Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор.
1.1. Полимерные сорбенты для выделения антибиотиков и других биологически активных веществ. 9
1.1.1. Полимерные сорбенты гелевого типа. 10
1.1.2. Макропористые сорбенты. 12
1.1.3. Гетеросетчатые сорбенты. 13
1.1.4. Макросетчатые сорбенты. 15
1.1.5. Новые подходы к синтезу сорбентов. 15
1.2. Основные виды препаративной хроматографии биологически активных веществ. 19
1.3. Особенности кинетики сорбционных процессов с участием биологически активных веществ. 29
1.4. Антрациклиновые антибиотики (рубомицин, доксорубицин, карминомицин).38
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Материалы. 44
2.1.1. Физико-химические свойства антрациклиновых антибиотиков. 44
2.1.2. Физико-химические характеристики полимерных сорбентов. 46
2.2. Методы. 50
2.2.1. Определение концентрации антибиотиков методом ВЭЖХ. 50
2.2.2. Определение концентрации антибиотиков спектрофотометрическим методом. 50
2.2.3. Определение содержания рубомицина в культуральной жидкости (определение активности культуральной жидкости). 52
2.2.4. Определение полной обменной емкости сорбентов. 52
2.2.5. Потенциометрическое титрование сорбентов. 53
2.2.6. Методика постановки равновесных сорбционных экспериментов. 55
2.2.7. Методика постановки равновесных десорбционных экспериментов. 56
2.2.8. Методика постановки кинетических сорбционных экспериментов. 56
2.2.9. Методика постановки динамических сорбционных экспериментов. 59
Глава 3. Исследование равновесия и кинетики сорбции антрациклиновых антибиотиков.
3.1. Исследование равновесия сорбции антрациклиновых антибиотиков на полимерных сетчатых сорбентах различной структурной организации. 60
3.2. Особенности кинетики сорбции антрациклиновых антибиотиков на структурно сегрегированных сорбентах. 76
Глава 4. Анализ динамики сорбции антрациклиновых антибиотиков.
4.1. Динамика сорбции антибиотиков антрациклинового ряда. 96
4.2. Масштабирование хроматографического процесса и работа с нативным раствором. 115
Выводы. 123
Список литературы. 124
- Полимерные сорбенты гелевого типа.
- Физико-химические свойства антрациклиновых антибиотиков.
- Исследование равновесия сорбции антрациклиновых антибиотиков на полимерных сетчатых сорбентах различной структурной организации.
Введение к работе
Повышение требований к качеству лекарственных препаратов приводит к развитию и совершенствованию современных экологически и экономически выгодных методов получения лекарственных субстанций.
Антибиотики являются одной из самых распространенных групп лекарственных средств, которая широко используется в практической медицине. Настоящая работа посвящена исследованию сорбционных систем с участием антибиотиков антрациклинового ряда. Антрациклиновые антибиотики (рубомицин, карминомицин и доксорубицин) широко применяются в клинической практике для лечения раковых заболеваний различной этиологии.
Исследование равновесия, кинетики и динамики сорбции антрациклинов на полимерных сорбентах актуально в теоретическом плане с точки зрения изучения закономерностей взаимодействия органических веществ незначительной молекулярной массы с сетчатыми полимерными системами. Такие взаимодействия моделируют поведение небольших органических молекул в сложных биологических сорбционных системах. С другой стороны, технология получения антибиотиков антрациклинового ряда включает биосинтез и последующую многостадийную экстракционную очистку с использованием большого количества органических растворителей, вследствие чего часто наблюдается разрушение нативной структуры лекарственной субстанции. Это приводит к ухудшению фармакологических свойств антибиотиков. Использование в экстракционных процессах больших объемов органических растворителей экологически небезопасно. Поэтому создание экологически безопасной и экономически выгодной технологии получения антрациклиновых антибиотиков также является актуальной задачей.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение равновесия, кинетики и динамики сорбции антибиотиков антрациклинового ряда на полимерных сетчатых сорбентах и разработка на основе анализа межмолекулярных взаимодействий между сорбентом и сорбатом эффективного хроматографического метода выделения и очистки субстанций антрациклиновых антибиотиков, соответствующих требованиям фармакопейных статей.
5 Исследование, проведенное в диссертации, включает в себя:
Изучение равновесия сорбции антрациклиновых антибиотиков на сорбентах с различной структурной организацией полимерной сетчатой матрицы и анализ межмолекулярных взаимодействий в системе сорбент-сорбат на основе физико-химических характеристик антибиотиков и полимерных материалов.
Исследование особенностей кинетики сорбции антрациклиновых антибиотиков на полимерных сорбентах. Анализ математических моделей кинетики сорбции и возможностей применения этих моделей для конкретных сорбционных систем с участием антрациклиновых антибиотиков и гетеросетчатых полиэлектролитов.
3. Исследование динамических параметров сорбции антибиотиков
антрациклинового ряда и определение оптимальных физико-химических условий
образования резких границ концентрационного фронта целевого компонента.
Расчет параметров масштабирования для осуществления процесса выделения и
очистки.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Показано, что антрациклиновые антибиотики взаимодействуют с
матрицей сорбентов по ион-ионному и гидрофобному механизмам. При сорбции на
сорбентах ряда БДМ (метакрилсодержащие катиониты) достигается большая
концентрация антибиотика в фазе сорбента, чем при сорбции на сорбентах ряда
БДА (акрилсодержащие катиониты). Наиболее селективная сорбция
осуществляется на структурно сегрегированном карбоксильном катеоните БДМ-
12.
Показано, что кинетика взаимодействия антрациклиновых антибиотиков с БДМ-12 носит внутридиффузионный характер. При анализе применимости различных математических моделей для описания кинетических параметров сорбции показана предпочтительность модели бипористого сорбента.
Исследовано влияние физико-химических параметров сорбционной среды и структуры сорбента на возникновение и развитие концентрационных колебаний в сорбционных процессах. Показано, что колебания наиболее ярко выражены на сорбентах с малой сорбционной емкостью и поверхностно расположенными
ионогенными группами, а также на сорбентах с отчетливо выраженной структурной неоднородностью.
Изучено влияние скорости протекания подвижной фазы на обострение границ фронта целевого компонента при фронтальной и элютивной хроматографии. Проведен анализ критериального параметра регулярности режимов динамической сорбции. Оценены интервалы значений оптимальных скоростей протекания мобильной фазы. Показана возможность использования высоких скоростей сорбции при промышленном использовании хроматографического метода выделения и очистки антрациклиновых антибиотиков.
Проведен анализ возможностей полной десорбции целевого компонента и предложен оптимальный состав элюирующего раствора, при котором наблюдается образование резких границ концентрационного фронта антрациклинового антибиотика. Предложен одноактный хроматографический метод выделения и очистки антибиотиков антрациклинового ряда из нативного раствора.
Научная новизна работы состоит в том, что в ней впервые:
Исследованы равновесные характеристики сорбции антрациклиновых антибиотиков на полимерах с различной структурной организацией сетчатой матрицы. Проведен анализ вкладов ион-ионного и гидрофобного взаимодействия в общее изменение свободной энергии в системе сорбент-сорбат. Сопоставлены равновесные характеристики сорбции рубомицина, доксорубицина и карминомицина в средах с различным значением рН.
Изучены кинетические параметры сорбции и проведена адаптация математической модели бипористого сорбента для описания закономерностей сорбции антрациклиновых антибиотиков во времени. Разработана методика расчета кинетических параметров для конкретной сорбционной системы.
3. Исследовано влияние физико-химических свойств сорбционной среды и
структуры сорбента на возникновение и развитие концентрационных колебаний.
4. Изучено влияние скорости подвижной фазы на динамические
характеристики сорбции. Разработан одноактный хроматографический метод
выделения и очистки антибиотиков антрациклинового ряда. Проведено
масштабирование хроматографического метода получения рубомицина.
Практическая значимость работы состоит в том, что в работе исследованы сорбционные процессы с участием антрациклиновых антибиотиков, разработка методов выделения и очистки которых является актуальной задачей современной биотехнологии. Нахождение оптимальных физико-химических параметров сорбционного процесса дает возможность использовать хроматографический метод выделения антибиотиков данной группы на производстве.
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на 10-й международной конференции студентов и аспирантов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений" (Вторые Кирпичниковские чтения, Казань, 2001), на Втором конгрессе молодых ученых "Научная молодежь на пороге XXI века" (Томск, 2001), на 25-й Международной конференции по высокоэффективным жидкофазным разделениям (Голландия, 2001), на Международном симпозиуме по ионному обмену и хроматографии (Воронеж, 2001), на 4-ом Международном симпозиуме "Молекулярный порядок и подвижность полимерных систем" (Санкт-Петербург, 2002), на Международной конференции по препаративной и индустриальной хроматографии "SPICA 2002" (Heidelberg, 2002) и "SPICA 2004" (Aachen, 2004), на Всесоюзных симпозиумах "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик 2002, 2003), на 3-ем Международном симпозиуме по разделениям в бионауках (Москва, 2003), на 27-ом симпозиуме по высокоэффективным жидкофазным разделениям "HPLC 2003" (Nice, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.
Объем и структура диссертационной работы.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка цитируемой литературы (158 ссылок). Работа изложена на 136 страницах и содержит 51 рисунок и 13 таблиц.
Первая глава диссертации посвящена обзору существующих подходов к изучению рассматриваемых в работе явлений. На основании приведенных научных исследований как отечественных, так и зарубежных ученых дано описание физико-химических свойств сорбционных материалов, используемых в препаративной
8 хроматографии биологически активных веществ (БАВ), а также краткое описание основных видов препаративной хроматографии БАВ. Кроме того, рассмотрены основные равновесные и кинетические параметры сорбционных процессов с участием БАВ и различные математические модели, применяющиеся для описания кинетики сорбции. Также дано описание химического состава, областей применения и фармакокинетики антибиотиков антрациклинового ряда.
Вторая глава посвящена описанию материалов и методов исследования. Описаны физико-химические свойства антибиотиков и сорбентов, использованных в работе. Изложены методики и приведены основные математические формулы, которые применялись для обработки экспериментальных данных.
В третьей главе описаны результаты изучения равновесия сорбции антрациклиновых антибиотиков на полимерных сорбентах, а также анализируются особенности их кинетики сорбции на структурно неоднородных сорбентах. Изучается также влияние физико-химических условий сорбционной среды и свойств полимерной сетчатой матрицы на возникновение и развитие колебательных процессов в сорбционных системах.
Четвертая глава включает в себя анализ динамических параметров сорбции при взаимодействии антрациклиновых антибиотиков с полимерным сорбентом БДМ-12. Рассматриваются параметры масштабирования хроматографических процессов и результаты, полученные при работе с нативным раствором.
В выводах сформулированы общие результаты работы.
Список литературы отражает научные источники, к которым обращался автор данной диссертационной работы в ходе исследований.
Работа выполнена при финансовой поддержке Комиссии РАН по работе с молодежью (6-ой конкурс-экспертиза, грант № 137), Правительства Санкт-Петербурга 2001г. (грант М01-2.5К-79), Федеральной целевой программы "Интеграция 2002-2006гг." (код проекта ИО170), Гранта РАН по поддержке базовой кафедры медицинской биотехнологии при СПбГПУ (2003-2004г.г.), Санкт-Петербургского научного центра ("Региональный грант 2002г."), Санкт-Петербургского научного центра ("Региональный грант 2004г.").
Полимерные сорбенты гелевого типа
Гелевые структуры сетчатых сополимеров возникают при полимеризации с использованием взаиморастворимых мономеров, каждый из которых является хорошим растворителем для образующегося сополимера. При дегидратации гелевые сорбенты образуют непроницаемые блочные структуры [3, 10]. Разработка наиболее регулярных гелевых пространственных сетчатых полимерных структур развивалась на основе реакций в цепях полимеров, когда уже образованные линейные полимерные макромолекулы, содержащие реакционноспособные мономеры, вступают во взаимодействие между собой, образуя наиболее регулярные структуры изопористых сорбентов [11].
Среди сетчатых полиэлектролитов наибольшее значение для выделения и очистки БАВ имеют карбоксильные сорбенты. В отличие от поликислот, содержащих сульфогруппы, они не проявляют существенной каталитической активности даже при значительном повышении кислотности раствора [12, 13]. Вместе с тем, возможность плавного изменения степени ионизации в карбоксильных ионитах позволяет регулировать энергию их межмолекулярного взаимодействия с органическими противоионами. При этом образуются обратимо диссоциирующие полимерные комплексы, в которых можно осуществлять полную десорбцию БАВ. Кроме того, низкие величины значений рКа фиксированных групп сульфо- и фосфорнокислых ионитов требуют применения сильнокислых и сильнощелочных растворов при сорбции и десорбции органических веществ. На карбоксильных катеонитах эти же процессы протекают в относительно "мягких" физико-химических условиях, при которых в большинстве случаев не происходит структурных изменений нативной формы БАВ [13].
Полимерные гелевые сорбенты могут быть синтезированы на основе процессов полимеризации или поликонденсации. В сравнении с поликонденсационными полимеризационные сорбенты обладают большей механической прочностью [13].
Среди катионитов поликонденсационного типа главное место занимают сорбенты фенолформальдегидной природы. Поликонденсационные иониты обычно получают на основе формальдегида и простых эфиров фенола, содержащих карбоксильные группы, - феноксиуксусной, оксифеноксиуксусной. Поликонденсационные карбоксильные иониты мало набухают в водородной форме, что обусловлено гидрофобной природой сетчатой матрицы [13].
Сорбционная емкость полимерных сорбентов по отношению к ионам органических веществ составляет лишь часть от емкости тех же сорбентов по отношению к ионам металлов. Одной из причин снижения сорбционной емкости органических веществ является незначительная степень пористости зерен ионитов, ограничивающая доступность функциональных групп для ионов большого размера. У поликонденсационных гелевых ионитов происходит увеличение размеров пор по сравнению с полимеризационными. Это, по-видимому, обусловлено образованием большего числа физических узлов в сетчатых структурах, возникающих при полимеризации [14].
Показано, что термодинамические константы ионного обмена, характеризующие избирательность сорбции ионов органических веществ при их конкуренции с ионами натрия или водорода, возрастают при усложнении как структуры сорбируемого иона, так и структуры полиэлектролита. Это обусловлено полифункциональными взаимодействиями различного типа [15, 16, 17]. В частности, наблюдалось увеличение избирательности сорбции ионов органических веществ при переходе от полимеризационных ионитов к поликонденсационным, включающим, например, значительное количество шестичленных циклических
Физико-химические свойства антрациклиновых антибиотиков.
Объектами исследования диссертационной работы явились рубомицин, доксорубицин и карминомицин, являющиеся представителями группы антрациклиновых антибиотиков. Структура и физико-химические свойства антрациклиновых антибиотиков представлены в таблице 2.1.
Антрациклиновые антибиотики применяются в клинической практике в виде гидрохлоридов. Гидрохлориды антрациклинов хорошо растворимы в воде и физиологическом растворе, а также в метаноле. Слабо растворимы в этаноле и плохо растворимы в ацетоне и хлороформе. Основания антрациклинов растворимы в хлороформе, плохо растворимы в спиртах и практически не растворимы в воде. Водные растворы антрациклиновых антибиотиков обладают высокой стабильностью при значении рН = 4.0-7.0. В твердом состоянии гидрохлориды стабильны и в течение нескольких лет не теряют активность при температуре 20-25С. При кислотном гидролизе антибиотики теряют нативную структуру и распадаются на соответствующий агликон и аминосахар даунозамин. Это доказано при изучении ПМР-спектров антибиотиков.
Физико-химические и фармакологические свойства антрациклиновых антибиотиков главным образом зависят от природы заместителей в молекуле. Антрациклиновые цитостатики содержат несколько функциональных групп. Это аминогруппа в даунозамине и две фенольных гидроксильных группы в агликоновой части молекулы [129]. Антрациклиновые антибиотики способны ассоциировать [129, 130, 131]. Показано, что ассоциация наиболее заметна в водной среде и уменьшается при переходе в органическую фазу [130]. Антрациклиновые антибиотики в определенном интервале рН могут являться однозарядными катионами. Вместе с тем наличие большой агликоновой части предполагает способность антрациклинов к гидрофобным взаимодействиям [132]. 2. Гелевый сульфокатионит КУ-2-8 получают сульфированием гелевого сополимера стирола и дивинилбензола. При синтезе полимерной матрицы сорбента доля дивинилбензола составляет только 8 вес. %, что делает структуру матрицы квазигомогенной [134].
3. Карбоксильный катионит ПММ-10 получают сополимеризацией метилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата с последующим щелочным гидролизом. Ионогенные группы - СООН. Лабораторный образец с рабочим диапазоном рН от 2-11 (синтезирован в ИВС РАН к.х.н. Ежовой Н.М.) [45]. Строение элементарного звена сорбента:химические характеристики полимерных сорбентов.
Выбор хроматографических носителей и дальнейшее систематическое изучение межмолекулярных взаимодействий в сорбционных системах, прежде всего, основывались на молекулярной структуре антибиотика и на особенностях структур сетчатых матриц сорбентов.
В качестве сорбентов для исследования были выбраны неионогенные и ионогенные гелевые, гетеросетчатые и макропористые полимерные материалы. 1. Макропористый сульфокатионит КУ-23 получают сульфированием макропористого сополимера стирола с дивинилбензолом [133, 134]. Содержит только один вид ионогенных групп - SO3H. Обладает высокой химической стойкостью к кислотам, щелочам, окислителям. Рабочий диапазон рН от 0-1 до 13-14. Применяется в основном для водоподготовки, выделения цветных металлов. Обладает способностью обратимо сорбировать крупные органические ионы [133, 134].
Исследование равновесия сорбции антрациклиновых антибиотиков на полимерных сетчатых сорбентах различной структурной организации
В процессе разработки селективного хроматографического процесса выделения и очистки БАВ наиболее важными параметрами для изучения являются равновесные, кинетические и динамические характеристики сорбции. В задачу данного раздела работы входило изучение равновесия сорбции антрациклиновых антибиотиков (рубомицина, доксорубицина и карминомицина) на полимерных сорбентах различной структуры.
При реализации равновесных хроматографических методов выделения и очистки одними из основных факторов определяющих эффективность процесса являются константа селективности сорбции и предельная сорбционная емкость по целевому БАВ. В связи с этим из равновесных экспериментов были рассчитаны емкости сорбции различных полимерных сетчатых сорбентов по антрациклиновым антибиотикам, а также коэффициенты распределения между подвижной и неподвижной фазами при изменении физико-химических условий экспериментов. По значениям величин коэффициентов распределения можно оценить потенциальную возможность разделения веществ по величине равновесной константы селективности сорбции (К=К2р /К1р).
Методики постановки равновесных экспериментов и физико-химические свойства сорбентов и антибиотиков антрациклинового ряда описаны в разделах "методы" и "материалы" соответственно.
Равновесные сорбционные эксперименты проводились из растворов антибиотиков в ацетате аммония. Выбор такой среды обусловлен хорошей растворимостью антрациклиновых антибиотиков в солях аммония, а также возможностью создания в сорбционном растворе определенной ионной силы, что приближало условия процесса к реальным условиям сорбции объекта из нативного раствора. Опыты проводились из кислой, нейтральной и щелочной сред. Это позволило систематически варьировать состояние ионизации сорбента и сорбируемых антибиотиков. Исходя из физико-химических свойств антрациклиновых антибиотиков можно было полагать, что в кислой и нейтральной средах аминогруппа в даунозамине будет диссоциировать, что, в свою очередь, будет способствовать ион-ионным взаимодействиям между антибиотиком и ионитами с кислотными функциональными группами. Вместе с тем наличие хромофора из четырех конденсированных колец не исключало возможность образования дополнительных неионных взаимодействий.
Для выбора оптимального хроматографического носителя был исследован ряд ионогенных (КУ-23; КУ-2-8; СФ-5; СГ-1М; БДМ-12, ПММ-10) и неионогенных (Полисорб) сорбентов, выпускаемых как в промышленном масштабе, так и в качестве экспериментальных образцов.
На рис.3.1. представлены зависимости емкости сорбции рубомицина от исходной концентрации антибиотика в растворе при различной кислотности среды для сульфокатионитов КУ-23 (сорбент с макропористой матрицей), а также для КУ-2-8 (гелевый сорбент). На рис.3.2. - аналогичные зависимости для карбоксильных катионитов БДМ-12 (сорбент с гетеросетчатой матрицей), СГ-1М (сорбент с макропористой структурой полимерной сетки). На рис.3.3., 3.4, 3.5. -представлены емкости сорбции рубомицина на макропористом молекулярном сорбенте "Полисорб", на фосфорнокислом сорбенте СФ-5, а также на сорбенте ПММ-10 с поверхностно привитыми карбоксильными группами.
На основе полученных экспериментальных данных можно сделать вывод, что при изменении гетерогенности структуры сорбентов от гелевой до макропористой равновесная проницаемость по рубомицину увеличивается. Видно, что при увеличении в сетчатой матрице сульфокатионитов стиролдивинильной природы процента сшивающего агента в 3 раза (при переходе структуры сорбента от гелевой к макропористой), емкость сорбции увеличивается в 5 раз.
Значительные величины емкости сорбции на молекулярном неионогенном сорбенте, по всей видимости, свидетельствует о наличии существенного гидрофобного взаимодействия между матрицей и антибиотиком. Сравнительный анализ величин емкостей сорбции на карбоксильных катионитах и на сульфокатионитах показал значительное уменьшение концентрации антибиотика в фазе сорбента для сульфокатионитов. Из табл.3.1. видно, что в сравнении с сульфокатионитами значения коэффициентов распределения для группы карбоксильных катионитов на два порядка выше. С точки зрения термодинамики система находится в динамическом равновесии между минимумом энергии взаимодействия частиц и максимумом меры разупорядоченности системы (энтропийный фактор). Равновесному состоянию отвечает такое состояние системы, в котором свободная энергия минимальна. При сорбции антибиотика на сорбенте происходит выигрыш в энергии (энергия уменьшается) и проигрыш в энтропии (трансляционная энтропия уменьшается). В случае сорбции рубомицина на сульфокатионитах система стремиться к уменьшению свободной энергии за счет увеличения трансляционной энтропии, вследствие чего не происходит эффективного взаимодействия между антибиотиком и матрицей сорбента. В системе "карбоксильный катионит- раствор рубомицина" более энергетически выгодно снижать свободную энергию системы за счет снижения энергии межмолекулярного взаимодействия, а не за счет увеличения трансляционной энтропии.
После оценки экспериментальных данных по сорбции антибиотиков на различных видах сорбентов для дальнейших экспериментов был выбран гетеросетчатый карбоксильный катионит БДМ-12. Этот выбор обусловлен, прежде всего, высокой равновесной селективностью данного карбоксильного катеонита по отношению к антрациклиновым антибиотикам.
Экспериментальные данные по влиянию рН на равновесие сорбции представлены на рис.3.6.
Наличие максимума на кривой отражает взаимное влияние ионизации смолы и диссоциации антибиотика на характер распределения сорбата между раствором и сорбентом. В кислой области значений рН по мере уменьшения концентрации ионов водорода величина коэффициента распределения увеличивается, что, по всей видимости, связано с ростом степени ионизации функциональных групп ионита [138].
