Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1.1. Комары как переносчики опасных заболеваний 9
1.1.1. Среда обитания и физиология развития комаров 10
1.2. Методы борьбы с комарами 12
1.3. Бактериальные средства борьбы с личинками комаров 14
1.4. Энтомопатогенные грибы как потенциальные агенты борьбы с личинками комаров 17
1.4.1. Энтомапатогенный гриб Tolypocladium cylindrosporum как агент биологического контроля личинок кровососущих комаров „18
1.4.2. Механизм патогенеза личинок кровососущих комаров
под действием гриба Tolypocladium cylindrosporum 19
1.4.3. Особенности культивирования гриба Т.cylindrosporum. Жизнеспособность клеток 20
1.5. Препаративные формы биологических препаратов 22
1.6. Иммобилизация микроорганизмов как способ повышения стабильности клеток микроорганизмов 23
1.7. Заключение 25
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 28
2.1. Объекты исследований 28
2.2. Питательные среды для культивирования 28
2.2.1. Питательные среды глубинного культивирования 28
2.2.2. Питательные среды для поверхностного культивирования 29
2.3. Культивирование бактерий и грибов 29
2.3.1. Приготовление инокулята 29
2.3.2. Глубинное культивирование бактерий и грибов 29
2.3.3. Культивирование бактерий и грибов на твердых питательных средах 30
2.4. Методы количественного учета и морфологического состояния культур микроорганизмов 30
2.4.1. Определение концентрации клеток микроорганизмов (КОЕ) высевом на плотные питательные среды (метод Коха) 30
2.4.2. Определение концентрации сухой биомассы микроорганизмов 31
2.4.3. Методы контроля морфологического состояния микроорганизмов 31
2.5. Иммобилизация клеток микроорганизмов в Са-альгинатном геле 32
2.6. Метод контроля концентрации клеток в Са-альгинатных гранулах 33
2.7. Культивирование иммобилизованных клеток во влажной камере 34
2.8. Определение протеолитической активности 34
2.9. Оценка ларвицидной активности микроорганизмов
в свободном и иммобилизованном состоянии 35
2.10. Характеристики реактивов 35
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 38
ЧАСТЬ 3.1. Энтомопатогенный гриб Tolypocladium cylindrosporum как агент биоконтроля численности личинок комаров 38
3.1.1. Отбор энтомопатогенного гриба с наибольшей ларвицидной активностью.. 38
3.1.2. Глубинное культивирование микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum 41
3.1.3. Глубинное культивирование Tolypocladium cylindrosporum на питательных средах с различными источниками углерода.
Оценка ларвицидной активности 44
3.1.4. Глубинное культивирование Tolypocladium cylindrosporum на питательных средах, содержащих н-алканы как источники углерода 49
3.1.5. Глубинное культивирование Tolypocladium cylindrosporum на питательных средах, растительные масла как источники углерода 49
3.1.6. Изучение механизма ларвицидной активности Tolypocladium cylindrosporum.52
3.1.7. Исследование ларвицидной активности Tolypocladium cylindrosporum на разных стадиях развития микроорганизма
при глубинном культивировании 56
3.2. Иммобилизация Tolypocladium cylindrosporum в Са-альгинатном геле 59
3.2.1. Обоснование выбора метода и носителя для иммобилизации 59
3.2.2. Исследование метаболизма Tolypocladium cylindrosporum альгината натрия и альгината кальция 60
3.2.3. Рїммобилизация Tolypocladium cylindrosporum в Са-альгинатном геле. Получение плавающих гранул. Оценка плавучести гранул 63
3.3. Оценка ларвицидной активности Tolypocladium cylindrosporum в иммобилизованном состоянии 66
3.4. Исследование ларвицидной активности при иммобилизации Tolypocladium cylindrosporum в Са-альгинатыне гранулы с различными субстратами 68
3.5. Кинетика и физиология роста Tolypocladium cylindrosporum из Са-альгинатных гранул. Физиология развития внутри гранулы 70
3.5.1. Рост Tolypocladium cylindrosporum из Са-альгинатных гранул 70
3.5.2. Кинетика и физиология роста микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum, иммобилизованного
в Са — альгинатном геле различной концентрации 76'
3.5.3. Кинетика и физиология роста микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum, иммобилизованного в Са — альгинатном геле с добавлением различных концентраций крахмала 78
3.5.4. Кинетика и физиология роста микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum, иммобилизованного в Са — альгинатном геле с добавлением подсолнечного масла и крахмала 79
3.5.5. Кинетика и физиология роста микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum, иммобилизованного в Са - альгинатном геле с добавлением подсолнечного масла 82
3.5.6. Кинетика и физиология роста микроскопического гриба Tolypocladium cylindrosporum, иммобилизованного в Са - альгинатном геле с добавлением различных масел 84
Bacillus thuringiensis var. israelensis как агент биоконтроля личинок комаров 88 Определение ларвицидной активности различных штаммов Bacillus thuringiensis var. israelensis. Выбор штамма 89
Глубинное культивирование Bacillus thuringiensis var. israelensis на жидкой питательной среде. Физиология развития микроорганизма. Кривая роста, изменения рН, протеолитическая активность 91
Рїммобилизация Bacillus thuringiensis var. israelensis в Са-альгинатном геле. Определение ларвицидной активности Bacillus thuringiensis var. israelensis в иммобилизованном состоянии 94
Иммобилизация Bacillus thuringiensis var. israelensis на различных стадиях развития с последующей оценкой ларвицидной активности 95
Исследование влияния Bacillus thuringiensis var. israelensis на рост и Развитие Tolypocladium cylindrosporum в свободном и иммобилизованном состоянии 99
Исследование влияния свободных клеток Bacillus thuringiensis var.israelensis нарост мицелия Tolypocladium cylindrosporum из гранулы 100
Исследование изменения в течение времени концентрации клеток Bacillus thuringiensis var. israelensis и Tolypocladium cylindrosporum, иммобилизованных в одной грануле 100
Исследование роста Tolypocladium cylindrosporum из гранул при иммобилизации отдельно и совместно с клетками культуры Bacillus thuringiensis var. israelensis 102
Создание препаративной формы биопрепарата для борьбы
с личинками комаров 104
Изучение влияния на личинки малярийных комаров различных соотношений гранул Т.cylindrosporum и В. thuringiensis var. israelensis 104
Определение эффективной дозы препарата 111
Изучение срока хранения иммобилизованного препарата для борьбы с личинками комаров 112
Проведение производственных испытаний 116
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 118
ВЫВОДЫ 119
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121
ПРИЛОЖЕНИЕ 1: Акты испытаний 134
ПРИЛОЖЕНИЕ 2: Научный отчет по изучению биологической активности 139
ПРИЛОЖЕНИЕ 3: Технические условия 150
- Комары как переносчики опасных заболеваний
- Объекты исследований
- Отбор энтомопатогенного гриба с наибольшей ларвицидной активностью..
Введение к работе
Актуальность работы. Кровососущие комары являются переносчиками таких опасных трансмиссивных заболеваний,как малярия, желтая лихорадка, японский энцефалит и др. Применение химических препаратов для борьбы с комарами не всегда оказывается эффективным, так как у насекомых быстро вырабатывается резистентность к таким препаратам, а это требует увеличения дозировок и постоянной ротации инсектицидов. Кроме того, не обладая избирательностью действия, химические инсектициды вызывают гибель полезных организмов, а накопление инсектицидов в природных экосистемах (воде, почве) определяет их экологическую опасность.
Для борьбы со взрослыми комарами альтернативы химическим препаратам на сегодняшний день нет. Однако, для уничтожения личинок комаров широко применяют биологические препараты, основным преимуществом которых является избирательность их действия.
Используемые на сегодняшний день биологические инсектициды, основанные на спорокристаллической биомассе бактерий Bacillus thuringiensis var. israel-ensis (Bti) или Bacillus sphaericus, представляют собой сухие порошки, пасты или жидкости. Данные бактерии обладают высокой специфической активностью по отношению к личинкам двукрылых насекомых, а препараты на основе Bti и В.sphaericus являются высокоэффективными инсектицидами. Однако, все используемые препаративные формы на основе бактерий обладают рядом существенных недостатков. Прежде всего, это непродолжительное остаточное действие: препараты действуют в течение нескольких дней после внесения в места выплода комаров - поверхность водоема - и быстро оседают на дно, что приводит к необходимости повторных обработок. При этом, доза препарата напрямую зависит от глубины водоема. Разработка биологического препарата для борьбы с личинками комаров, лишенного перечисленных выше недостатков, является актуальной задачей, решение которой позволит снизить экологическую нагрузку и экономические затраты.
Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилась разработка новой формы инсектицидного биологического препарата для борьбы с личинками комаров. Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:
Провести выбор среди грибных культур микроорганизм, обладающий наибольшей энтомопатогенной активностью в отношении личинок комаров.
Изучить свойства и динамику роста гриба, иммобилизованного в Са-альгинатном геле. Подобрать субстраты, которые метаболизируются грибом внутри гранулы и обеспечивают выход микроорганизма из гранулы в свободное состояние.
Исследовать динамику гибели личинок комаров под воздействием свободных и иммобилизованных в Са-альгинатные гранулы клеток грибов.
Оценить возможность иммобилизации бактерий Bacillus thuringiensis var. is-raelensis в Са-альгинатные гранулы с сохранением их свойств и ларвицид-
ной активности. Исследовать и сравнить динамику гибели личинок комаров под воздействием свободных и иммобилизованных клеток бактерий. 5. Провести испытания полученного инсектицидного препарата для борьбы с личинками комаров в реальных условиях. Научная новизна. Впервые разработан биопрепарат для борьбы с личинками комаров на основе иммобилизованных в Са-альгинатные гранулы микроорганизмов с одновременным добавлением субстрата, позволяющего увеличить длительность их ларвицидной активности.
Изучен механизм выхода клеток бактерий и грибов из иммобилизованного состояния в свободное и их воздействие на личинки комаров, что легло в основу создания препаративной формы.
Установлено, что одновременное применение иммобилизованных с субстратом клеток бактерий и грибов, обладающих ларвицидной активностью, способствует увеличению эффективности и длительности действия препарата.
Подобран ингредиент (подсолнечное масло), который одновременно выполняет внутри гранулы две функции: является компонентом, придающим гранулам свойство положительной плавучести и субстратом для роста и развития клеток из гранулы с последующим выходом в окружающую среду без изменения физиологических свойств.
Показано, что применение смеси гранул с различными микроорганизмами, обладающих положительной плавучестью, позволяет увеличить длительность ларвицидной активности препарата до нескольких месяцев.
Практическая значимость. Разработаны новый инсектицидный биологический препарат для борьбы с личинками комаров и технология его получения на основе смеси обладающих положительной плавучестью гранул с иммобилизованными в них бактериями или грибами. Определены основные режимы получения гранул, влияющие на характеристики препарата. Наработана и испытана партия нового инсектицидного препарата. Показано, что препарат обладает высокой эффективностью, а норма расхода препарата в результате его локализации на поверхности снижается на порядок по сравнению с уже используемыми биологическими инсе-кицидами.
Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21-26 мая, 2006г, г. Санкт-Петербург), на IV международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (12-16 марта, 2007г, г. Москва), Межрегиональном совещании по вопросам профилактики ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов (2008г, г. Протвино Московской области), V семинаре-совещании «Современные технологии и перспективы использования средств защиты растений, регуляторов роста, агрохимикатов в агроладшафтном земледелии» (2008г, г. Анапа), на V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (16-20 марта 2009г, г. Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в журналах ВАК 2 статьи.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах текста и включает рисунков и таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, содержащего ссылки, из которых на иностранных языках.
Комары как переносчики опасных заболеваний
Насекомые относятся к классу Insecta типа членистоногих Arthropoda. Наибольшее эпидемиологическое значение имеют представители отряда двукрылых (Diptera), блох (Siphonaptera), клопов (Hemiptera), вшей (Suphunculata). Комары относятся к семейству Culicidae. Наиболее распространенными являются роды Anopheles, Culex, Aedes, Culiseta, Mansonia и др [1].
В настоящее время в мире насчитывается приблизительно 2500 видов комаров, относящихся к 30 родам. На территории бывшего СССР их около 120 видов. Наибольшее разнообразие и численность кровососущих видов наблюдается в тропиках. В Центральной и Южной Америке обитает около 700 видов, примерно столько же в тропической Азии. В Африке, включая остров Мадагаскар, встречается около 500 видов. Таким образом, три четверти всех комаров обитают в тропиках и субтропиках. Из остальных около 400 видов населяют Австралию и острова Тихого океана. В северном регионе, состоящем из США, Канады, Гренландии, Европы и внетропической Азии, включая Японию, Северную Африку и Ближний Восток, насчитывается всего лишь около 260 видов комаров [2].
Кровососущие комары являются переносчиками многих болезней, выступая обычно в качестве одного из хозяев того или иного возбудителя. В большинстве случаев возбудители попадают в организм комаров с кровью при питании. Комары осуществляют передачу человеку четырех видов плазмодиев, трех видов филяриин и множества арбовирусов, среди которых наиболее значимыми являются возбудители малярии, желтой лихорадки, японского энцефалита, вирусы группы Денге [3].
Эпидемиологическое значение кровососущих комаров определяется многими биологическими и экологическими факторами, среди которых наиболее важными являются восприимчивость их к заражению, численность популяции, степень связи с человеком и его жилищем, активность и продолжительность жизни переносчика. Опасными переносчиками возбудителей болезней являются, как правило, виды комаров с большой численностью, питающиеся преимущественно на человеке и активные в течение длительного сезона (комары родов Anopheles, Culex, Aedes) [3].
Благодаря растущим экономическим и культурным связям между различными государствами мира, а так же изменение климата планеты делают вероятной возможность завоза и развития возбудителей заболеваний с комарами-переносчиками в страны, для которых те или иные заболевания не свойственны.
По данным Роспотребнадзора по г. Москве по состоянию на 2008г. на учете в управлении состоят 722 водоема общей площадью 1 тыс. 569 га, что составляет 63% от общего числа водоемов в городе. Из них личинки кровососущего комара живут в 541 водоеме (75%), в том числе - в 461 водоеме (63%) обитают переносчики малярии. В 2007 г. площадь обработок водной поверхности, по сравнению с 2006 г., выросла на 351 га; Всего за летний сезон было обработано 2 тыс. 133,3 га водной площади,,в том числе против личинок малярийного комара — 2 тыс. 9,5 га. За первое полугодие 2007 г. в Москве зарегистрировано 17 случаев заболевания малярией, что оказалось наибольшим показателем по стране. [4].
Объекты исследований
Для определения количественного учета микроорганизмов по методу Коха проводили высев заранее приготовленных последовательных разведений суспензии клеток на плотные питательные среды. Разведения готовили в стерильном физиологическом растворе с коэффициентом разведения 10.
Из последних трех последовательных разведений высевали по 0,1мл в чашки Петри на заранее приготовленные твердые питательные среды и распределяли стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Из каждого разведения проводили 3 повторности. После посева чашки Петри помещали в термостат крышками вниз.
Подсчет выросших колоний проводили через 48 часов для бактерий и через 10-14 дней для грибов. Количество клеток в 1 мл суспензии клеток вычисляли по формуле: где М- количество клеток в 1 мл; а - среднее число колоний, выросших после высева из данного разведения; V— объем суспензии, взятый для высева, мл; 10" - коэффициент разведения.
Определение концентрации сухой биомассы микроорганизмов Биомассу грибов определяли по массе сухого мицелия. Для этого из глубинной культуры гриба после тщательного перемешивания отбирали пипеткой 5 мл суспензии клеток. Отобранную суспензию клеток помещали в центрифужную пробирку и центрифугировали 10 мин при скорости 8000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость отделяли, а осадок помещали на бумажный фильтр, заранее высушенный и доведенный до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 80-85С в течение 1 часа. Бумажный фильтр с осадком высушивали в сушильном шкафу, при той же температуре, что и пустые фильтры, и взвешивали. Количество сухой биомассы определяли по формуле: (А-В)№0 V где М - сухая биомасса, г/л; А - масса фильтра с осадком, г; В - масса фильтра без осадка, г; V- объем культуральной жидкости, отобранный для центрифугирования, мл.
Методы контроля морфологического состояния микроорганизмов
Для определения морфо-физиологических характеристик микроорганизмов применяли препараты «раздавленная капля» и фиксированные окрашенные препараты.
Препарат «раздавленная капля» готовили по следующей методике. На предметное стекло наносили каплю дистиллированной воды, помещали в нее небольшое количество клеток микроорганизмов, размешивали и накрывали покровным стеклом.
Для приготовления фиксированного окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло помещали маленькую каплю водопроводной воды и помещали в нее микроорганизмы. Полученную суспензию равномерно размазывали петлей на площади 1-2 см и высушивали при комнатной температуре или над пламенем горелки. После этого микроорганизмы термически фиксировали и окрашивали фуксином.
Готовые препараты «раздавленная капля» и фиксированные окрашенные препараты применяли для контроля морфологического состояния культур микроорганизмов при световой микроскопии.
Иммобилизация клеток микроорганизмов в Са-альгинатном геле
Иммобилизацию микроорганизмов проводили с помощью специальной инжекторной установки. Заранее приготовленный раствор для иммобилизации продавливали с помощью перистальтического насоса через капилляр со скоростью 500 мл/ч, а в коаксиальную с ним трубку подавали поток воздуха со скоростью 2 10 3м3/ми. Поток воздуха срывал капли жидкой фазы с обреза капилляра. Отрывавшиеся капли попадали в 2%-й раствор хлорида кальция, где происходила их полимеризация с образованием микрогранул кальций - альгинатного геля, с заключенными внутри клетками микроорганизмов, размером 0,1 - 0,3 мм.
Раствор для иммобилизации готовили следующим образом: заранее приготовленный раствор альгината необходимой концентрации смешивали с выращенной глубинно суспензией клеток микроорганизмов и агентом для придания гранулам плавучести в соотношении 10:1:1. При проведении экспериментов с добавление субстрата в заранее подготовленный р-р альгината натрия непосредственно перед иммобилизацией дополнительно вносили предварительно подготовленный раствор субстрата.
Отбор энтомопатогенного гриба с наибольшей ларвицидной активностью
Для создания эффективного микробиологического препарата для контроля численности насекомых, в частности, личинок кровососущих комаров, необходимо выполнение, по крайней мере, нескольких условий:
1. Осуществить выбор штамма энтомопатогенного микроорганизма, обладающего высокой ларвицидной активностью.
2. Разработать на его основе препаративной формы, позволяющей достигнуть максимальной эффективности работы микроорганизма.
Существующие препараты на основе энтомопатогенных грибов являются малоэффективными в местах массового выплода личинок комаров. Особенности физиологии развития грибов не позволили создать на сегодняшний день препаративной формы, обладающей высокой эффективностью в борьбе с личинками комаров. Несмотря на это, инсектицидные препараты, полученные на основе
энтомопатогенных грибов, являются перспективными для борьбы с вредными насекомыми, так как могут вывести на качественно новый уровень проблему регулирования численности насекомых [84]. Это связано с тем, что грибы при благоприятных условиях способны размножаться на личинках комаров и быть источниками заражения новых. А это, в свою очередь, может привести к возникновению эпизоотии.
Начальным этапом работы по созданию биологического инсектицида был выбор штамма гриба, обладающего максимальной специфической ларвицидной активностью в отношении личинок комаров. Для этого из коллекции Российского Химико-Технологического Университета им. Д.И. Менделеева и из личной коллекции Борисова Б.А. были взяты штаммы грибов Lagenidium giganteum, Beauveri bassiana, Metarhizium anisopliae, Tolypocladhim cylindrosporum. Данные микроскопические грибы известны как потенциальные высокоэффективные агенты для борьбы с личинками двукрылых насекомых [45, 85-90].
Оценку ларвицидной активности грибов проводили для глубинно выращенных культур, достигших стационарной фазы роста. Глубинное культивирование проводили в колбах объемом 250 мл со 100мл стерильной питательной среды Чапека. Засев культур в колбы осуществляли с косяков путем внесения кусочка мицелия вместе с агаром, размером приблизительно 5 5 мм. Колбы помещали на ротационную качалку и инкубировали в течение 10 суток при скорости 200 об./мин и температуре 25С. В ходе процесса культивирования анализировали морфо-физиологические состояния культур. Окончанием процесса культивирования считали отсутствие при микроскопировании изменений в состоянии грибных культур.
По окончании процесса культивирования проводили отбор проб суспензии клеток микроорганизмов, в которых анализировали морфологические характеристики микроорганизма микроскопированием препарата «раздавленная капля», определяли количество КОЕ грибов методом последовательных разведений Коха.
Оценку ларвицидной активности грибов проводили на личинках комаров рода Aedes aegypty I — II возраста в лабораторных условиях по следующей методике. В емкости объемом 200 мл вносили по 150 мл водопроводной воды. В каждую емкость добавляли по 20 личинок комаров и глубинные культуры грибов, так, чтобы концентрация клеток грибов в емкости была 10б КОЕ/мл. Контролем служили емкости с личинками без добавления каких-либо микроорганизмов. Для контроля и каждого микроорганизма проводили параллельно по 3 повторности. Емкости закрывали притертым стеклом для исключения испарения влаги и вылета вылупившихся комаров. Через каждые три дня проводили подкормку личинок сухим кормом (дейтрит). Емкости с личинками выдерживали при комнатной температуре в течение 8-ми суток. После этого проводили подсчет живых и мертвых личинок и рассчитывали их процент гибели. Мертвыми считали обездвиженные личинки, не реагирующие на свет и внешние раздражители, а так же с явными признаками поражения. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.1.1.1.
Из таблицы 3.1.1.1 видно, что все исследуемые штаммы грибов обладают ларвицидной активностью. В контроле гибели личинок не наблюдалось. Большей активностью обладают штаммы грибов М. anisopliae и Т. cylindrosporwn. Для дальнейшей работы нами был выбран штамм гриба Т. cylindrosporwn, так как по литературным данным он обладает узкой специфической активностью в отношении личинок двукрылых насекомых, в отличие от М. Anisopliae, который обладает активностью в отношении более чем 200 различных насекомых [46].
В литературе практически нет данных о грибе T.cylindrosporum, поэтому важным этапом работы было изучение особенностей развития гриба при культивировании на жидких и твердых питательных средах с различными источниками углерода, морфо-физиологических характеристик и механизма ларвицидной активности микроорганизма.
