы [58, 59]. Эти ферменты расщепляют диэфирные фосфатные связи в биологических мембранах. Цикло-аденоизинмонофосфат-диэстераза также ингибируется флавоноидами, тип ингибирования - неконкурирующий [1]. Среди гидролаз, которые ингибируются флавоноидами, фосфатазы представляют собой широкую и важную группу [60]. Эта группа включает щелочные и кислотные фосфатазы, также пирофосфатазы. Молекулярная основа ингибирования еще неизвестна, но вполне может вовлекать в себя операцию связывания флавоноидов с атомом металла.
Фосфопротеидфосфатазы представляют собой особый случай. Эти ферменты, которые регулируют сигнальные цепи и клеточные циклические белки, могут стать активируемыми флавоноидами или ингибироваться ими в зависимости от системы [61]. Наиболее важные подклассы этих ферментов те, которые специфичны к фосфатам тирозина и серин/треонина.
Большинство биологических процессов с переносом электронов требует коферментов нуклеотидного типа, хотя каталитическая функция локализована в ароматической части, которая обычно связана с нуклеотидом диэфирфосфатной связью. Так как флавоноиды структурно схожи как с нуклеотидами, так и с ароматическими катализаторами окисления/восстановления, они в некоторых случаях конкурируют с этим нуклеотидом за его сайт связывания на ферменте [1], в то время как в других случаях они непосредственно мешают переходному состоянию, например, путем перехвата посредника свободного радикала.
Известно, что некоторые флавоноиды ингибируют изомеразы. Так например кверцетин ингибирует ДНК-топоизомеразу II [62, 63].
Были проведены исследования по изучению специфической активации цитотоксического и природных Т-лимфоцитов-киллеров (NK-Ly, Т8) флавоноидами [64, 65]. Однако неизвестны простые механизмы, которые могут объяснить это явление (при этом считают, что оно вызвано ингибированием циклооксигеназы, так как простагландины могут подавлять Т-лимфоцты). Showell и соавторы [66] сообщили об ингибирующем эффекте кверцетина и других соединений на секрецию лизосом, метаболизм арахидоновой кислоты и потоки Са2+ в нейтрофилах кролика. Флавоноиды игибируют активность интерлейкина-5, которая в значительной степени хемотаксическая [1].
Некоторые иммунные клетки вырабатывают различные формы интерферонов (IFN): IFN-a в форме Т-лимфоцитов, тогда как макрофаги и гранулоциты синтезируют IFN-p. Было представлено подтверждение этого, свидетельствующее о том, что многие флавоноиды стимулируют выработку IFN[1]. Широкий спектр фармакологического действия флавоноидов наряду со многими другими видами активности включает в себя противовоспалительный и противоаллергический эффекты. Полагают, что механизм противовоспалительного действия флавоноидов определяется целым рядом присущих им эффектов [67, 68]:
- уменьшением проницаемости капилляров, что приводит к торможению экссудативной фазы воспаления;
- ингибирующим влиянием на многие ферментные системы, участвующие в реализации процессов воспаления и аллергии;
- уменьшением высвобождения гистамина и других медиаторов воспаления из тучных клеток и базофилов;
- ограничением тканевых эффектов кининов, противовоспалительных простагландинов.
Специфические ферментные биотест-системы in vitro
Биохимическое тестирование in vitro в качестве первого этапа скрининга биологически активных веществ применяется ведущими западными фармацевтическими компаниями много лет, так как это позволяет, при адекватном выборе тест-объектов, повысить эффективность и экономичность направленного поиска искомой фармакологической активности. Каждая фирма имеет свою программу в соответствии со своими задачами.
Специфические ферментные биотест-системы разрабатываются для направленного выявления БАВ с целевой фармакологической активностью in vitro [113]. Они применяются для определения молекулярного механизма действия объектов, для первичного скрининга, для оценки качества растительного сырья и готовых лекарственных форм по их биологическому действию, для определения характера зависимости эффекта препарата от дозы, для оптимизации способа извлечения целевых БАВ из лекарственного растительного сырья и поиска маркеров для стандартизации.
Создание специфических ферментных тест-систем в ГНУ ВИЛАР базируется на фундаментальных представлениях фармакологии и биохимии, прежде всего - на представлениях о специфических фармакофорах, присущих каждой фармакологической группе БАВ, комплиментарных структуре соответствующего рецептора и определяющих вид фармакологической активности [113, 114]. Фармакофоры БАВ избирательно взаимодействуют с соответствующими мишенями, в качестве которых чаще всего выступают лимитирующие ферменты, играющие важную роль в биохимических процессах. Лимитирующие ферменты очень быстро реагируют на изменения внешней среды изменением своей активности.
Нами для тестирования были выбраны следующие ферментные биотест-системы in vitro: ГР в сочетании с КАТ применяли для выявления адаптогенных, антиоксидантных и противомикробных свойств, НАДФН-оксидазную - иммуномодулирующих свойств, ТГ - дофаминэргических свойств, ПК — энергизирующих свойств и цит Р450 в сочетании с ГТФ -детоксицирующих свойств. Выбранные нами ферментные тест-системы in vitro превосходят другие способы скрининга по информативности и быстроте выполнения, а также очень удобны для определения молекулярных механизмов действия, и определения связи «структура-действие» для БАВ.
Фермент глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2) является гомодимерным флавопротеидом с молекулярной массой 100-200 кДа. Каждая из субъединиц состоит из 460-480 аминокислотных остатков и нековалентно связывает ФАД (флавинадениндинуклеотид). ГР - первый флавопротеидный энзим, структура которого была расшифрована благодаря рентгеноструктурному анализу [114].
Каждая субъединица на N-конце имеет 18 подвижных аминокислот, остальные организованы в 4 домена: НАДФН-связывающий, ФАД-связывающий, центральный и промежуточный [115]. В ГР эритроцитов человека и свиньи по 15% структуры организовано в виде альфа-спиралей и бета-структур. В составе субъединицы имеются 6 SH-групп, большинство из которых участвует в соединении субъединиц [115]. ГР высоко неспецифична к своим субстратам, поэтому накопление GS-SG всегда вызывает его активное восстановление ГР [ 115].
У млекопитающих ГР обнаружена во всех тканях [116]. Наиболее высока активность ГР в почках, затем следуют тонкая кишка, печень, эндокринные железы, легкие, жировая ткань, головной мозг; самая низкая активность обнаружена в плаценте человека. В клетке фермент, в основном, локализован в цитозоле; может связываться с мембранами; в митохондриях, ядрах, микросомах он находится в мембраносвязаном состоянии [117].
ГР катализирует восстановление окисленного глутатиона дисульфида (GSSG) в восстановленную форму глутатион-тиол (GSH). Донором протонов является НАДФН, к которому ГР проявляет высокую специфичность [115]. Эту реакцию можно представить в следующем виде:
GSSH + НАДФН+JT- 2GSH + НАДФ+; Продукт глутатионредуктазной реакции, GSH, эндогенный антиоксидант, играет важную роль в обеспечении защиты SH-белков, прежде всего тиоловых ферментов, занимающих ключевые позиции в обмене тканевого дыхания [115]: ферментов тканевого дыхания, гликолиза, биосинтеза нейротрансмиттеров, сократительных белков. GSH участвует также в защите от пероксидации внутриклеточных мембранных структур, являясь косубстратом глутатионпероксидазы.
Глутатионредуктазная реакция является лимитирующим звеном восстановленного внутриклеточного глутатионового цикла, играющего исключительно важную роль в защите белков, нуклеиновых кислот, липидов, внутриклеточных мембран от окислительного стресса. ГР необходима для поддержания высокого внутриклеточного соотношения GSH/GSSG (с константой равновесия 5-Ю6 М) [118], исполняющего регуляторную роль в контрольных механизмах процессов жизнедеятельности клетки. Восстановительный глутатионовый цикл имеется во всех клетках аэробных организмов и служит защитой от окислительного стресса не только у животных и человека, но также у высших растений и микроорганизмов [115].
Активность ГР ингибируется НАДФ и GSH, продуктами реакции, которые конкурентные соответствующим субстратам и неконкурентны друг к другу. В клетке реакция далека от термодинамического равновесия [119]. Известно, что острый стресс и различные заболевания, сопровождающиеся комплексом биохимических изменений, а именно увеличением окислительно-восстановительных процессов, могут повышать активность ГР [120]. Исходя из масштабности влияния ГР на важные процессы жизнедеятельности организма, этот фермент является одним из ключевых для регуляции системы гомеостаза, поэтому он был выбран в качестве тест-объекта.
В ГНУ ВИЛАР была разработана ферментная глутатионредуктазная биотест-система in vitro [122, 123, 124]. Было доказано, что при добавлении веществ, обладающих адаптогенными и антиоксидантными свойствами, ГР активируется. При наличии противомикробных свойств наблюдается угнетение ГР. Адаптогены, в отличие от БАВ группы антиоксидантов, обладают противомикробными свойствами. Поэтому тестирование веществ in vitro с помощью ГР в сочетании с КАТ реакцией позволяет избирательно выявить адаптогены, характерным свойством которых является активация ГР и угнетение КАТ. Антиоксиданты повышают скорость ГР реакции, но не угнетают скорость каталазной реакции. Данная методика отличается высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, более высокой динамичностью и меньшей трудоемкостью, чем известные методики [122, 123, 124]. Различить адаптогенные, антиоксидантные и противомикробные свойства позволяет каталазная биотест-система in vitro.
Изучение иммуномодулирующих свойств тритерпеновых гликозидов
Результаты определения прямого влияния изучавшихся тритерпеновых гликозидов на скорость НАДФН-оксидазной реакции in vitro представлены в табл. 10.
В спокойных (не стимулированных) лейкоцитах НАДФН-оксидаза не активна [155]. При добавлении к гомогенату спокойных лейкоцитов иммуномодулятора, НАДФН-оксидаза активируется. Для сравнительной количественной оценки величины непосредственного активирующего влияния изучаемых соединений на скорость НАДФН-оксидазной реакции in vitro, соотносили скорости реакций, полученные в упомянутых пробах, со скоростью НАДФН-оксидазной реакции в пробе, содержавшей известный природный иммуноактиватор протимозин-а (кислый белок, выделенный из тимуса крысы), принимая ее за 100%. Концентрация протимозина-а составляла 1 мкг/мл пробы.
Как видно из табл. 10, в контрольной пробе, не содержащей БАВ, скорость НАДФН-оксидазной реакции была равна 0. При добавлении в пробу, к гомогенату спокойных лейкоцитов, протимозина-а наблюдали активацию НАДФН-оксидазы: НАДФН окислялся со скоростью 26,7 нмоль/мин на 10 мкл гомогената, что принимали за 100%. При добавлении женьшеня корня экстракта сухого, полученного на 30% спирте, в пробу также происходила активация НАДФН-оксидазы. При этом НАДФН окислялся со скоростью 23,2 нмоль/мин на 10 мкл гомогената, что составляет 87% от эффекта протимозина-а. БКА и БКВ также активировали фермент, но их эффекты оказались количественно неодинаковыми: БКА увеличивает скорость реакции на 39% от эффекта протимозина-а, а БКВ - на 69%. Патринозид Д и женьшеня корня экстракт сухой, полученный на 50% спирте, также увеличивали скорость НАДФН-оксидазной реакции in vitro. Таким образом, в НАДФН-оксидазном тесте установлены количественные различия БКА и БКВ по их влиянию на активность НАДФН-оксидазной реакции: активирующий эффект БКВ более выражен, чем эффект БКА. Точно такой же эффект наблюдали при сравнении иммуномодулирующей активности двух экстрактов женьшеня, которые количественно различаются по активирующему действию на ферментативную активность. В количественном различии непосредственного действия БКА и БКВ на скорость НАДФН-оксидазной реакции отражены различия в структуре БКА и БКВ, различающихся на одну молекулу глюкозы в 3-м положении. Иными словами, строение углеводной части тритерпеновых гликозидов играет важную роль во взаимодействии с ключевым ферментом иммунной системы. Вместе с тем непосредственное влияние БКА и БКВ на НАДФН-оксидазу качественно сходно с влиянием панаксозидов и патринозида Д, что свидетельствует о проявлении общих черт строения веществ, относящихся к химическому классу тритерпеновых гликозидов.
Для исследования роли строения углеводного остатка в молекулах тритерпеновых гликозидов для проявления их фармакологической активности определяли кинетические параметры НАДФН-оксидазной реакции в присутствии биколорозидов А и В, различающихся лишь на одну молекулу глюкозы в гликозидной части. В табл. 11 представлены кинетические параметры НАДФН-оксидазной реакции при добавлении изучавшихся веществ к гомогенату спокойных полиморфноядерных лейкоцитов. Для сравнения были взяты: известный природный активатор гуморального иммунитета протимозин-а и активатор терминальной стадии фагоцитоза -метилурацил.
Из табл. 11 видно, что в контрольной пробе скорость НАДФН-оксидазной реакции была равна 0. При добавлении в пробу, к гомогенту спокойных лейкоцитов, протимозина-а, природного активатора гуморального иммунитета, НАДФН окисляется со скоростью 26,7 мкмоль/мин на 10 мкл гомогената клеток. При добавлении метилурацила, активатора клеточного иммунитета, НАДФН-оксидаза активировалась меньше, скорость реакции составляла 0,26 мкмоль/мин на 10 мкл гомогената клеток. Было показано, что активирующее действие биколорозида-В было по своей величине ближе к эффекту протимозина-а, то есть активатора гуморального иммунитета. Биколорозид А проявил себя как активатор смешанного иммунитета. Таким образом, тритерпеновые гликозиды обладали сродством к НАДФН-оксидазе, однако, не проявляя общих черт как химических группа соединений.
Изучение антитоксических свойств флавоноидов
Результаты изучения прямого влияния флавоноидов на монооксигеназную активность (гидроксилазную и деметилазную) цит Р45о а также на конъюгирующую активность глутатионтрансферазы, представлены табл. 20.
Из табл. 20 видно, что из представленных биофлавоноидов наиболее выраженное активирующее влияние на монооксигеназную систему цит Р450 оказывал рутин. Скорость гидроксилирования в его присутствии увеличивалась в 2,2 раза, а скорость деметилирования - в 1,4 раза. Кверцетин и дигидрокверцетин умеренно увеличивали скорости реакций, катализируемых цит Р450- Учитывая то, что ЦИТР450 является ключевым ферментом 1-го этапа системы детоксикации - биотрансформации, можно полагать, что рутин, по сравнению с кверцетином и дигидрокверцетином, является веществом, ускоряющим метаболизм широкого круга соединений, подвергающихся превращению с участием цит Р45о- Флавоноидная фракция из листьев Гинкго Билоба оказывала активирующее влияние на скорость гидроксилирования, увеличивая ее в 1,5 раза, а скорость деметилирования - в 1,22 раза.
Влияние исследованных соединений на ключевой фермент 2-го этапа детоксикации - ГТФ также различается по увеличению скорости реакции. Так степень активации ГТФ уменьшается в ряду рутин дигидрокверцетин флавоноидная фракция из листьев Гинкго Билоба кверцетин.
Суммируя представленные в данной главе результаты можно заключить следующее: все изучавшиеся флавоноиды увеличивали скорость пируваткиназной, НАДФН-оксидазной, тирозингидроксилазной реакций, различаясь лишь по выраженности эффектов, что свидетельствует о проявлении черт строения, общих для флавоноидов как класса соединений.
С применением специфических ферментных биотест-систем, основанных на глутатионредутазе и каталазе, установлены различия в проявлении адаптогенных, антиоксидантных и антимикробных свойств у флавоноидов, различающихся по структуре и количеству глюкозных остатков.
