Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Энантиоселективность. Методы получения оптически чистых изомеров 8
2.2. Метод ВЭЖХ для разделения энантиомеров. Типы хиральных неподвижных фаз 9
2.3. Сорбенты с иммобилизованными макроциклпчсскими гликопептидными антибиотиками 13
2.3.1. Макроциклические гликопептндные антибиотики и получаемые на их основе хиральные селекторы 13
2.3.2. Способы иммобилизации макроциклических гликопептидных антибиотиков на поверхности силикагеля 19
2.4 Хроматографические свойства ХНФ с иммобилизованными хнральными селекторами
на основе макроциклических гликопептидных антибиотиков 20
2.5. Влияние структуры селектора на хроматографические свойства сорбентов с
иммобилизованными макроцикличскими гликопептидными антибиотиками 25
2.6 Влияние структуры разделяемых энантиомеров на хроматографические свойства
сорбентов с иммобилизованными макроцикличскими гликопептидными антибиотиками.
30
2.7. Возможные механизмы разделения на сорбентах с иммобилизованными макроциклическими гликопептидными антибиотиками 38
2.8. Структура и свойства макроцнклического гликопептидного антибиотика эремомнцина 42
3. Экспериментальная часть 47
3.1. Реагенты и растворители 47
3.2.Методики синтеза гликозндов и агликона эремомицина 47
3.3. Методики иммобилизации хиральных селекторов на силикагеле 48
3.4. Хроматографнческий анализ 53
4. Обсуждение результатов 55
4.1. Получение и очистка гликозндов и агликона эремомицина 56
4.2. Иммобилизация хиральных селекторов на силикагеле 60
4.3. Получение гибридного сорбента с иммобилизованным эремомицином, модифицированным хиральным полианилином 67
4.4. Физико-химические исследования полученных хиральных неподвижных фаз 71
4.4.1. ИК-спектроскопия 71
4.4.2.Спектроскопия диффузного отражения компелсксов с тетрацианохинодиметаном 71
4.4.3. Электронная спектроскопия для химического анализа (ЭСХА) 74
4.5. Применение полученных сорбентов для разделения оптических изомеров 78
4.5.1. Применение сорбентов для разделения энантиомеров аминокислот и их производных 78
4.5.1.1. Влияние структуры исследуемых аминокислот на эиантиоселективность разделения.82
4.5.1.2. Влияние условий разделения на энантиоселективность 86
4.5.1.3. Хроматографические характеристики сорбента с иммобилизованными ристомицином А. Зависимость селективности от способа иммобилизации гликопептидных антбиотиков на силикагель 90
4.5.1.4. Влияние структуры селектора на энантиоселективность разделения 92
4.5.1.5. О структуре и локализации «центра хирального распознавания» аминокислот
4.5.1.6. Разделение энантиомеров р-фенилаланина и его производных 101
4.5.2. Применение сорбентов для разделения энантиомеров р-блокаторов 103
4.5.3. Применение сорбентов для разделения энантиомеров профенов 105
4.5.4. Другие возможности разработанных сорбентов в разделении энантиомеров 111
4.6. Изучение адсорбции L- и D-Метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином 114
5. Выводы 121
6. Список литературы 123
7. Приложения 131
- Энантиоселективность. Методы получения оптически чистых изомеров
- Реагенты и растворители
- Получение и очистка гликозндов и агликона эремомицина
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из фундаментальных особенностей живой материи является оптическая молекулярная асимметрия главнейших компонентов организмов — белков и нуклеиновых кислот. Определяя пространственную структуру этих основных биологических полимеров, она играет важную роль в специфичности действия ферментов и, таким образом, в основных реакциях живых систем.
Бурное развитие биохимических исследований, возросшие требования Всемирной организации здравоохранения к оптической чистоте лекарственных препаратов и широкие возможности современной органической химии требуют разработки методов получения оптически чистых соединений. Высокоэффективная жидкостная хроматография является мощнейшим инструментом решения задач аналитического контроля энантиомерного состава хиральных соединений и препаративного получения индивидуальных энантиомеров различных классов соединений. Хроматографическое разделение энантиомеров принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, способный различать пространственную конфигурацию оптических антиподов. В связи с этим интерес к получению новых хиральных селекторов огромен.
Отсутствие универсальных хиральных фаз для разделения оптических изомеров стимулирует разработку новых сорбентов. Иммобилизованные макроциклические гликопептидные антибиотики, к которым относятся ванкомицин, тейкопланин, ристоцетин А, авопарцин и др., успешно зарекомендовали себя в качестве хиральных фаз для ВЭЖХ большого круга оптических изомеров лекарственных препаратов. Высокая энантиоселективность этого класса сорбентов связана с наличием в их структуре различных по строению фрагментов, способных к многоточечным взаимодействиям с разделяемыми соединениями как в полярных, так и неполярных растворителях. Дополнительные возможности по изменению энантиоселективности этого класса сорбентов могут быть достигнуты путем иммобилизации новых антибиотиков, химическим изменением их структуры или оптимизацией методов иммобилизации.
Актуальна проблема разделения аминокислот и их производных, так как они входят в состав белков в организме человека и играют большую роль в процессах питания. Определение и разделение оптических изомеров фармацевтических препаратов профенов и р-блокаторов необходимо вследствие их различного фармакологического действия в биологических системах.
Цель работы заключалась в разработке группы новых хиральных селекторов на основе нового отечественного макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина, способа их иммобилизации на силикагеле, изучении хроматографических и
энантиоселективных свойств полученных сорбентов. Для достижения этой цели были решены следующие задачи:
разработаны методики препаративного выделения новых хиральных селекторов на основе макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина;
разработан метод иммобилизации макроциклических антибиотиков и селекторов, полученных на их основе, на силикагеле для получения хиральных ВЭЖХ сорбентов;
разработан метод получения гибридного сорбента с иммобилизованным комплексом макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и хирального полианилина, полученного в присутствии фермента - лакказы и допирующего агента - сульфокамфорной кислоты;
изучена структура иммобилизованных на силикагеле хиральных селекторов комплексом физико-химических методов: электронной спектроскопии для химического анализа (ЭСХА), ИК-спектроскопии, и спектроскопии диффузного отражения комплексов с тетрацианохинодиметаном;
проведено систематическое изучение хроматографических и энантиоселективных свойств полученных сорбентов при разделении энантиомеров а- и (3-аминокислот и их производных, профенов и р-блокаторов;
изучены изотермы адсорбции L-и D-метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином и выяснены возможности применимости данного сорбента для препаративного разделения энантиомеров метионина методом «симулированного подвижного слоя сорбента» (SMB).
Научная новизна. Разработаны новые хиральные селекторы, полученные путем кислотного гидролиза макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина. Разработан новый метод иммобилизации хиральных селекторов гликопептидной природы на силикагеле. Получены новые хиральные ВЭЖХ сорбенты на основе отечественного макроциклического гликопептидного антибиотика - эремомицина, его производных, а также комплекса эремомицина с хиральным полианилином.
Проведено систематическое изучение хроматографических и энантиоселективных свойств полученных ВЭЖХ сорбентов в разделении энантиомеров а- и р-аминокислот, профенов и р-блокаторов. Изучены зависимости удерживания и энантиоселективности разделения энантиомеров аминокислот от структуры сорбата, значения рН элюента, концентрации органического растворителя в подвижной фазе и температуры.
По изотермам адсорбции индивидуальных энантиомеров метионина оценены вклады в удерживание энантиоселективных и неселективных сайтов молекулы эремомицина, что позволило рассчитать и экспериментально подтвердить возможность
использования данного сорбента в препаративных разделениях рацемических смесей методом SMB.
Практическая значимость. Предложен простой метод иммобилизации селекторов гликопептидной природы на силикагеле, отличающийся проведением прививки из водно-органических смесей, при комнатной температуре. Найдены условия разделения большого числа энантиомеров различных классов соединений, в том числе и лекарственных препаратов, в условиях обратно-фазового и полярно-ионного режима ВЭЖХ.
Хроматографические колонки, заполненные разработанными сорбентами, внедрены в производство и выпускаются предприятием ЗАО «БиоХимМак СТ» под торговым названием Nautilus-E, Nautilus -R, Nautilus -V.
На защиту выносятся следующие положения:
Метод иммобилизации хиральных селекторов на основе макроциклических гликопептидных антибиотиков на силикагеле.
Методики получения и препаративного выделения дезэремозаминилэремомицина, эремозаминилагликона эремомицина и полного агликона эремомицина.
Метод получения гибридного сорбента на основе макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина и хирального полианилина.
Закономерности удерживания и энантиоразделения энантиомеров аминокислот от структуры сорбата, значения рН элюента, концентрации органического растворителя в подвижной фазе и температуры, а также структуры хирального селектора.
Данные по разделению энантиомеров профенов и (3-блокаторов и зависимости энантиоразделения от структуры хирального селектора.
Данные по расчету изотерм адсорбции оптических изомеров метионина на сорбенте с иммобилизованным эремомицином и препаративному разделению энантиомеров метионина методом SMB.
Данные по физико-химическим свойствам синтезированных сорбентов, полученные методами ИК-спектроскопии, спектроскопии диффузного отражения и ЭСХА.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» Москва. 2004. 15-19 марта; Международная конференция «Физико-химические основы новейших технологий XXI века» Москва. 2005. 30 мая - 4 июня; Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» Самара. 2005. 3-8 июля; 1st South East European Congress of Chemical
Engineering. Belgrade. Serbia. 2005. September 25 - 28; II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург. 2005. 6-8 июня; X Международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» Москва. 2006. 24 — 28 апреля; Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях». Москва. 2007. 23 — 27 апреля; Всероссийский симпозиум «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия». Москва. 2008. 14-18 апреля.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 8 тезисов докладов, получено 3 патента на изобретения.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 6 глав обсуждения результатов, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 131 странице машинописного текста, содержит 51 рисунок и 19 таблиц, в списке цитируемой литературы 122 наименования.
2. Обзор литературы 2.1. Энантиоселективность. Методы получения оптически чистых изомеров.
Органические соединения, связанные с живыми организмами, так же как и побочные продукты их метаболизма, в основном хиральны и оптически активны. Слово «хиральность», происходящее от английского «chirality» и от греческого «cheir» - рука, означает свойство молекулы быть несовместимой со своим зеркальным отражением любой комбинацией вращений и перемещений в трёхмерном пространстве. Такие молекулы называют энантиомерами. Эквимолярная смесь обоих энантиомеров, оптически не активна, и называется рацемической смесью. Различают центральную, аксиальную, планарную и спиральную хиральности.
Следствием хиральности является оптическая активность. Два энантиомера одного соединения могут вращать плоскость поляризованного света на углы одинаковые по абсолютному значению, но разные по знаку. Они обладают одинаковыми физическими и химическими свойствами, но могут иметь различную биологическую активность, что является следствием различной способности энантиомеров к взаимодействию с другой хиральной молекулой, находящейся в живом организме. Очень часто необходимой активностью обладает только один оптический изомер (эутомер), в то время как другой (дистомер) может быть токсичным или являться причиной побочных эффектов. В связи с этим разделение энантиомеров имеет большое значение для фармацевтической, пищевой (пищевые добавки) и агрохимической (гербициды, инсектициды) промышленности.
Для получения оптически чистого соединения используются два подхода:
1) Энаптиоселективный каталитический синтез требуемого энантиомера - метод,
бурно развивающийся в последние несколько десятилетий. К недостаткам можно отнести
продолжительность во времени и высокую стоимость процесса, а также часто жесткие
условия синтеза (низкая температура, безводная среда). В связи с этим более
предпочтительным представляется второй подход.
2) Разделение рацемической смеси двух энантиомеров. Данный способ может
использоваться как в аналитических, так и в препаративных масштабах. Методы
разделения, как правило, достаточно непродолжительны во времени. Недостатком этого
подхода является пятидесятипроцентный выход требуемого энантиомера, однако решение
этой проблемы может служить последующая рацемизация ненужного энантиомера и
повторное разделение.
Существует целый ряд методов разделения: кристаллизация, возгонка, жидкостно-жидкостная экстракция, биотрансформация ферментами, использование энантиоселективных мембран, сенсоров, капиллярный электрофорез и различные виды
хроматографии. Наиболее используемым методом хроматографии для разделения энантиомеров является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
2.2. Метод ВЭЖХ для разделения энантиомеров. Типы хиральных неподвижных фаз.
В общем случае ВЭЖХ методы разделения энантиомеров можно разделить на две группы: прямые и непрямые.
Непрямой метод основан на ковалентном связывании молекул рацемата с другой хиральной молекулой, что приводит к образованию пары диастереомеров. Разделение полученных диастереомеров может быть произведено на нехиральных колонках. Недостаткам данного метода являются: необходимость модификации рацемата и наличия оптически чистого модификатора, а также проведение последующего разделения энантиомеров и модификатора.
Прямой метод основан на формировании нековалентной диастереомерной пары между молекулами рацемата и хиральным селектором. Хиральный селектор может быть иммобилизован на поверхности с образованием хиральной неподвижной фазы (ХНФ) или использоваться как хиральная добавка (ХД) в подвижную фазу. В последнем случае разделение может быть произведено на нехиральных колонках. Так как хиральные добавки дороги и не так удобны из-за необходимости последующего их отделения от целевого энантиомера, то ХНФ представляются более удачным выбором для энантиоразделения [1].
Хиральный селектор, закрепленный на поверхности, призван распознавать пространственную конфигурацию двух энантиомеров. Энантиоселективность хирального селектора заключается в его способности образовывать с рацематом двух диастереомерных пар, отличающихся друг от друга термодинамической стабильностью. Соответственно, тот энантиомер, который образует более прочный диастереомерный комплекс с селектором, будет дольше удерживаться на сорбенте и последним выходить из хроматографической колонки. Для объяснения разделения оптических изомеров предложен ряд моделей хирального распознавания, которые во многих случаях основаны на модели «трехточечного взаимодействия», выдвинутой Далглишем в 1952 г. Согласно этой теории, для хирального распознавания необходимы три одновременно осуществляющихся контакта между одним энантиомером и неподвижной фазой. Ситуация, вызывающая появление энантиоселективности, наглядно представлена на рисунке 1. Эта модель определяет условия, достаточные для возникновения энантиоселективности.
Энантиоселективность. Методы получения оптически чистых изомеров
Органические соединения, связанные с живыми организмами, так же как и побочные продукты их метаболизма, в основном хиральны и оптически активны. Слово «хиральность», происходящее от английского «chirality» и от греческого «cheir» - рука, означает свойство молекулы быть несовместимой со своим зеркальным отражением любой комбинацией вращений и перемещений в трёхмерном пространстве. Такие молекулы называют энантиомерами. Эквимолярная смесь обоих энантиомеров, оптически не активна, и называется рацемической смесью. Различают центральную, аксиальную, планарную и спиральную хиральности.
Следствием хиральности является оптическая активность. Два энантиомера одного соединения могут вращать плоскость поляризованного света на углы одинаковые по абсолютному значению, но разные по знаку. Они обладают одинаковыми физическими и химическими свойствами, но могут иметь различную биологическую активность, что является следствием различной способности энантиомеров к взаимодействию с другой хиральной молекулой, находящейся в живом организме. Очень часто необходимой активностью обладает только один оптический изомер (эутомер), в то время как другой (дистомер) может быть токсичным или являться причиной побочных эффектов. В связи с этим разделение энантиомеров имеет большое значение для фармацевтической, пищевой (пищевые добавки) и агрохимической (гербициды, инсектициды) промышленности.
Для получения оптически чистого соединения используются два подхода:
1) Энаптиоселективный каталитический синтез требуемого энантиомера - метод, бурно развивающийся в последние несколько десятилетий. К недостаткам можно отнести продолжительность во времени и высокую стоимость процесса, а также часто жесткие условия синтеза (низкая температура, безводная среда). В связи с этим более предпочтительным представляется второй подход.
2) Разделение рацемической смеси двух энантиомеров. Данный способ может использоваться как в аналитических, так и в препаративных масштабах. Методы разделения, как правило, достаточно непродолжительны во времени. Недостатком этого подхода является пятидесятипроцентный выход требуемого энантиомера, однако решение этой проблемы может служить последующая рацемизация ненужного энантиомера и повторное разделение.
Существует целый ряд методов разделения: кристаллизация, возгонка, жидкостно-жидкостная экстракция, биотрансформация ферментами, использование энантиоселективных мембран, сенсоров, капиллярный электрофорез и различные виды хроматографии. Наиболее используемым методом хроматографии для разделения энантиомеров является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Метод ВЭЖХ для разделения энантиомеров. Типы хиральных неподвижных фаз.
В общем случае ВЭЖХ методы разделения энантиомеров можно разделить на две группы: прямые и непрямые.
Непрямой метод основан на ковалентном связывании молекул рацемата с другой хиральной молекулой, что приводит к образованию пары диастереомеров. Разделение полученных диастереомеров может быть произведено на нехиральных колонках. Недостаткам данного метода являются: необходимость модификации рацемата и наличия оптически чистого модификатора, а также проведение последующего разделения энантиомеров и модификатора.
Прямой метод основан на формировании нековалентной диастереомерной пары между молекулами рацемата и хиральным селектором. Хиральный селектор может быть иммобилизован на поверхности с образованием хиральной неподвижной фазы (ХНФ) или использоваться как хиральная добавка (ХД) в подвижную фазу. В последнем случае разделение может быть произведено на нехиральных колонках. Так как хиральные добавки дороги и не так удобны из-за необходимости последующего их отделения от целевого энантиомера, то ХНФ представляются более удачным выбором для энантиоразделения [1].
Хиральный селектор, закрепленный на поверхности, призван распознавать пространственную конфигурацию двух энантиомеров. Энантиоселективность хирального селектора заключается в его способности образовывать с рацематом двух диастереомерных пар, отличающихся друг от друга термодинамической стабильностью. Соответственно, тот энантиомер, который образует более прочный диастереомерный комплекс с селектором, будет дольше удерживаться на сорбенте и последним выходить из хроматографической колонки. Для объяснения разделения оптических изомеров предложен ряд моделей хирального распознавания, которые во многих случаях основаны на модели «трехточечного взаимодействия», выдвинутой Далглишем в 1952 г. Согласно этой теории, для хирального распознавания необходимы три одновременно осуществляющихся контакта между одним энантиомером и неподвижной фазой. Ситуация, вызывающая появление энантиоселективности, наглядно представлена на рисунке 1. Эта модель определяет условия, достаточные для возникновения энантиоселективности.
Реагенты и растворители
Получение культуральной жидкости эремомицина проведено в НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН. Очистка и выделение эремомицина проведено в лаборатории компании «БиоХимМак СТ». Ристомицин А был любезно предоставлен проф. Г.С. Катрухой (НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН). Ванкомицин - лиофильно высушенный аптечный препарат производства «Алфарма Кфт» (Венгрия).
Для приготовления подвижной фазы применяли хроматографически чистые ацетонитрил, метанол, изопропанол (Флюка, Швейцария). В качестве буферных добавок использовали уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, ацетат аммония, триэтиламин (Флюка, Швейцария).
Методики синтеза гликозидов и агликона эремомицина
Синтез дезэремозаминилэремомицина проводили следующим образом. Растворили 3 г эремомицина в 40 мл 1 М соляной кислоты. Раствор нагревали при 70С в течение 40 мин. Полученную реакционную смесь охладили и нейтрализовали 1 М раствором гидроксида натрия. Полученный дезэремозаминилэремомицин очищали методом препаративной ВЭЖХ на колонке размером 24x250 мм, с сорбентом Диасорб-130-С16Т 8 мкм в 5 %-ном водном растворе изопропилового спирта с добавкой 0,1% трифторуксусной кислоты при потоке 23 мл/мин, с последующей лиофильной сушкой очищенного продукта. Выход составил 13.3% (400 мг). Чистота полученного дезэремозаминилэремомицина по данным ВЭЖХ составила 95%.
Синтез эремозаминилагликона и полного агликона эремомицина проводили одновременно. Растворили 3,28 г эремомицина в 65 мл концентрированной соляной кислоты и оставили в холодильнике при 4С на 4 часа. По окончании гидролиза смесь нейтрализовали сухим карбонатом натрия и разбавили дистиллированной водой до объема 1 л для растворения выпавшего первоначально в ходе нейтрализации осадка.. Очистку и разделение целевых продуктов проводили методом препаративной ВЭЖХ на колонке размером 24x250 мм с сорбентом Диасорб-ІЗОСІбТ 8 мкм в 10 %-ном водном растворе изопропилового спирта с добавкой 1 % уксусной кислоты при потоке 23 мл/мин. Вещества в сухом состоянии выделялись путем лиофильной сушки. Получено 0.85 г эремозаминилагликона (чистота по данным ВЭЖХ - 98%) и 1.2 г полного агликона (чистота по данным ВЭЖХ - 92%) эремомицина.
Структуры полученных соединений подтверждены методом масс-спектрометрии
Масс спектры индивидуальных соединений получены в Институте физиологически активных веществ РАН на масс-спектрометре Finnigan LQ методом электроспрея (ионизация при атмосферном давлении)
Методики иммобилизации хиральиых селекторов на силикагеле
В качестве носителей были выбраны: сферические силикагели марки Kromasil (Akzo Nobel, Швеция) с размером частиц. 5 мкм, различной удельной поверхностью и средним диаметром пор: 557 м2/г и 6 нм; 313 м2/г и 11 нм; 217 м2/г и 20 нм; 117 м2/г и 30 нм, а также отечественный силикагель с нерегулярной формой частиц КСК-Г с размером частиц 7 мкм, удельной поверхностью 275 м /г и средним диаметром пор 13 нм.
Контроль за протеканием процессов химического модифицирования силикагеля осуществляли методами титрования и элементного анализа.
Расчет содержания привитого антибиотика проводили из данных анализа сорбентов на содержание углерода по формуле:
Е (мкмоль/г) = АС/1,2 пс,
где пс - число атомов углерода в молекуле антибиотика, АС — прирост содержания углерода в сорбенте после стадии прививки антибиотика.
Расчет плотности прививки (мкмоль/м2, групп/нм2- с учетом удельной поверхности носителя и его доли в составе сорбента рассчитывали по формуле:
Р(мкмоль/м - Е/ S уд,
где S уд — поверхность носителя с учетом привитого органического вещества; р (групп/нм2) = Р х 1018 х б,02х1023/106 = 0,602 Р
Иммобилизация эремомицина на силикагеле через 1,6-диизоцианатгексан.
К 5 г силикагеля Kromasil (Буд 313 м/г, Dnop 11 нм) добавили 120 мл сухого толуола, отгоняли азеотропную смесь толуола и воды. Затем, прибавили по каплям 2,5 мл (З-аминопропил)-триэтоксисилана (11 ммоль) и нагревали реакционную смесь при перемешивании с обратным холодильником в течение 4 часов. После охлаждения модифицированный силикагель отфильтровали и промыли толуолом, метанолом и дихлорметаном, сушили при температуре 90С. Результат элементного анализа: 3.4 % С, 0.7 %Н, 1.7 %N.
1,6-Диизоцианатогексан (2,5 мл, 15 ммоль) добавили к охлаждаемой на ледяной бане суспензии 2,5 г модифицированного аминогруппами силикагеля в 50 мл сухого толуола. Смесь нагревали в течение 2-х часов при температуре 70С. После охлаждения, толуольную фазу отогнали в атмосфере аргона. Избыток реагента отмыли сухим толуолом. Результат элементного анализа: 10.3 % С, 1.6 % Н, 3.7 % N.
Суспензию 1 г эремомицина (0,6 ммоль) в 100 мл сухого пиридина добавили по каплям к активированному силикагелю. Затем, реакционную смесь нагревали при перемешивании в атмосфере аргона в течение 12 часов при температуре 70С. После охлаждения, силикагель промыли по очереди 50 мл пиридина, воды, метанола, ацетонитрила и дихлорметана. Сушили при температуре 70С. Результат элементного анализа: 10.3 % С, 1.6 % Н, 3.4 % N.
Иммобилизация эремомицина на силикагеле через у-Вг пропилдиметилхлорсилан.
К 5 г силикагеля Kromasil (Sya 313 м2/г, Dnop 11 нм) добавили 120 мл сухого толуола, отгоняли азеотропную смесь толуола и воды. Затем, прибавили по каплям 4 мл у-Вг-пропилдиметилхлорсилана (15 ммоль) и нагревали реакционную смесь при перемешивании с обратным холодильником в течение 4 часов. После охлаждения модифицированный силикагель отфильтровали и промыли толуолом, метанолом и дихлорметаном, сушили при температуре 90С. Результат элементного анализа: 3.7 % С.
Эремомицина (1 г) растворили в 15 мл дистиллированной воды, используя раствор гидроксида калия (1 М) довели рН до значения 8,56. Полученный раствор прилили к у-Вг-пропил-силикагелю, добавили 6 мл этанола для смачивания. Реакционную смесь нагревали при 40С при перемешивании в течение 30 часов. Затем сорбент отфильтровали и промыли водой, метанолом, ацетонитрилом, ацетоном. Сушили при температуре 50С до постоянной массы. Результат элементного анализа: 3.9 % С, 1.1 % Н, 2.1 % N.
Получение силикагеля, модифицированного 3-глицидоксипропил триэтоксисиланом.
Силикагель (10 г) Kromasil(Sy, 313 м2/г, Dnop 11 нм) суспендировали в 500 мл 0,1 М раствора ацетата натрия, доведенного ледяной уксусной кислотой до рН 5,5. К полученной суспензии добавили 78 мл 3-глицидоксипропилтриэтоксисилана. Реакционную смесь интенсивно перемешивали в течение 2-х часов, а затем оставили без нагревания и перемешивания на 4 суток. По окончании реакции твердую фазу промыли водой, этанолом, ацетоном, и отфильтровали. Сушили при температуре 105С. Результат элементного анализа: 5.2 % С, 1.1 % Н.
Получение и очистка гликозндов и агликона эремомицина
В связи с изложенным, была поставлена задача — разработать удобный метод селективного отщепления моносахаридов от молекулы эремомицина и разработать препаративный хроматографический метод выделения и очистки гликозидов и агликона эремомицина в соответствии со схемой, представленной на рисунке 14.
Эремозаминилагликон эремомицина Агликон эремомицина Рис. 14. Схема модификации эремомицинового селектора
В литературе описаны различные методы решения аналогичных задач, основанные на кислотном гидролизе гликопептидных антибиотиков.
Получение полного агликона ванкомицина с выходом до 90% можно осуществить в атмосфере сухого газообразного фтороводорода [101]. Однако, метод требует специального оборудования.
Полный агликон тейкопланина получают гидролизом тейкопланина в ДМСО 80%-ной серной кислотой [37]. В случае эремомицина нам удалось получить эремозаминилагликон эремомицина 87%-ной чистоты, однако метод не слишком удобен для препаративной наработки продукта.
Наиболее простым и взятым нами за основу оказался метод, основанный на гидролизе эремомицина соляной кислотой [89], позволяющий в разных условиях получить все интересующие нас продукты. Кипячение в 0.2 н соляной кислоте в течение 10 минут приводит к отщеплению эремозамина от дисахаридной ветви, а затем еще в течение 30 минут отщепляется остаток глюкозы. Полный агликон получают кипячением він. соляной кислоте в течение часа. Очистку проводят в два этапа, сначала на колонке, заполненной сульфокатионитом, а затем методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом получают хроматографически однородные продукты.
Как условия проведения гидролиза, так и метод выделения необходимо было модифицировать из-за большого количества побочных продуктов, низких выходов и сложности двухстадийной хроматографической очистки.
Снижение температуры обработки и увеличение времени гидролиза (0.2 н соляная кислота, 70С, 40 мин.) позволяют получить дезэремозаминилэремомицин с высоким выходом, практически свободный от побочных продуктов. Для получения эремозаминилагликона и полного агликона эремомицина оптимальным является выдерживание эремомицина в растворе концентрированной соляной кислоте на холоду при 4С в течение 4-х часов.
Аналитический контроль протекания гидролиза осуществляли методом ВЭЖХ на колонке Диасфер-110-С16, 5 мкм, размером 4x150 мм. Контроль процесса накопления дезэремозаминилэремомицина в результате гидролиза осуществляли в водно-ацетонитрильном элюенте, а эремозаминилагликона и полного агликона водно-изопропанольный элюент с добавками уксусной кислоты (рис. 15)
