Введение к работе
Актуальность темы. Методы экстракорпорального созревания и оплодотворения ооцитов сельскохозяйственных животных широко используются в биотехнологии для целей клеточной инженерии, а также получения эмбрионов, пригодных для трансплантации. Разработанные к настоящему времени технологии культивирования и оплодотворения in vitro ооцитов коров позволяют получить достаточно высокий выход морул и бластоцист (до 30-45 %), однако многие проблемы, связанные с их жизнеспособностью остаются нерешенными (Капе, 2003). Основными лимитирующими факторами при получении эмбрионов являются качество исходной популяции ооцитов и их способность к дальнейшему развитию, приобретенная в процессе экстракорпорального созревания. Последний фактор в высокой степени зависит от состава системы культивирования ооцитов и поэтому является объектом направленного воздействия (Nagai, 2001; Sirard, 2001). Развитие новых технологий, таких как клонирование и получение эмбриональных стволовых клеток, которые основаны на использовании созревших in vitro ооцитов, повышает значимость исследований, ориентированных на дальнейшую модернизацию систем созревания. Это свидетельствует о необходимости целенаправленного поиска физиологически уместных биологически активных веществ, способных специфически воздействовать на ооцит и повышать его компетенцию к дальнейшему развитию. Одним из таких потенциальных стимуляторов является гипофизарный гормон про-лактин (ПРЛ), играющий исключительно важную роль в регуляции репродукции млекопитающих, что подтверждается данными о бесплодии самок мышей с инак-тивированным геном для рецептора ПРЛ (Bole-Feysot et al., 1998). Показано также, что в некоторых системах культивирования ооцит-кумулюсных комплексов коров ПРЛ может оказывать стимулирующее влияние на потенцию яйцеклеток к дальнейшему развитию (Кузьмина и др., 2001). Это указывает на возможность практического использования данного гормона с целью совершенствования технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота. Однако успешное применение ПРЛ в биотехнологической практике невозможно без глубокого понимания механизмов его участия в регуляции формирования зрелых яйцеклеток. Это обусловливает необходимость детального изучения процессов, связанных с реализацией гормонального влияния на ооциты и кумулюсные клетки.
Как известно, гонадотропные гормоны - фолликулостимулирующий и лю-теинизирующий - играют ключевую роль в контроле овариальной функции млекопитающих. Также установлено, что основным вторичным посредником в механизмах передачи сигналов гонадотропных гормонов в фолликулярные клетки является циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), который выполняет центральную роль в регуляции мейоза ооцитов (Mattioli, 1994; Conti et al., 2002). Одна из функций ПРЛ заключается в модуляции регуляторного действия гонадотропных гормонов на функциональную активность фолликулярных клеток, однако механизм этого модулирующего влияния до сих пор не ясен (Krasnow et al., 1990). В связи этим исследование взаимодействия сигнальных путей, активируемых гонадотропными гормонами, в первую очередь, цАМФ-зависимого пути, и пролактином в ооцит-кумулюсных комплексах, имеет актуальное значение для понимания фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции овариальной функции, в том числе созревания ооцитов.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - идентифицировать молекулярные и клеточные пути влияния ПРЛ на созревание ооцит-кумулюсных
комплексов коров и на этой основе модернизировать систему культивирования ооцитов для получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота.
В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:
-
Провести сравнительный анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцитах и окружающих их клетках кумулюса.
-
Изучить влияние ПРЛ на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах.
-
Исследовать участие клеток кумулюса в реализации эффектов ПРЛ на ядерное созревание ооцитов.
-
Охарактеризовать роль протеинкиназы С в проведении сигналов ПРЛ в ооциты.
5. Сравнить индивидуальное и совместное действие ПРЛ и цАМФ-
повышающих реагентов на морфофункциональное состояние клеток кумулюса.
6. Изучить влияние ПРЛ в присутствии гонадотропных гормонов на созрева
ние окруженных клетками кумулюса и денудированных ооцитов, их оплодотво-
ряемость и способность к развитию до стадии бластоцисты.
Научная новизна. При выполнении диссертационной работы впервые выявлена экспрессия мРНК длинной и короткой формы рецептора ПРЛ в ооцитах и клетках кумулюса коров и показано функционирование как прямого, так и опосредованного кумулюсом пути проведения сигнала ПРЛ в ооциты. Впервые детально исследовано взаимодействие сигнальных каскадов, активируемых цАМФ и пролак-тином в ооцитах и клетках кумулюса коров, и обнаружено различие участков сопряжения этих каскадов в половых и соматических клетках фолликулов. Выполненная работа является первым исследованием, в котором получены данные о зависимости характера влияния ПРЛ на мейоз от уровня цАМФ в ооцитах.
Практическая значимость работы. Модернизирована система созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов из фолликулов диаметром 2-8 мм посредством одновременного введения в среду гонадотропных гормонов и ПРЛ (50 нг/мл), обусловливающая повышение качества цитоплазматического созревания ооцитов и эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота.
Основные положения, выносимые на защиту.
У коров функционируют два разных пути проведения сигнала ПРЛ в ооциты: прямой и опосредованный клетками кумулюса.
Характер влияния ПРЛ на ядерное созревание ооцитов зависит от внутриклеточного уровня цАМФ.
ПРЛ оказывает модулирующее действие на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах коров.
Модификация среды культивирования ооцит-кумулюсных комплексов, содержащей гонадотропные гормоны, введением ПРЛ (50 нг/мл) позволяет оптимизировать условия созревания ооцитов коров и повысить последующий выход эмбрионов на стадии бластоцисты.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных научных конференциях: «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных», Дубровицы, 2007; «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии», Дубровицы, 2008; «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных», Санкт-Петербург, 2008; на конферен-
циях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖа, 2007,2008.
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 - в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах, содержит 10 таблиц и 17 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 258 источников, в том числе 232 на иностранном языке.
