Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы воспроизводительная способность коров с высокой молочной продуктивностью неуклонно снижается, что связано с нарушением у них различных физиологических функций, в том числе овариальной (Chagas et al., 2007; Dobson et al., 2007). Дисфункция яичников у высокопродуктивных животных приводит к неполноценному развитию доминантных фолликулов, изменению стероидогенеза, снижению жизнеспособности ооцитов и их компетенции к эмбриональному развитию. Как известно, гонадотропные гормоны являются ключевыми регуляторами фолликуло- и оогенеза у млекопитающих, однако характер их секреции изменяется лишь незначительно у молочных коров с пониженной воспроизводительной способностью (Gong, 2002). В качестве основных эндокринных факторов, связанных с ослаблением овариальной активности у высокоудойных коров, обычно рассматриваются метаболические гормоны (Gong, 2002; Chagas et al., 2007). Важную роль в этих условиях также может играть гипофизарный гормон ПРЛ, основной функцией которого является регуляция репродукции млекопитающих (Bachelot, Binart, 2007). Ряд данных указывает на то, что нарушения в проведении сигнала ПРЛ в овариальные клетки на рецепторном или пострецепторном уровне приводят к ухудшению фертильности самок, в том числе к неадекватному развитию фолликулов, снижению качества ооцитов, оплодотворяемости яйцеклеток и их способности к дальнейшему развитию (Jinno et al., 1997; Bole-Feysot et al., 1998; Bartke, 1999). Таким образом, становится актуальным вопрос о роли ПРЛ в регуляции овариальной функции у крупного рогатого скота, в том числе на молекулярном и клеточном уровнях. Особый интерес представляет изучение влияния ПРЛ на развитие биологически полноценных яйцеклеток, что связано с возможностью его использования при экстракорпоральном созревании ооцитов коров для повышения их компетенции к эмбриональному развитию (Кузьмина и др., 2001).
В настоящее время имеется лишь незначительное число работ, затрагивающих вопросы влияния ПРЛ на созревание фолликулов и ооцитов у крупного рогатого скота (КРС). Поэтому комплексное исследование путей и механизмов действия ПРЛ на соматические и половые клетки овариальных фолликулов коров имеет актуальное значение как для понимания фундаментальных принципов гормональной регуляции фолликуло- и оогенеза, так и для оптимизации методов биотехнологии репродукции у КРС.
Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлось исследование биохимических и генетических аспектов регуляции пролактином овариальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях и создание на этой основе теоретической модели, описывающей механизмы влияния ПРЛ на мейоз ооцитов и функциональную активность фолликулярных клеток. В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:
-
Идентифицировать физиологические факторы, связанные с репродуктивным статусом животных и стадией развития/атрезии фолликулов, детерминирующие содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости.
-
Охарактеризовать взаимодействие ПРЛ со своими рецепторами на клетках гранулезы и его зависимость от интрафолликулярных компонентов и степени зрелости фолликулов.
-
Оценить роль онтогенетических и гормональных факторов в регуляции компетентности гранулезных клеток к связыванию ПРЛ.
-
Провести анализ экспрессии альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в
овариальных клетках различного типа.
-
Изучить характер действия ПРЛ на экспрессию собственного рецептора в фолликулярных клетках в зависимости от их сопряжения с ооцитом.
-
Выполнить сравнительный анализ индивидуального и совместного влияния ПРЛ и метаболических гормонов in vitro на функциональную активность соматических клеток из антральных фолликулов.
-
Исследовать регуляторные эффекты ПРЛ при созревании ооцитов, окруженных клетками кумулюса, в различных системах культивирования.
-
Провести сравнительную оценку участия клеток гранулезы в опосредовании действия ПРЛ и соматотропного гормона in vitro на оопит-кумулюсные комплексы.
-
Охарактеризовать влияние ПРЛ in vitro на пАМФ-зависимый механизм регуляции созревания изолированных и окруженных кумулюсом ооцитов.
-
Изучить участие клеток кумулюса в проведении сигналов ПРЛ в половые клетки и оценить роль протеинкиназ как медиаторов гормонального действия на ооциты и оопит-кумулюсные комплексы.
-
Идентифицировать сигнальный каскад, опосредующий влияние ПРЛ на пАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза.
-
Исследовать функцию клеток кумулюса в реализации влияния ПРЛ на приобретение ооцитами способности к эмбриональному развитию в присутствии гонадотропных гормонов.
Научная новизна. Диссертационная работа является первым комплексным исследованием характера, путей и механизмов влияния ПРЛ на половые и соматические клетки антральных фолликулов коров, а также факторов, детерминирующих реализацию и степень гормонального воздействия. При выполнении работы впервые были получены следующие результаты:
Установлена зависимость содержания ПРЛ в фолликулярной жидкости от фазы полового цикла животных и степени атрезии антральных фолликулов. Определены параметры взаимодействия ПРЛ со своими рецепторами на клетках гранулезы и обнаружено снижение концентрации лактогенных рецепторов на заключительной стадии созревания фолликулов. Охарактеризовано влияние репродуктивного статуса животных, лютеальной дифференцировки и воздействия соматотро-пина на компетентность клеток гранулезы к связыванию ПРЛ. Выявлено присутствие мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцитах и клетках кумулюса и гранулезы и показан тканеспецифический характер экспрессии этих альтернативных изоформ в яичнике коров. Продемонстрировано регуляторное влияние ПРЛ in vitro на экспрессию собственного рецептора в ооцит-кумулюсных комплексах на уровне транскрипции соответствующего гена и в клетках гранулезы - на уровне альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Показана зависимость ростостиму-лирующего эффекта ПРЛ в культуре гранулезных клеток от степени зрелости антральных фолликулов и выявлена модуляция соматотропином регуляторного действия ПРЛ на синтез ДНК в этих клетках. Обнаружено ингибирующее влияние ПРЛ на деструктивные процессы в культивируемых клетках гранулезы из атрети-ческих фолликулов. Продемонстрировано in vitro стимулирующее действие ПРЛ на ядерное созревание окруженных кумулюсом ооцитов, а также его тормозящее действие на дегенеративные изменения ядерного материала в яйцеклетках, связанное с освобождением ионов кальция из внутриклеточных депо. Охарактеризована роль клеток гранулезы как медиаторов влияния ПРЛ на мейотические преобразования
хромосом в ооцитах. Установлено участие тирозинкиназ в реализации прямого и опосредованного клетками кумулюса действия ПРЛ на мейоз ооцитов. Выявлено взаимодействие сигнальных каскадов, активируемых ПРЛ и цАМФ в половых и соматических клетках фолликулов. Идентифицирован механизм индуцирующего влияния ПРЛ на реинициацию мейоза при повышении внутриклеточного уровня цАМФ, включающий активацию фосфодиэстеразы 3 и последующее снижение уровня цАМФ в ооцитах. Показано участие клеток кумулюса в опосредовании стимулирующего влияния ПРЛ на цитоплазматическое созревание ооцитов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Основной конструктивной характеристикой работы является полученная информация, необходимая для понимания фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции про-лактином созревания фолликулов и ооцитов у крупного рогатого скота, которая может быть использована при оптимизации методов вспомогательных репродуктивных технологий. На основании полученных данных предложена и научно обоснована теоретическая модель, описывающая механизмы действия ПРЛ на мейоз ооцитов и функциональную активность клеток кумулюса. Модернизирована система созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов коров посредством предварительной синхронизации мейоза с помощью изобутилметилксантина и последующего одновременного введения в среду гонадотропных гормонов и ПРЛ, обусловливающая повышение качества цитоплазматического созревания ооцитов и эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота. Разработаны системы культивирования ооцит-кумулюсных комплексов в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ и соматотропина, позволяющие снижать частоту хромосомных нарушений при созревании ооцитов. Предложено использование ПРЛ для снятия блокады мейоза, вызванной пАМФ-повышающими реагентами.
Основные положения, выносимые на защиту.
Содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости коров зависит от фазы полового цикла, степени зрелости и атрезии фолликулов.
Компетентность клеток гранулезы к связыванию ПРЛ детерминируется уровнем цитодифференцировки и не зависит от репродуктивного статуса животных и воздействия соматотропина.
В ооцитах, клетках кумулюса и гранулезы коров присутствует мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ; экспрессия альтернативных изоформ носит тканеспецифический характер и регулируется гомологичным гормоном.
ПРЛ оказывает in vitro ростостимулирующее действие на клетки гранулезы,
которое определяется степенью зрелости фолликулов и модулируется сомато-
тропином и инсулином, а также тормозящее действие на деструктивные про
цессы в этих клетках.
У коров функционируют три автономных пути реализации влияния ПРЛ на ооцит: 1) прямой, 2) через сопряженные с ооцитом клетки кумулюса и 3) опосредованный клетками гранулезы.
Прямое и опосредованное кумулюсом влияние ПРЛ на ооциты достигается путем активации тирозинкиназ при базальном уровне внутриклеточного цАМФ.
цАМФ играет роль триггера специфического сигнального каскада, индуцируемого пролактином непосредственно в ооцитах, который вовлекает активацию фосфодиэстеразы 3 и последующее снижение уровня цАМФ, что приво-
дит к реинициации меиоза. Клетки кумулюса опосредуют стимулирующее влияние ПРЛ в присутствии
гонадотропных гормонов на компетенцию ооцитов к последующему эмбриональному развитию.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 23 международных научных конференциях: «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных» (С.-Петербург-Пушкин, 1994), «Селекционно-биотехнологические методы повышения генетического потенциала с.-х. животных» (Киев, 1994), «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 1995; 2000), 1-й центральной европейской конференции по репродукции животных и сателлитном симпозиуме (Олынтын, Польша; Думмерсторф, Германия, 1996), «Проблемы индивидуального развития с.-х. животных» (Киев, Украина, 1997), ежегодной конференции Международного Общества по трансплантации эмбрионов (Бостон, США, 1998; Сан Диего, США, 2009), 3-й конференции по эндокринологии сельскохозяйственных животных (Брюссель, Бельгия, 1998), ежегодной конференции Европейской Ассоциации Животноводства (Цюрих, Швейцария, 1999; Рим, Италия, 2003), 8-м и 11-м конгрессе по биотехнологии в репродукции животных (Бернбург, Германия, 2001; Велке Лосины, Чехия, 2004), 8-й Балтийской конференции по разведению и генетике животных (Каунас, Литва, 2002), ежегодной конференции Европейского Общества по репродукции домашних животных (Парма, Италия, 2002), «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005; 2009), «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дубровицы, 2007), «Проблемы повышения эффективности производства животноводческой продукции» (Жодино, Белоруссия, 2007), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (Дубровицы, 2008), «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных» (С.Петербург, 2008), «Актуальные проблемы ветеринарной биологии» (Москва, 2009), а также на 1-ом съезде общества генетиков и селекционеров России (Саратов, 1994), Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» и «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (С.-Петербург, 1999, 2009).
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, из них 18 - в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК («Биохимия», «Журнал эволюционной биохимии и физиологии», «Онтогенез», «Цитология», «Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова», «Сельскохозяйственная биология», «Theriogenology»).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 371 странице, содержит 43 таблицы, 51 рисунок и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических предложений и библиографического списка, включающего 575 цитируемых источников.
Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность своим научным консультантам профессору Голубеву А.К. и академику РАСХН Эрнсту Л.К. за неоценимую помощь и поддержку. Автор искренне признателен сотрудникам ГНУ ВНИИГРЖ профессору Кузьминой Т.И., Денисенко В.Ю., Кибардиной Т.В., Скот-ти О.С, сотрудникам ГНУ ВИЖ Волковой Н.А., Гладырь Е.А., Сингиной Г.Н., Та-радайник Т.Е., а также сотруднику БиНИИ СПбГУ Гойло Т.А. за помощь в проведении исследований. Особую благодарность автор выражает чл.-корр. РАСХН Зиновьевой Н.А. за всестороннюю поддержку и ценные советы.
